Фасадная система с воздушным зазором Вектор под керамогранит

НАВЕСНАЯ ФАСАДНАЯ СИСТЕМА «Вектор 1»

Керамогранитная / керамическая плитка

Система «Вектор 1» имеет пять конструктивных вариантов

Вектор 1. Тип 1.

Ключевые особенности:

• Подсистема вертикальная;
• Г-образный профиль;
• Крепление кронштейнов в стены.

Узловые ренения | Комплектующие | Альбом технических решений

Данный вариант является самым простым и экономичным, позволяющим существенно сократить стоимость м2 фасадной системы по сравнению с другими техническими решениями, без потери надёжности.

Основой подсистемы служат стальные Г-образные профили, располагаемые вертикально. Профили крепятся к несущим кронштейнам, которые, в свою очередь, крепятся к стенам здания с помощью фасадных анкеров. Конструкция кронштейнов допускает применение удлинителя, позволяющего скомпенсировать возможные неровности стен глубиной до 120 мм., при этом на одном объекте могут использоваться кронштейны как с удлинителем, так и без него. Облицовочный материал крепится к вертикальным профилям с помощью кляммеров из нержавеющей стали. Все элементы подсистемы соединяются между собой вытяжными заклепками A2/A2. Подсистема успешно применяется для облицовки наружных стен зданий, выполненных из бетона или других полнотелых оснований, обеспечивающих необходимые вырывающие усилия для анкерного крепежа.

Фасадная система «Вектор 1» под керамогранит наГ-образном профиле

 

Вектор 1. Тип 2.

Ключевые особенности:

• Подсистема Вектор 1;
• Профиль С-образный, Ω-образный;
• Крепление в стены

Этот тип вертикально ориентированной подсистемы с креплением несущих кронштейнов в стены и применением в качестве основных вертикальных направляющих С и Ω-образного профиля. Ввиду повышенных прочностных свойств вертикального С и Ω профиля по сравнению с Г-образным профилем шаг расстановки кронштейнов в 1200 мм сохраняется на больших высотных отметках, таким образом минимизируется средний расход фасадных элементов (кронштейнов, прокладок, фасадных анкеров, заклёпок) и оптимизируется бюджет объекта.

В качестве силового каркаса здания используются телескопические кронштейны (несущий кронштейн и удлинитель) с диапазоном регулировки вертикальных неровностей стены до 120 мм на каждом из типоразмеров кронштейнов (50-400 мм).Подсистема 2-го типа, облицованная керамогранитом, отличается высокими прочностными характеристиками (без ограничения по высотности и ветровым районам), позволяет при необходимости минимизировать вылет облицовочного материала от наружных стен с сохранением по технологии воздушного зазора.

Частным случаем данного конструктивного решения является применение П-образных кронштейнов с креплением С-образной направляющей в местах, где требуется обеспечить минимальный вынос от стены. Отличается наилучшими показателями стабильности и симметричности восприятия нагрузок.

 

Вектор 1. Тип 3.

• Подсистема Вектор 1;
• Профиль L-образный;
• Крепление в стены.

Вентилируемый керамогранит представляет собой вертикально-горизонтальный несущий конструктив, но в отличии от большинства так называемых перекрёстных систем имеет основной вариант крепления несущего кронштейна в «правильном» (на ребро установленном) положении, позволяющем наиболее полно и эффективно использовать опорное плечо и конструкцию кронштейна при его работе в составе фасадной системы (прежде всего восприятие весовых нагрузок).

Кронштейны крепятся к стенам с расчётным шагом по горизонтали, образуя несущие горизонтальные пояса. Крепление горизонтального L профиля производится на удлинитель кронштейна (позволяет производить регулировку неровностей стен до 120 мм). Вертикальные направляющие крепятся непосредственно к установленному горизонтальному профилю.Данный вид системы особенно удобен в тех случаях монтажа, когда требуется максимально быстро произвести монтаж вентфасада, закрыть тепловой контур здания в отсутствии рабочего проекта НВФ. Отсутствие необходимости устанавливать кронштейны строго по вертикали (согласно раскладки облицовочного материала) позволяет одновременно вести монтажные работы на объекте, проектировать вентилируемый фасад и согласовывать с Заказчиком раскладку.Облицовка фасада керамогранитом с помощью вентилируемого фасада возможна с увеличенным шагом расстановки кронштейнов по вертикали (свыше 1200 мм) и в ряде случаев может считаться достойной заменой системам с креплением исключительно в междуэтажные перекрытия.

 

В качестве облицовки основной плоскости фасада в данном варианте следует использовать керамогранитные плиты производства «PALAZZO Ceramics» (КНР), «LEONARDO 1502 Ceramica S.p.A» (Италия), «GRANITI FIANDRE S.p.A.» (Италия).

Навесная фасадная система с воздушным зазором «Вектор» под керамогранит может изготавливаться в двух вариантах:

• из оцинкованной стали;
• из нержавеющей стали.

Кляммеры и система могут быть окрашены в любой цвет согласно шкале RAL.

Примеры исполнения навесной фасадной системы с воздушным зазором «Вектор» под керммогранит

Навесная фасадная система на С-образном профиле с облицовкой из керамогранита

Навесная фасадная система на С-образном профиле с облицовкой из керамогранита

Навесная фасадная система на С-образном профиле с облицовкой из керамогранита

Навесная фасадная система на Т-образном профиле на выдвигающемся с облицовкой из керамогранита

Навесная фасадная система на Т-образном профиле на выдвигающемся с облицовкой из керамогранита

Навесная фасадная система на Т-образном профиле на выдвигающемся с облицовкой из керамогранита

На навесную фасадную систему под керамогранит имеется вся разрешительная документация.

Наши объекты с навесной фасадной системой с воздушным зазором «Вектор» св-т-кв-вс под керамогранит

---

 

 

Преобразователь частоты 1,5/2,2кВт 1х230В VECTOR-100 EKF

Главная >Низковольтное оборудование >Пускорегулирующая аппаратура >Частотный преобразователь (преобразователь частоты) >EKF >Преобразователь частоты 1,5/2,2кВт 1х230В VECTOR-100 EKF | VT100-1R5-1B (#535156)

Наименование	Наличие	Цена опт с НДС	Дата обновления	Добавить в корзину	Срок поставки
Преобразователь частоты 1. 5/2.2кВт 1х230В VECTOR-100 PROxima EKF VT100-1R5-1B	49	12 050.81 р.	13.10.2022		От 1 дня
Преобразователь частоты 1,5/2,2кВт 1х230В VECTOR-100 EKF | VT100-1R5-1B | EKF	Под заказ	12 050.81 р.	08.10.2022		От 30 дней
Преобразователь частоты 1.5/2.2кВт 1х230В VECTOR-100 — VT100-1R5-1B	Под заказ	12 050.81 р.	12.10.2022		От 30 дней
..» colspan=»6″>… … … … … … … … … …

Условия поставки преобразователя частоты 1,5/2,2кВт 1х230В VECTOR-100 EKF | VT100-1R5-1B

Купить преобразователи частоты 1,5/2,2кВт 1х230В VECTOR-100 EKF | VT100-1R5-1B могут физические и юридические лица, по безналичному и наличному расчету, отгрузка производится с пункта выдачи на следующий день после поступления оплаты.

Цена преобразователя частоты 1,5/2,2кВт 1х230В VECTOR-100 EKF | VT100-1R5-1B PROxima зависит от общей суммы заказа, на сайте указана оптовая цена.

Доставим преобразователя частоты 1,5/2,2кВт 1х230В VECTOR-100 EKF | VT100-1R5-1B на следующий день после оплаты, по Москве и в радиусе 200 км от МКАД, в другие регионы РФ отгружаем транспортными компаниями.

Похожие товары

Преобразователь частоты 0,4/0,75кВт 1х230В VECTOR-100 EKF PROxima | VT100-0R4-1B	43	10 400. 36 р.
Преобразователь частоты CONTROL-A310 220В, 1Ф 1,5 kW 7A | CNT-A310U13V015TEZ IEK (ИЭК)	52	15 698.54 р.
Преобразователь частоты ATV212 1.5кВт 240В IP21 SchE ATV212HU15M3X Schneider Electric	Под заказ	25 446.96 р.
Преобразователь частоты ПЧ-01H50 230В 1,5кВт | SQ0749-0002 TDM ELECTRIC	Под заказ	9 123. 65 р.
Преобразователь частоты 1,5/2,2кВт 3х400В VECTOR-100 EKF PROxima | VT100-1R5-3B	58	16 044.46 р.

Сопутствующие товары

Реле времени (для двигателей «звезда-треугольник») RT-SD EKF PROxima |	102	2 100.06 р.
Преобразователь частоты 1. 5кВт 1х230В VECTOR-80 Basic EKF VT80-1R5-1	Под заказ	11 566.45 р.

00-15 Система Вектор 1 дверь в проем

Категории

• Новинки и акции до -30% Новинки и акции до -30%
• Фурнитура для зеркал Фурнитура для зеркал
• Для витрин и мебели из стекла Для витрин и мебели из стекла
• Для душевых из стекла Для душевых из стекла
• Дистанционные держатели Дистанционные держатели
• Раздвижные системы Раздвижные системы
• Для маятниковых дверей Для маятниковых дверей
• Коннекторы для стекла Коннекторы для стекла
• Спайдеры и фурнитура для стеклянных козырьков Спайдеры и фурнитура для стеклянных козырьков
• Сопутствующие товары Сопутствующие товары
• Защитная плёнка Защитная плёнка
• Доводчики для дверей Доводчики для дверей
• Зажимные профили Зажимные профили
• Для межкомнатных дверей Для межкомнатных дверей
• Инструмент и материалы для обработки стекла Инструмент и материалы для обработки стекла
• Фурнитура для стеклянных ограждений Фурнитура для стеклянных ограждений
• Фурнитура для перил из нержавеющей стали Фурнитура для перил из нержавеющей стали
• Замки для стекла Замки для стекла
• Ручки для стеклянных дверей Ручки для стеклянных дверей
• Стекло и зеркало Стекло и зеркало
• Мебельная фурнитура Мебельная фурнитура
• Типовые варианты стеклоконструкций под заказ Типовые варианты стеклоконструкций под заказ
• Изделия из нержавеющей стали Изделия из нержавеющей стали
• Уцененные товары Уцененные товары

Ваше имя: *

E-mail: *

Вопрос: *

Менеджер: Алешин МаксимГайнулин ВиталийДубовик Татьяна АлександровнаЛитфуллина ИринаСим ЮлианнаСуслов МаксимШарафутдинова ЕленаШевалдина Наталья Валерьевна

E-mail (логин) *

Пароль *

E-mail*

Юридическое лицо

Физическое лицо

E-mail *

Пароль *

Имя *

Пароль еще раз *

Телефон *

Организация *

ИНН *

КПП

Расчетный счет *

Корресп. счет *

БИК *

Банк *

Юридический адрес *

Фактический адрес *

Плательщик НДС?

Сайт

Сфера деятельности

Город доставки *

Способ доставки * ТК Байкал Сервис (бесплатно до склада ТК вашего города при заказе от 15500 р)ТК Деловые линииТК ЭнергияВаша транспортная компания (от 600р. до склада ТК, в пределах Москвы)СамовывозДоставка по Москве (от 600р.)

ФИО *

№ и серия паспорта *

Кем и когда выдан паспорт *

Трансп. компания *

Адрес доставки *

Способ оплаты * Безналичный расчет

Настоящим подтверждаю, что я ознакомлен и согласен с условиями политики конфиденциальности

Регулятор заднего моста Vector One Billet Bagger

Артикул: ST-AX-05-A

В настоящее время: $527,00

ПРИМЕЧАНИЕ. Для этого продукта может потребоваться индивидуальная модификация некоторых выхлопных газов. См. вкладку «Установка» для более подробной информации.

0 отзывов

Регулятор одной оси Vector

Рейтинг Обязательно Выберите рейтинг1 звезда (худший)2 звезды3 звезды (средний)4 звезды5 звезд (лучший)

Имя Обязательно

Эл. адрес Обязательно

Тема отзыва Обязательно

Комментарии Обязательно

Изменить

Этот продукт совместим с вашим

2019 Harley-Davidson Road-Glide

Этот продукт не совместим с вашим

2019 Harley-Davidson Road-Glide

Описание продукта

Держите ремень или цепь натянутыми, а колесо выровненным с помощью нашего регулятора оси Vector One Billet Bagger. Функциональная проблема с маятником Stock Bagger заключается в регуляторах оси и оси. Стандартная установка предназначена для двигателей с ограниченным крутящим моментом. Стандартные регуляторы оси имеют тенденцию проскальзывать под нагрузкой; когда вы даете ему перец, ваша стандартная ось может проскальзывать, что приводит к ослаблению ремня и смещению заднего колеса. Развал-схождение колес является серьезной проблемой геометрии, мы видели, что лишь небольшое смещение колес создает колебания скорости и эффекты плохой управляемости. В регуляторе Kraus Vector One используется резьбовой фиксирующий механизм, который легко регулируется и обеспечивает идеальное выравнивание колес, независимо от того, какой крутящий момент вы прикладываете к нему.

---

Дополнительные функции

• Обязательный апгрейд для всех упаковщиков, особенно для мощных машин.
• Качество: Высококачественная никелированная ось из легированной стали 1144, устойчивая к нагрузкам, почти в 2 раза прочнее, чем ось из нержавеющей стали. Корпуса регуляторов и направляющие изготовлены из алюминиевого сплава. Гайки оси изготовлены из нержавеющей стали и закреплены с-образным зажимом.
• Простота выравнивания: вам не нужны плечики или стяжки для выравнивания колеса. Использование часовых меток и стопорного винтового механизма делает это простым и безопасным.

---

Установка

• ’09-Up FLHR, FLHT, FLHX и FLTR (ТУРИНГОВЫЕ МОДЕЛИ) — ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ ТРАЙКОВ
• Для этого продукта может потребоваться индивидуальная модификация некоторых выхлопных труб. Регулятор одной оси Vector может соприкасаться с некоторыми полноразмерными выхлопными системами. Мы рекомендуем иметь зазор не менее 1,5 дюйма от вашего маятника в положении оси до выхлопной трубы.

Загрузки

Руководство по установке продукта

Медиа-галерея

Установка Kraus Vector One

Рекомендуемые продукты

Статьи

1 сентября 2022 г.

Как развивалась американская сцена V-Twin за последнее десятилетие

Страсть к производительности. Американская сцена с V-образными твинами резко изменилась за последнее десятилетие. Ушли в прошлое экзотические комоды с большими колесами, которые были скорее эстетически привлекательными, чем управляемыми. Вместо этого новые инновации и запасные части, устанавливаемые на болтах, б…

Подробнее

22 августа 2022 г.

Каково наиболее эффективное повышение производительности начального уровня на современном V-Twin?

Вот почему эргономика — это все для водителя. Представьте, что вы строите самый крутой высокопроизводительный американский упаковщик с V-образным твином, какой только можно вообразить. Он оснащен коробочным двигателем с невероятной мощностью, первоклассными компонентами подвески и серьезным количеством…

Подробнее

Отзывы клиентов

0 отзывов Написать рецензию

Регулятор одной оси Vector

Рейтинг Обязательно Выберите Рейтинг1 звезда (худший)2 звезды3 звезды (средний)4 звезды5 звезд (лучший)

Имя Обязательно

Эл. адрес Обязательно

Тема отзыва Обязательно

Комментарии Требуется

Инновации в генной терапии вирусных векторов: раскрытие потенциала

Статья (11 страниц)

В прошлом году было выявлено успехов и неудач в области генной терапии вирусных векторов. Быстрая разработка и широкомасштабное внедрение нескольких вакцин на основе аденовирусных векторов представляет собой беспрецедентное достижение, которое должно помочь смягчить разрушительное воздействие COVID-19.пандемия. В тот же период несколько высококлассных активов в области генной терапии столкнулись с проблемами, а клинические испытания были приостановлены из-за проблем с безопасностью или из-за неспособности достичь целевых показателей эффективности.

Аудио

Прослушать эту статью

Эти успехи и неудачи символизируют нынешнее состояние генной терапии вирусных векторов: технологии со значительными перспективами, но впереди еще ряд проблем. По мере того, как все больше и больше методов генной терапии попадают в клинику, становится ясно, что необходимо преодолеть множество технологических проблем, чтобы раскрыть весь потенциал генной терапии вирусных векторов.

Готовясь к решению этих задач, биотехнологические и фармацевтические компании тестируют множество технологических достижений и инновационных стратегий, затрагивающих все аспекты разработки генной терапии вирусных векторов. Для компаний, готовых идти в ногу с быстрыми темпами изменений, эти инновации открывают путь к внедрению следующего поколения генной терапии вирусных векторов.

Компании тестируют множество технологических достижений и инновационных стратегий, затрагивающих все аспекты разработки генной терапии вирусных векторов.

Состояние генной терапии вирусных векторов

1. Чтобы замедлить отток, уделяйте больше внимания тому, что действительно нужно работникам.
2. Грядущая буря: возможность переупорядочить отрасль здравоохранения
3. Что-то грядет: как американские компании могут повысить устойчивость, пережить спад и процветать в следующем цикле
4. Ускорение перехода к нулевому путешествию
5. Этика данных: что это значит и что для этого нужно

Генная терапия вирусными векторами использует модифицированные вирусы в качестве средств доставки лекарств для введения в клетки специфических последовательностей ДНК, кодирующих гены, регуляторные РНК (например, малые интерферирующие РНК [миРНК]) или другие терапевтические субстраты. Эта технология уже давно вызывает интерес из-за ее потенциальных преимуществ по сравнению с традиционными методами. Многие типы терапевтических агентов (например, ферменты, антитела и миРНК) могут быть закодированы последовательностями ДНК, которые можно быстро разработать и синтезировать после идентификации мишени.

Вирусы

служат мощным средством доставки этих последовательностей из-за их способности эффективно проникать в клетки и потенциально получать доступ к труднодоступным высокоспецифическим клеткам. Сочетая эти функции, вирусно-векторная генная терапия может использоваться для изменения экспрессии генов программируемым образом, предлагая гибкость для потенциального лечения широкого спектра заболеваний, включая редкие моногенные заболевания путем замены генов и заболевания широких популяций путем контроля экспрессии генов. — и способствовать профилактике заболеваний путем иммунизации.

Почти во всех доступных в настоящее время генных терапиях используется один из трех типов векторов: векторы аденоассоциированного вируса (AAV), векторы аденовируса или векторы лентивируса (Иллюстрация 1). Векторы AAV и аденовируса обычно используются в генной терапии, которая вводится непосредственно пациентам путем инфузии или местного введения ( in vivo ), при этом AAV является наиболее популярным вектором для областей, не связанных с онкологией и вакцинами. Лентивирусные векторы обычно используются для лечения ex vivo , при котором клетки, собранные у пациента, модифицируют в лаборатории перед ретрансплантацией. В этой статье основное внимание уделяется in vivo генная терапия; однако многие из обсуждаемых проблем и достижений применимы к обоим путям администрирования.

Экспонат 1

Мы стремимся предоставить людям с ограниченными возможностями равный доступ к нашему веб-сайту. Если вам нужна информация об этом контенте, мы будем рады работать с вами. Пожалуйста, напишите нам по адресу: [email protected]

Волнение вокруг генной терапии вирусных векторов очевидно. Пока только четыре in vivo В настоящее время на рынке представлено генных терапий вирусных векторов, по состоянию на конец 2020 года более 100 активов генной терапии проходят клинические испытания, причем гораздо большее количество находится в доклинической разработке.

Многие из этих активов возникли из постоянного потока малых и средних биотехнологических компаний и академических лабораторий, поддерживаемых постоянным высоким уровнем венчурного финансирования. Крупные фармацевтические компании все больше внимания уделяют потенциалу вирусных векторов: только за последние два года было приобретено семь биотехнологических компаний на сумму около 1 миллиарда долларов или выше (Иллюстрация 2). ¹ 1. «Астеллас заключает окончательное соглашение о приобретении Audentes Therapeutics», Astellas Pharma, 3 декабря 2019 г., astellas.com; «Bayer приобретает Asklepios BioPharmaceutical для расширения инновационной базы в области клеточной и генной терапии», Bayer, 26 октября 2020 г., media.bayer.com; «Biogen объявляет о соглашении о приобретении Nightstar Therapeutics для создания клинической линейки кандидатов на генную терапию в офтальмологии», Biogen, 4 марта 2019 г.,investors.biogen.com; «Lilly объявляет о соглашении о приобретении Prevail Therapeutics», Eli Lilly, 15 декабря 2020 г., Investor.lilly.com; «Novartis заключает соглашение о приобретении AveXis Inc. за 817 млрд долларов США, чтобы преобразовать уход за пациентами со СМА и расширить свои позиции в качестве лидера в области генной терапии и неврологии», Novartis, 9 апреля 2018 г. , novartis.com; «PTC Therapeutics приобретает Agilis Biotherapys», PTC Therapeutics, 19 июля 2018 г., ir.ptcbio.com; «Рош заключает окончательное соглашение о слиянии с целью приобретения Spark Therapeutics», Ф. Хоффманн-Ла Рош, 25 февраля 2019 г., roche.com. Аденовирусы зарекомендовали себя в качестве основы для создания вакцин: за последний год были одобрены вакцины против лихорадки Эбола и новаторские вакцины против COVID-19. ² 2. «Первая одобренная FDA вакцина для профилактики болезни, вызванной вирусом Эбола, знаменует собой важную веху в обеспечении готовности и ответных мер общественного здравоохранения», Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, 19 декабря., 2019 г., fda.gov.

Экспонат 2

Мы стремимся предоставить людям с ограниченными возможностями равный доступ к нашему веб-сайту. Если вам нужна информация об этом контенте, мы будем рады работать с вами. Пожалуйста, напишите нам по адресу: [email protected]

В то время как высокая прейскурантная цена некоторых генных терапий когда-то рассматривалась как почти непреодолимая проблема для коммерциализации, инновационные стратегии возмещения расходов показали, что возможны успешные запуски ZOLGENSMA (лечение более 600 детей со спинальной мышечной атрофией). ³ 3. «Данные Zolgensma, включающие пациентов с более тяжелой СМА на исходном уровне, дополнительно демонстрируют терапевтический эффект, в том числе увеличение продолжительности бессобытийной выживаемости, улучшение двигательной функции и достижение вех», Novartis, 1 октября 2020 г., novartis.com. за первые десять месяцев на рынке), превзойдя ожидания аналитиков. ⁴ 4. Ангус Лю, «10 лучших лекарств, выпущенных на рынок с 2017 года», Fierce Pharma, 18 мая 2020 г., Fiercepharma.com. Прогнозируется, что мировые продажи генной терапии вирусных векторов будут расти более чем на 50 процентов в годовом исчислении в течение следующих пяти лет (исключая потенциальное воздействие вакцин против COVID-19), что повлияет на жизнь десятков тысяч людей. пациенты.

Однако, несмотря на значительный импульс, в последнее время также было несколько неудач. ⁵ 5. Мадлен Армстронг, «Задержка «Вояджера» усугубляет проблемы с генной терапией», Evaluate Vantage, 23 декабря 2020 г., Assessment.com. Многие из них связаны с проблемами, ранее обозначенными McKinsey в ее взглядах на будущее генной терапии (включая эффективность, долговечность и производство). По мере того, как эти методы лечения стремились выйти за рамки ультраредких показаний, на которые они изначально были нацелены, три технологические проблемы стали постоянными препятствиями. Чтобы генная терапия вирусных векторов достигла своего истинного трансформационного потенциала — во многом подобно технологии моноклональных антител 20 лет назад — необходимо преодолеть этот набор технологических проблем.

Проблемы реализации потенциала генной терапии вирусных векторов

Нынешнее поколение генной терапии вирусных векторов представляет собой кульминацию десятилетий биологических и клинических исследований. По мере того, как все больше пациентов получали эти методы лечения, стало ясно, что применение вирусных векторов будет ограничено тремя фундаментальными проблемами: преодоление иммунной системы, снижение дозы и контроль экспрессии трансгена. Текущая работа по решению этих проблем приводит к созданию технологических инноваций, которые могут обойти существующие методы лечения и раскрыть потенциал вирусных векторов.

Преодолеть иммунную систему

Успех любой генной терапии вирусного вектора зависит от его способности преодолевать многочисленные линии защиты, развернутые иммунной системой человека. Вирусные капсиды, ДНК вирусных векторов и даже сами трансгенные продукты могут быть признаны чужеродными, что дает иммунной системе множество возможностей очистить организм от генной терапии.

Иммунитет против вирусных капсидов может ограничить эффективность генной терапии. Поскольку в настоящее время в большинстве методов генной терапии вирусных векторов используются векторы, полученные из безвредных вирусов, циркулирующих в организме человека, многие пациенты (до 60 процентов) могут иметь ранее существовавший иммунитет от прошлого воздействия. ⁶ 6. Оумейя Аджали, Федерико Мингоцци и Селин Вандамм, «Распутывая сложную историю иммунных реакций на испытания векторов AAV за испытанием», Human Gene Therapy , ноябрь 2017 г. , том 28, номер 11, стр. 1061–74, liebertpub.com . CanSinoBIO, например, сообщила о снижении эффективности своего препарата против COVID-19.вакцины у лиц с ранее существовавшими антителами к вектору аденовируса-5 (Ad5), выбранному для доставки лекарств. ⁷ 7. Feng-Cai Zhu et al., «Иммуногенность и безопасность рекомбинантной вакцины против COVID-19 с вектором аденовируса типа 5 у здоровых взрослых в возрасте 18 лет и старше: рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование фазы 2». Ланцет , август 2020 г., том 396, номер 10 249, стр. 479–88, thelancet.com.

Хотя этот эффект зависит от используемого серотипа переносчика, а клиническое воздействие до сих пор неясно, ⁸ 8. Анна Майович и др. , «Терапевтическая активность hFIX, достигнутая после однократного лечения AAV5-hFIX у пациентов с гемофилией B и NHP с ранее существовавшими NAB против AAV5», Методы молекулярной терапии и клиническая разработка , сентябрь 2019 г., том 14, стр. 27–36, cell.com. многие спонсоры клинических испытаний консервативно исключают пациентов из своих исследований, если у них есть антитела к рассматриваемому вектору. Это может произойти за счет того, что большинство пациентов не имеют права на терапию. Приобретенный иммунитет к вирусным векторам создает дополнительные проблемы для генной терапии вирусных векторов в долгосрочной перспективе. Пациенты, получающие генную терапию сегодня, могут быть не в состоянии получить вторую генную терапию в будущем, если один и тот же вирусный вектор используется в обоих контекстах.

Кроме того, вирусные капсиды и ДНК вирусного вектора могут активно провоцировать иммунный ответ организма. Для вирусных векторных вакцин эта иммуногенность может быть полезной, поскольку она снижает потребность в адъювантах и ​​повышает эффективность. Однако для других генных терапий вирусных векторов иммуногенность может снизить эффективность, увеличивая вероятность того, что генная терапия будет обнаружена и устранена иммунной системой. Действительно, некоторые предполагают, что последовательности ДНК иммуногенных векторов являются причиной ограниченной долговечности некоторых недавних генных терапий, что привело к отказу от них. ⁹ 9. Барбара Конкл и др., «Результаты клинических испытаний генной терапии гемофилии B BAX 335: потенциальное влияние последовательностей CpG на экспрессию генов», Blood , февраль 2021 г., том 137, номер 6, стр. 763–74, ashpublications.org. Что еще более важно, иммуногенность может привести к проблемам безопасности во время терапевтического использования, поскольку высокие уровни вирусных капсидов могут вызывать серьезные иммунные реакции во время инъекции. 14 векторных геномов [vg] на килограмм [кг], при условии, что ребенок весит 30 кг), ¹⁰ 10. «Pfizer представляет первоначальные клинические данные исследования генной терапии фазы 1B для лечения мышечной дистрофии Дюшенна (МДД)», Pfizer, 28 июня 2019 г., pfizer.com. что в несколько раз превышает количество клеток в организме человека. ¹¹ 11. Шай Фукс, Рон Майло и Рон Сендер, «Пересмотренные оценки количества клеток бактерий человека в организме», PLOS Biology , август 2016 г., том 14, номер 8, journals.plos.org. При системных заболеваниях необходимость индивидуально воздействовать на многие клетки организма и восстанавливать их частично объясняет, почему вводятся такие большие дозы. Другим объяснением является ограниченная специфичность современных вирусных векторов к типу клеток: необходимо доставить большое количество вирусных частиц, чтобы гарантировать, что адекватное количество достигнет клинически значимых клеток. 917 vg за партию). ¹² 12. Джейкоб Плит, «Компании, занимающиеся генной терапией, стоимостью 100 000 долларов, лучше бы не упоминали», Evaluate Vantage, 25 июня 2018 г., Assessment.com; «Ultragenyx представит корпоративную новость на Дне аналитика и инвестора 17 апреля в Нью-Йорке», Ultragenyx Pharmaceutical, 11 апреля 2019 г., ir.ultragenyx.com. Хотя эти затраты будут постепенно уменьшаться по мере того, как генная терапия начнет достигать клинических и коммерческих масштабов, любой технологический прогресс, который снижает требуемую дозу, принесет немедленную выгоду, поскольку десятикратное снижение дозы может также привести к десятикратному снижению затрат.

Во-вторых, и это еще более важно, введение больших доз вируса было связано с неблагоприятными последствиями для безопасности. ¹³ 13. Арун Шривастава, «Векторы AAV: безопасны ли они?» Human Gene Therapy , июль 2020 г. , том 31, номера 13–14, стр. 697–99, liebertpub.com. Хотя в 2020 году в клинических испытаниях векторной терапии AAV продолжаются расследования четырех случаев смерти, три случая смерти произошли в когортах, получавших высокие дозы. Впоследствии протоколы клинических испытаний были пересмотрены, чтобы ограничить дозу вируса, что отражает огромную важность этого вопроса. ¹⁴ 14. Ник Пол Тейлор, «FDA снимает клинический запрет на испытание генной терапии Solid Bio», Fierce Biotech, 2 октября 2020 г., Fiercebiotech.com.

Контроль экспрессии трансгена

Как только вирусный вектор успешно доставляет свой терапевтический ген в рассматриваемые клетки, эффективность генной терапии зависит от качества экспрессии трансгена. В частности, трансген должен экспрессироваться на соответствующем уровне (не слишком низком и не слишком высоком) в соответствующих клетках и в течение соответствующей продолжительности, чтобы опосредовать желаемый клинический эффект. Для терапевтического применения (в отличие от использования для вакцин) может потребоваться постоянная экспрессия трансгена, если генная терапия должна служить одноразовым лекарством и представлять собой привлекательную альтернативу для пациентов по сравнению с существующими стандартами лечения, требующими повторного дозирования (что может оказаться невозможным из-за ранее изложенных проблем). Регуляторным органам потребовались данные многолетнего наблюдения, показывающие, что экспрессия генов сохраняется. Действительно, после 12 месяцев от некоторых лекарств отказывались.

Чтобы максимизировать шансы на успех, ранние генные терапии вирусных векторов решили включать регуляторные элементы (последовательности ДНК, такие как промоторы и энхансеры, которые контролируют экспрессию генов), которые были отобраны для обеспечения высоких уровней экспрессии трансгенов во всех типах клеток. Однако этот подход может иметь существенные недостатки, особенно в связи с тем, что генная терапия выходит за рамки замены генов для моногенных редких заболеваний. Сверхэкспрессия трансгена или его экспрессия не в тех клетках может способствовать воспалению и другим токсическим эффектам (как это наблюдалось в недавних исследованиях приматов, кроме человека). ¹⁵ 15. Juliette Hordeaux et al., «МикроРНК-опосредованное ингибирование экспрессии трансгена снижает токсичность спинномозговых ганглиев векторами AAV у приматов», Science Translational Medicine , ноябрь 2020 г., том 12, номер 569, stm.sciencemag.org. Более того, нынешние методы генной терапии, однажды введенные, не могут контролироваться или отключаться клиницистами, если в этом когда-либо возникнет необходимость.

Инновационные решения, позволяющие решать задачи генной терапии с разных точек зрения

Чтобы решить проблемы, стоящие перед генной терапией, академические лаборатории, стартапы и авторитетные компании создают множество инновационных решений (Иллюстрация 3). Каждый фокусируется на конкретном компоненте продукта генной терапии (например, вирусном капсиде) или на части процесса разработки (например, на производстве). Однако эти инновации часто решают несколько основных проблем, намечая несколько путей к реализации перспектив генной терапии вирусных векторов.

Экспонат 3

Мы стремимся предоставить людям с ограниченными возможностями равный доступ к нашему веб-сайту. Если вам нужна информация об этом контенте, мы будем рады работать с вами. Пожалуйста, напишите нам по адресу: [email protected]

Мы определили пять ключевых тенденций, за которыми стоит следить.

1. Улучшенные капсиды

Вирусный капсид является важным компонентом генной терапии вирусного вектора. Он определяет, какие клетки являются мишенями, эффективность проникновения в клетку и вероятность того, что генная терапия будет обнаружена и устранена иммунной системой. Кроме того, капсид в значительной степени отвечает за стабильность вирусного вектора в процессе производства и может влиять на требования к хранению и распространению. ¹⁶ 16. Хотя капсиды лентивирусов дополнительно окружены липидно-мембранной оболочкой, гликопротеины в этой оболочке выполняют многие из тех же функций, что и капсиды AAV и аденовирусов.

Наиболее широко используемые сегодня капсиды, в том числе те, которые используются в продуктах, имеющихся на рынке, получают из встречающихся в природе вирусов. Они обладают субоптимальными свойствами, в том числе малой специфичностью к типу клеток, умеренной эффективностью проникновения в клетку и относительно высоким уровнем существовавшего ранее иммунитета у людей. Чтобы решить проблему ранее существовавшего иммунитета, многие активы используют капсиды вирусов, обнаруженных у других видов. Например, капсиды AAV8 и AAVrh74, используемые в генной терапии с несколькими векторами AAV, получены из серотипов AAV, выделенных из макак, а некоторые из вирусов COVID-19в разработанных вакцинах использовались серотипы аденовирусов шимпанзе и горилл. Хотя этот подход может ограничить проблемы существовавшего ранее иммунитета, он в значительной степени не учитывает специфичность или эффективность (особенно с учетом того, что эти вирусы эволюционировали, чтобы заражать нечеловеческие виды).

Разработчики лекарств все чаще обращаются к капсидам, которые были созданы в лаборатории и могут быть выбраны для преодоления проблем, упомянутых ранее (Иллюстрация 4). Эти сконструированные капсиды идентифицируются с помощью крупномасштабных усилий по скринингу, в ходе которых миллионы вариантов капсидов проверяются на желаемые свойства и итеративно уточняются. Платформы для разработки капсидов, многие из которых были выделены из академических лабораторий для создания компаний, достигают этих целей за счет использования передовых технологий, таких как криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) и искусственный интеллект.

Экспонат 4

Мы стремимся предоставить людям с ограниченными возможностями равный доступ к нашему веб-сайту. Если вам нужна информация об этом контенте, мы будем рады работать с вами. Пожалуйста, напишите нам по адресу: [email protected]

Улучшение свойств капсида может принести сразу несколько преимуществ. Например, двукратное увеличение специфичности капсида к типу клеток может позволить вдвое снизить общую требуемую дозу вируса, тем самым повысив безопасность и стоимость. Еще слишком рано определять истинное влияние инженерии капсидов, поскольку большинство инженерных капсидов все еще находятся в доклинической разработке. Тем не менее, ранние отчеты компаний предполагают, что капсиды с пяти-десятикратным улучшением многих характеристик могут скоро попасть в клинику.

2. Улучшенные векторы

Как и капсид, последовательность ДНК самого вирусного вектора влияет на многие аспекты эффективности генной терапии, но разработка вектора часто может быть значительно проще, дешевле и быстрее. Соответственно, векторная инженерия становится все более важным направлением исследований и разработок в области генной терапии. Разработка векторов часто проще с аденовирусными и лентивирусными векторами, чем с векторами AAV, из-за неспособности AAV упаковывать большие фрагменты ДНК. Однако инновационные векторные элементы начинают появляться и в векторных схемах AAV.

Разработка векторов в целом преследует две цели: снижение иммуногенности вирусного вектора и улучшение экспрессии трансгена. Одной стратегией для достижения обеих целей является оптимизация кодонов, при которой исследуются вариации в последовательности вектора для устранения мотивов иммуногенной последовательности при оптимизации трансгена для надежной экспрессии. Тонкие изменения в последовательности вектора, достигнутые за счет оптимизации кодонов, могут иметь большие эффекты, такие как повышение уровня экспрессии и, возможно, увеличение продолжительности экспрессии на несколько лет. ¹⁷ 17. Дж. Фрейзер Райт, «Модификация кодонов и PAMP в клинических векторах AAV: черепаха или заяц?», Molecular Therapy , март 2020 г. , том 28, номер 3, стр. 701–3, cell.com.

Разработка векторов в целом преследует две цели: снижение иммуногенности вирусного вектора и улучшение экспрессии трансгена.

Экспрессия трансгена может быть дополнительно запрограммирована путем инженерии регуляторных элементов в векторной последовательности. Некоторые регуляторные элементы включают экспрессию трансгена только в определенных типах клеток или тканях — в идеале, в клетках, вызывающих заболевание, — предотвращая потенциально токсическую экспрессию в других контекстах. Такие специфичные для типа клетки или ткани регуляторные элементы (например, промоторы и энхансеры) стали относительно обычными в генной терапии вирусных векторов. Для дополнительного уровня контроля некоторые генные терапии вирусных векторов также включают регуляторные элементы, такие как сайты-мишени микроРНК, которые снижают экспрессию в определенных клетках, например, в клетках, которые стимулируют иммунный ответ.

Наконец, более отдаленной и сложной задачей является создание индуцируемых векторов, в которых экспрессию трансгена можно контролировать с помощью дополнительного сигнала, такого как перорально вводимое низкомолекулярное лекарство. Это может позволить клиницистам включать, выключать или иным образом корректировать генную терапию после ее введения, обеспечивая индивидуальный курс лечения.

3. Новые виды грузов

Груз, доставляемый с помощью генной терапии вирусного вектора, обычно представляет собой рабочую копию гена, которая используется для замены вызывающей заболевание копии того же гена у пациента. Однако любой терапевтический агент, который может быть закодирован в ДНК, теоретически может быть доставлен с помощью вирусного вектора. Исследователи и разработчики лекарств все чаще используют эту гибкость для доставки других типов молекул с терапевтической ценностью — по отдельности или иногда в комбинации — включая регуляторные РНК (например, короткие шпилечные РНК [shRNAs]), векторизованные антитела и субстраты для редактирования генов.

Генетическое редактирование — интригующее потенциальное решение для достижения длительной, физиологически приемлемой экспрессии генов. Для пациентов с заболеваниями, вызванными определенными типами мутаций, восстановление функции и экспрессии собственной копии гена пациента посредством редактирования гена может быть проще (и более устойчивым), чем попытки сконструировать и доставить замену.

4. Усовершенствованные производственные процессы

Ранние процессы производства генной терапии зародились в академических лабораториях и были ориентированы на небольшие исследовательские партии. Эти процессы не были оптимизированы для средне- или крупномасштабного производства или для системной терапии. По мере того, как генная терапия начинает выходить за рамки лечения крайне редких заболеваний, одной из многих проблем, которые необходимо решить, является наличие пустых капсидов, образующихся в процессе производства. Эти пустые капсиды, не содержащие активного груза, могут создавать потребность в более высоких дозах и, соответственно, стимулировать более сильный иммунный ответ.

Разрабатываются два подхода к снижению соотношения пустых и полных капсидов при производстве: разработка усовершенствованных методов отделения пустых капсидов от полных на основе конкретных свойств (например, заряда и молекулярной массы) и разработка клеточных линий, которые упаковывают полные капсиды. капсиды более эффективно. За счет снижения отношения пустого к полному эти достижения снижают производственные затраты, снижают иммунный ответ и повышают безопасность генной терапии. Действительно, регулирующие органы использовали снижение соотношения пустых и полных капсидов как часть обоснования отмены клинических запретов на продукты генной терапии с предыдущими проблемами безопасности. ¹⁸ 18. «FDA отменяет клиническое удержание», октябрь 2020 г.

5. Усовершенствованные схемы предварительной обработки и кондиционирования

Помимо разработки капсида и вектора, отдельный подход к уменьшению обнаружения иммунной системой генной терапии вирусного вектора включает совместное введение терапии с иммунодепрессантом. В настоящее время тестируются несколько таких схем кондиционирования, чтобы уменьшить влияние нейтрализующих антител на эффективность лечения, как ранее существовавших антител, так и вновь созданных антител, которые могли бы предотвратить повторное введение дозы в будущем. Почти во всех современных генных терапиях вирусных векторов используются стероиды, чтобы помочь управлять потенциальным иммунным ответом на вирусный вектор; однако тип, дозировка и сроки лечения стероидами сильно различаются.

В некоторых клинических испытаниях проводятся эксперименты с более целенаправленным подавлением иммунитета, например, с использованием ритуксимаба для уменьшения образования В-клеток памяти. ¹⁹ 19. Мануэла Корти и др., «Безопасность внутридиафрагмальной доставки генной терапии альфа-глюкозидазой, опосредованной аденоассоциированным вирусом (rAAV1-CMV- hGAA ), у детей, страдающих болезнью Помпе», Human Gene Therapy Clinical Development , декабрь 2017 г. , том 28, номер 4, стр. 208–18, liebertpub.com. Еще больший набор подходов тестируется на животных моделях для прямого снижения присутствия нейтрализующих антител. К ним относятся использование ферментов, расщепляющих иммуноглобулин G (IgG), плазмаферез для удаления нейтрализующих антител, специфичных для генной терапии, и даже подавление образования нейтрализующих антител на основе CRISPR. ²⁰ 20. Эмма Ясински, «Предотвращение нейтрализации AAV антителами может улучшить генную терапию», Scientist , 25 сентября 2020 г., the-scientist.com. Эти подходы могут расширить пул подходящих пациентов, включив в него пациентов с ранее существовавшим иммунитетом. Кроме того, эти подходы могут позволить пациенту получать несколько доз одного и того же препарата или разных видов лечения с использованием одной и той же векторной основы.

Дорога впереди

Генная терапия вирусных векторов находится в другом переломном моменте. Ранние успехи в лечении редких заболеваний и вакцинах доказали потенциал этого метода, в то время как проблемы, связанные с широким распространением — как это было с моноклональными антителами за последние 20 лет — стали еще более очевидными. Тем не менее, множество инновационных решений, изучаемых академическими, биотехнологическими, фармацевтическими и контрактными организациями по разработке и производству, показывают, что генная терапия вирусных векторов никуда не денется.

Как было сказано ранее, для решения каждой из основных проблем появляются различные решения. Разнообразие этих подходов и сложность генной терапии означают, что ни один из подходов вряд ли «победит». Такая ситуация обеспечит быстрый инновационный цикл, в ходе которого генная терапия будет постоянно улучшаться, что откроет новые возможности для перепрыгивания существующих продуктов. Несмотря на то, что доставка на основе векторов AAV становится ведущей технологией, некоторые заметные ограничения в сочетании с быстрым темпом инноваций оставляют дверь открытой для появления других технологий доставки.

Владельцам платформ вирусного вектора необходимо будет постоянно искать следующий набор инноваций, выходящий за рамки их текущих платформ и активов. Это может включать в себя прямые инвестиции, чтобы помочь преодолеть более широкие проблемы, или покупку или лицензирование критически важных технологий для обновления своих платформ. Действительно, несколько новых биотехнологических компаний начали работу для решения одной или нескольких задач, изложенных в этой статье, в качестве услуги разработчикам генной терапии. Чтобы быть в курсе этих событий, потребуется тщательный мониторинг научно-технического прогресса на всех фронтах. Однако, поскольку на этом раннем этапе сложно делать ставки на все потенциальные решения и новаторов, лидерам генной терапии необходимо разумно вкладывать свои средства.

В краткосрочной и среднесрочной перспективе — хотя технологические проблемы ограничивают возможности генной терапии лечебными методами лечения редких заболеваний — быстрым последователям может быть трудно добиться успеха, даже с улучшенными технологиями, поскольку первые участники быстро обращаются к преобладающим популяциям. Таким образом, лидеры в области генной терапии должны будут найти правильный баланс, ускорив программы сегодня, сохраняя при этом гибкость для внедрения инновационных технологий, которые открывают возможности для лечения заболеваний более широких групп населения и полные перспективы генной терапии вирусных векторов в долгосрочной перспективе.

Разработка комплексной лентивирусной векторной системы на основе оригинального TetR для простого создания клеточных линий Tet-ON

. 2011;6(8):e23734.

doi: 10.1371/journal.pone.0023734. Epub 2011 18 августа.

Карим Бенабделла ¹ , Мариен Кобо, Пилар Муньос, Мигель Дж. Тоскано, Франсиско Мартин

принадлежность

• ¹ Андалузский банк стволовых клеток, Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Granada, Parque Tecnológico Ciencias de la Salud, Гранада, Испания.

• PMID: 21876765
• PMCID: PMC3158098
• DOI: 10.1371/journal.pone.0023734

Бесплатная статья ЧВК

Карим Бенабделла и др. ПЛОС Один. 2011.

Бесплатная статья ЧВК

. 2011;6(8):e23734.

doi: 10.1371/journal.pone.0023734. Epub 2011 18 августа.

Авторы

Карим Бенабделла ¹ , Мариен Кобо, Пилар Муньос, Мигель Дж. Тоскано, Франсиско Мартин

принадлежность

• ¹ Андалузский банк стволовых клеток, Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Granada, Parque Tecnológico Ciencias de la Salud, Гранада, Испания.

• PMID: 21876765
• PMCID: PMC3158098
• DOI: 10.1371/journal.pone.0023734

Абстрактный

Лентивирусные векторы (LV) считаются одним из наиболее перспективных средств для эффективной доставки генетической информации для фундаментальных исследований и подходов к генной терапии. Сочетание LV с системами экспрессии, индуцируемыми лекарственными препаратами, должно обеспечить жесткий контроль экспрессии трансгена с минимальным побочным эффектом на соответствующие клетки-мишени. Новая регулируемая доксициклином система, основанная на оригинальном репрессоре TetR, была разработана в 1919 г.98 в качестве альтернативы химерам TetR-VP16 (tTA и rtTA), чтобы избежать побочных эффектов, связанных с экспрессией трансактиваторных доменов. Однако ранее описанные системы на основе TetR требовали клеточного клонирования и/или отбора антибиотиков чувствительных к тетрациклину клеток для достижения хорошей регуляции. В настоящей рукописи мы сконструировали двойную систему Tet-ON на основе двух лентивирусных векторов, один из которых экспрессирует TetR через промотор вируса, формирующего фокус селезенки (SFFV) (STetR), а второй экспрессирует eGFP через регулируемый промотор CMV-TetO (CTetOE). ). Используя эти векторы, мы продемонстрировали, что репрессор TetR, в отличие от обратного трансактиватора (rtTA), может экспрессироваться в избытке, чтобы связывать и модулировать большое количество оперонов TetO. Мы также показали, что эта двойная векторная система может генерировать регулируемые объемные клеточные линии (экспрессирующие высокие уровни TetR), которые способны модулировать экспрессию трансгена либо путем изменения концентрации доксициклина, либо путем изменения количества векторных геномов CTetOE на клетку. Основываясь на этих результатах, мы разработали новый комплексный лентивирусный вектор (CEST), управляющий экспрессией TetR через промотор SFFV и экспрессией eGFP через чувствительный к доксициклину оперон CMV-TetO. Этот вектор эффективно продуцировал регулируемый иммортализованный Tet-ON (293Т) и первичные (мезенхимальные стволовые клетки человека и первичные фибробласты человека) клетки. Массовые чувствительные к доксициклину клеточные линии экспрессируют высокие уровни трансгена с низким количеством доксициклина и фенотипически неотличимы от родительских клеток.

Заявление о конфликте интересов

Конкурирующие интересы: Авторы подали заявку на получение европейского патента на разработку высокоиндуцируемой векторной системы Tet-ON: Номер европейской заявки: EP11166754.9, Заявитель: Fundación Progreso y Salud, Дата получения: 19 мая 2011 г. Эта патентная заявка не меняет приверженности авторов всем политикам Plos ONE в отношении обмена данными и материалами. Поэтому все материалы, представленные в рукописи, будут находиться в свободном доступе для научного сообщества, но не в коммерческих целях.

Цифры

Рисунок 1. Двухвекторная система на базе TetR для…

Рисунок 1. Двухвекторная система на основе TetR для эффективного получения чувствительных к дозе клеточных линий Tet-On.

А )…

Рисунок 1. Двухвекторная система на основе TetR для эффективного получения чувствительных к дозе клеточных линий Tet-On.

A ) Карты двух лентивирусных векторов, необходимых для доксициклин-зависимой регуляции трансгена. 9Репрессор 0431 TetR экспрессируется через конститутивный промотор SFFV, высокоактивный в большинстве типов клеток, включая гемопоэтические клетки. Второй лентивирусный вектор содержит чувствительный к доксициклину промотор CMV-TetO (Yao et al. 1998), управляющий экспрессией eGFP . 293T, первичные фибробласты человека (HFF) и клетки K562 котрансдуцировали лентивирусными векторами STetR и CTetOE с высокой множественностью заражения и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии (B) или проточной цитометрии (C) в отсутствие (–Dox) или в присутствии (+Dox) 10 нг/мл доксициклина. D) Чувствительность к доксициклину (0,001 мкг/мл, 0,01 мкг/мл и 0,1 мкг/мл, как указано) клеточной линии Tet-ON HFF, полученной котрансдукцией с STetR и CTetOE LV.

Рисунок 2. Уровень индукции GFP с использованием двоичного кода…

Рисунок 2. Уровень индукции GFP с использованием бинарных лентивирусных векторов.

A ) Клетки 293T были стабильно…

Рисунок 2. Уровень индукции GFP с использованием бинарных лентивирусных векторов.

A ) Клетки 293T стабильно трансдуцировали увеличивающимся количеством лентивирусного вектора STetR. Были созданы различные экспрессирующие TetR 293 линии Т-клеток, каждая из которых содержала в среднем 0,2, 0,8, 2, 4 и 9 векторных геномов на клетку (v.g.c.) (указано в верхней части рисунка A). Каждый из этих TetR , экспрессирующие 293 линии Т-клеток, которые позже трансдуцировали увеличивающимся количеством векторов CTetOE (в среднем 0,5, 3, 6 и 10 v.g.c.) (указано слева на рисунке A). Графики показывают экспрессию eGFP различных клеточных линий в отсутствие (-Dox) или в присутствии (+Dox) 1 мкг доксициклина. Б) . График, показывающий увеличение кратности индукции трансдуцированных 293 Т-клеток после добавления 100 нг/мл доксициклина. Самые высокие уровни индукции достигаются, когда клетки содержат несколько копий как StetR (7-9v.g.c.) и векторы CTetOE (6–10 v.g.c.).

Рисунок 3. Простое создание высокочувствительного…

Рисунок 3. Простое создание высокочувствительных клеточных линий с помощью универсального лентивирусного вектора, контролируемого доксиклином…

Рисунок 3. Простое создание высокочувствительных клеточных линий с помощью универсального лентивирусного вектора CEST, контролируемого доксиклином.

А ). Схематическое изображение CEST. Трансген eGFP экспрессируется из промотора CMV-TetO, чувствительного к тетрациклину, а репрессор TetR экспрессируется из промотора SFFV. B ) Реагирование на доксициклин 293 Т, содержащего различные количества копий вектора CEST на клетку (0 (ложный), 0,4, 4 и 20 v. g.c., как указано слева). Различные клеточные линии инкубировали в отсутствие доксициклина (-Dox) и с 0,001 мкг/мл, 0,01 мкг/мл и 0,1 мкг/мл, как указано вверху. Утечка в отсутствие доксициклина уменьшается по мере увеличения числа копий вектора (левый график сверху вниз) C ) Индукция складок (левые панели) и просачивание (правые панели) в 293 Т (верхние панели) и мезенхимальных стволовых клетках человека (hMSC) (нижние панели), трансдуцированных с увеличением MOI вектора CEST. Среднее значение CEST v.g.c. различных проанализированных клеточных линий указаны в нижней части графиков. Наилучшая регуляция с точки зрения более высокой индуцируемости и меньшей утечки достигается в клетках, которые содержат наибольшее количество интегрированных векторов CEST.

Рисунок 4. Ядерная локализация репрессора TetR …

Рисунок 4. Ядерная локализация репрессора TetR в клетках, трансдуцированных CEST, коррелирует с полной репрессией…

Рисунок 4. Ядерная локализация репрессора TetR в клетках, трансдуцированных CEST, коррелирует с полной репрессией промотора CMV.

А) . Количественный вестерн-блот-анализ, показывающий экспрессию TetR в цитоплазматической и ядерной фракциях 293 Т-клеток, трансдуцированных с увеличением MOI CEST. Фракционирование клеток проводили, как указано в M&M. ORC2 и GRB2 использовали в качестве маркеров ядерной и цитоплазматической фракций соответственно и в качестве контроля загрузки. Б) . График, показывающий процент репрессора TetR , который присутствует в цитоплазматической (серые столбцы) и ядерной (черные столбцы) фракциях, как определено с помощью денситометрического анализа вестерн-блоттинга (A). Обратите внимание, что 9Белок 0431 TetR в основном локализован в ядре, независимо от концентрации TetR . С) . Иммунофлуоресцентное окрашивание TetR в трансдуцированных CEST hMSC (2 vgc). Клетки фиксировали и инкубировали с моноклональным IgG1 против TetR аминокислоты 84-98 и инкубировали с DAPI (ядра отмечены синим цветом), как указано в M&M. На левой панели показано изображение, которое было вручную улучшено для визуализации минимально выраженного eGFP. На среднем и правом рисунках показано Экспрессия TetR и eGFP/TetR объединяют изображения соответственно. Белые стрелки указывают на клетки, полностью отрицательные в отношении экспрессии eGFP. Обратите внимание на пурпурный цвет этих клеток (средняя и правая панели) как следствие совместной локализации DAPI (синий) и красного ( TetR ). Желтые стрелки указывают на клетки, экспрессирующие низкие уровни репрессора TetR и, следовательно, экспрессирующие eGFP (левая и правая панели). Ядра этих клеток окрашены в интенсивный синий цвет (средняя панель), что указывает на отсутствие Экспрессия TetR . v.g.c.; векторных геномов на клетку. НТ; не трансдуцированный.

Рисунок 5. Мезенхимальные стволовые клетки человека, реагирующие на доксициклин…

Рисунок 5. Чувствительные к доксициклину мезенхимальные стволовые клетки человека (чМСК) сохраняют основные свойства исходных чМСК.

Рисунок 5. Чувствительные к доксициклину мезенхимальные стволовые клетки человека (hMSC) сохраняют основные свойства родительских hMSC.

A ) Различные hMSC, чувствительные к доксициклину, были созданы с увеличением множественности заражения вектора CEST, чтобы получить в среднем 0,1, 0,5 и 2 v.g.c. (указан сверху). Экспрессию различных поверхностных маркеров анализировали с помощью проточной цитометрии и сравнивали с экспрессией исходных (трансдуцированных MOCK) чМСК. hMSC, содержащие 2 v.g.c. вектора CEST был дополнительно проанализирован для проверки влияния экспрессии вектора на статус клеточного цикла B ) и на потенциал дифференцировки в направлении адипогенеза (верхние панели), остеогенеза (в центре) и хондрогенеза (нижние панели) С ). Существенных различий между исходными и CEST-трансдуцированными hMSC не наблюдалось.

См. это изображение и информацию об авторских правах в PMC

Похожие статьи

• На пути к точно настроенной экспрессии генов после трансдукции лентивирусного вектора.

  Страница A, Fusil F, Cosset FL. Страница А и др. Вирусы. 2020 11 декабря; 12 (12): 1427. дои: 10.3390/v12121427. Вирусы. 2020. PMID: 33322556 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

• Жестко регулируемая и гомогенная экспрессия трансгена в мезенхимальных стволовых клетках, полученных из жировой ткани человека, с помощью лентивируса с системой tet-off.

  Морияма Х., Морияма М., Савараги К., Окура Х., Ичиносе А., Мацуяма А., Хаякава Т. Морияма Х. и др. ПЛОС Один. 2013 12 июня; 8 (6): e66274. doi: 10.1371/journal.pone.0066274. Печать 2013. ПЛОС Один. 2013. PMID: 23776652 Бесплатная статья ЧВК.

• Дизайн и характеристика in vitro единого регуляторного модуля для эффективного контроля экспрессии генов как в плазмидной ДНК, так и в самоинактивирующемся лентивирусном векторе.

  Огета С.Б., Яо Ф., Мараско В.А. Огета С.Б. и соавт. Мол Мед. 2001 авг.; 7(8):569-79. Мол Мед. 2001. PMID: 11591893 Бесплатная статья ЧВК.

• Жесткий контроль экспрессии трансгена с помощью лентивирусных векторов, содержащих тетрациклин-чувствительные промоторы второго поколения.

  Плута К., Люс М.Дж., Бао Л., Ага-Мохаммади С., Райзер Дж. Плута К. и др. Дж Джин Мед. 2005 г., июнь; 7 (6): 803-17. дои: 10.1002/jgm.712. Дж Джин Мед. 2005. PMID: 15655804

• Lent-On-Plus Лентивирусные векторы для условной экспрессии в стволовых клетках человека.

  Бенабделла К., Муньос П., Кобо М., Гутьеррес-Герреро А., Санчес-Эрнандес С., Гарсия-Перес А., Андерсон П., Каррильо-Гальвес А.Б., Тоскано М.Г., Мартин Ф. Бенабделла К. и др. Научный представитель 2016 17 ноября; 6: 37289. дои: 10.1038/srep37289. Научный представитель 2016. PMID: 27853296 Бесплатная статья ЧВК.

Посмотреть все похожие статьи

Цитируется

• Физиологические лентивирусные векторы для получения улучшенных CAR-T-клеток.

  Тристан-Мансано М., Мальдонадо-Перес Н., Хустисия-Лирио П., Муньос П., Кортихо-Гутьеррес М., Павлович К., Хименес-Морено Р., Ногерас С., Кармона М.Д., Санчес-Эрнандес С., Агилар-Гонсалес А., Кастелла М., Хуан М., Мараньон С., Маршаль Дж. А., Бенабделла К., Эррера С., Мартин Ф. Тристан-Мансано М. и др. Мол Тер Онколитики. 2022 18 мая; 25:335-349. doi: 10.1016/j.omto.2022.05.003. Электронная коллекция 2022 16 июня. Мол Тер Онколитики. 2022. PMID: 35694446 Бесплатная статья ЧВК.

• Пантотенаткиназа 2 взаимодействует с PINK1, чтобы регулировать контроль качества митохондрий посредством метаболизма ацетил-КоА.

  Хуан И, Ван З, Тан И, Сюй Дж, Лаборет Б, Налламоту С, Ян С, Лю Б, Лу Ро, Лу Б, Фэн Дж, Цао Дж, Хейфлик С, Ву З, Чжоу Б. Хуанг И и др. Нац коммун. 2022 3 мая; 13 (1): 2412. doi: 10.1038/s41467-022-30178-x. Нац коммун. 2022. PMID: 35504872 Бесплатная статья ЧВК.

• LentiRILES, сенсорная система miRNA-ON для мониторинга функциональности miRNA в биологии и терапии рака.

  Симион В., Луссуарн С., Лоран Ю., Ронкали Л., Госсет Д., Ревершон Ф., Руссо А., Мартин Ф., Миду П., Пишон С., Гарсион Э., Барил П. Симион В. и др. РНК биол. 2021 15 октября; 18 (дополнение 1): 198-214. дои: 10.1080/15476286.2021.1978202. Epub 2021 27 сентября. РНК биол. 2021. PMID: 34570661 Бесплатная статья ЧВК.

• На пути к точно настроенной экспрессии генов после трансдукции лентивирусного вектора.

  Страница A, Fusil F, Cosset FL. Страница А и др. Вирусы. 2020 11 декабря; 12 (12): 1427. дои: 10.3390/v12121427. Вирусы. 2020. PMID: 33322556 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

• Системы с внешним управлением для иммунотерапии: от настольных до прикроватных.

  Тристан-Мансано М., Хустисия-Лирио П., Мальдонадо-Перес Н., Кортихо-Гутьеррес М., Бенабделла К., Мартин Ф. Тристан-Мансано М. и др. Фронт Иммунол. 2020 4 сент.; 11:2044. doi: 10.3389/fimmu.2020.02044. Электронная коллекция 2020. Фронт Иммунол. 2020. PMID: 33013864 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

Просмотреть все статьи «Цитируется по»

использованная литература

1. 1. Госсен М., Бужар Х. Жесткий контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих с помощью промоторов, чувствительных к тетрациклину. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:5547–5551. — ЧВК — пабмед
2. 1. Toniatti C, Bujard H, Cortese R, Ciliberto G. Прогресс и перспективы генной терапии: системы регуляции транскрипции. Джин Тер. 2004;11:649–657. — пабмед
3. 1. Уэллс К.Д., Фостер Дж.А., Мур К., Пурсел В.Г., Уолл Р.Дж. Оптимизация кодонов, генетическая изоляция и репортер rtTA повышают эффективность тетрациклинового переключателя. Трансгенный Рез. 1999; 8: 371–381. — пабмед
4. 1. Урлингер С., Барон У., Теллманн М., Хасан М.Т., Бужар Х. и др. Изучение пространства последовательностей для тетрациклин-зависимых активаторов транскрипции: новые мутации обеспечивают расширенный диапазон и чувствительность.