Анализ случайной подвижности клеток с нарушенными путями передачи сигнала

Fache et al. ранее сообщалось о снижении подвижности, вызванной сдвиговым потоком, для клеток, лишенных G _β (13). Таким образом, мы исследовали, участвуют ли гетеротримерные G-белки в ответе на острую стимуляцию сдвиговым потоком. Клетки, в которых отсутствует G _β ( gpbA ^— ) или G _γ ( gpgA ^— ), были чрезвычайно устойчивы к кратковременной стимуляции потоком даже при значениях напряжения сдвига выше, чем обычно для клеток WT (60 по сравнению с 41 дин / см ² ; рис.4 E и F и Movie S11). Мы действительно наблюдали набор LimE _Δcoil в клетках gpgA ^— при более высоких значениях напряжения сдвига время от времени (рис. 4 E , нижний ряд и F и Movie S11). Экспрессия G _γ спасла фенотип gpgA ^— клеток. Подобно клеткам, лишенным множественных путей передачи сигнала, случайная миграция клеток gpbA ^— и gpgA ^— клеток была значительно нарушена (рис.4 G , рис. S4 C , фильм S12 и таблица S2). Кроме того, в соответствии с предыдущими исследованиями (13), мы также наблюдали уменьшение индуцированной сдвиговым потоком миграции клеток gpbA ^— и gpgA ^— клеток (рис. 4 G , Рис. S4 C и Movie S12). Увеличение скорости сдвигового потока улучшило направленную миграцию клеток gpbA ^— (рис. S4, , C, и таблица S2).Следует отметить, что клетки WT мигрировали против сдвигового потока при 10 дин / см ² , но переключили свое направление миграции на движение с потоком при 25 дин / см ² (рис. S4 C ). Напротив, G-протеин-нулевые клетки мигрировали с потоком даже при 10 дин / см ² (фиг. 4 G и фиг. S4 C ).

Случайный и индуцированный сдвиговым потоком анализ подвижности клеток WT и нулевых G-белков.

Роль потока кальция в ответе на острую механическую стимуляцию.

Поскольку механочувствительность в различных типах клеток сопровождается всплеском уровней Ca ²⁺ (14), мы исследовали, играет ли передача сигналов Ca ²⁺ роль в ответе Dictyostelium на острую механическую стимуляцию. Стандартным буфером, используемым до сих пор в экспериментах, был фосфатный буфер с добавлением 2 мМ MgSO ₄ и 200 мкМ CaCl ₂ . Когда мы оценивали чувствительность развитых клеток в фосфатном буфере без добавления катионов, мы наблюдали снижение фосфорилирования PKBR1 и ERK2 через 10 с после острой стимуляции сдвиговым потоком на роторном шейкере (рис.5 A и B ). Ответ был устранен добавлением 1 мМ CaCl ₂ или MgCl ₂ (рис. S5 A ). Клетки на стадии роста менее чувствительны к внеклеточному кальцию, потому что в этих клетках было устойчивое рекрутирование LimE _Δcoil или RBD в фосфатном или трициновом буфере без добавления катионов (фиг. 5 C и фиг. S5 B ). Добавление 1 мМ CaCl ₂ немного улучшило пик полимеризации актина в коре головного мозга после воздействия острого однонаправленного ламинарного потока, а добавление CaCl ₂ до 10 мМ не увеличивало дополнительно ответ.С другой стороны, истощение запасов кальция при длительной обработке EGTA значительно ингибировало рекрутирование LimE _Δcoil в этих клетках (фиг. 5 D и фиг. S5 C ). Вместе эти результаты предполагают, что вегетативные клетки имеют большие запасы кальция, чем развитые клетки, и, следовательно, менее восприимчивы к колебаниям внешнего уровня кальция.

Роль катионов и катионных каналов в ответе на острую механическую стимуляцию. ( A и B ) Компетентные к агрегации клетки WT в фосфатном буфере (PB) или PB с добавлением 2 мМ MgSO ₄ и 0.2 мМ CaCl ₂ [развивающий буфер (DB)] стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с антителами, которые распознают фосфорилированные PKBR1 и ERK2. Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Типичный иммуноблот показан в A . ( B ) Среднюю интенсивность полос фосфо-PKBR1 и фосфо-ERK2 нормировали на интегральную интенсивность полос DB 0 и 10 с. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка четырех независимых экспериментов.( C и D ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP, хранили в трициновом буфере, обработанном указанными концентрациями CaCl ₂ в течение не менее 5 минут ( C ) или 10 мМ EGTA. или носитель в течение не менее 30 мин ( D ), а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см ² в течение 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. LimE _Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F .Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек показаны на фиг. S5 B и C . ( E и F ) Вегетативный WT, iplA ^— , pkd2 ^— или mcln ^— 103 клетки Limco, экспрессирующие ΔFP трициновый буфер с добавлением 0,2 мМ CaCl ₂ ( E и F ) или 10 мМ CaCl ₂ ( F ), а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком, отображали и анализировали, как в C .Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 30 ячеек. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек в F показаны на рис. S5 D . * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с контролем дикого типа или носителем, если не указано иное.

Роль катионов и катионных каналов в ответе на острую механическую стимуляцию. ( A ) Компетентные к агрегации клетки WT в DB [фосфатном буфере (PB) с добавлением 2 мМ MgSO ₄ и 0.2 мМ CaCl ₂ ], PB или PB с добавлением 1 мМ CaCl ₂ или 1 мМ MgCl ₂ по отдельности или в комбинации стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и иммуноблоттинг с использованием антител, распознающих фосфорилированные PKBR1 и ERK2. Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Показан иммуноблот, представляющий два независимых эксперимента. ( B и C ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP, содержались в трициновом буфере, обработанном указанными концентрациями CaCl ₂ в течение не менее 5 минут ( B ) или 10 мМ EGTA. или носитель в течение не менее 30 мин ( C ), а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см ² в течение 2 с.Изображения собирались каждые 3 с. Пик накопления LimE _Δcoil -RFP в коре отдельных клеток количественно определяли как обратную среднюю интенсивность цитоплазмы через 6 с после начала стимуляции, нормированную на время 0. Горизонтальные линии и столбики ошибок представляют среднее значение ± стандартное отклонение. ( D ) Вегетативный WT и iplA ^{— Клетки} , экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP, содержали в трициновом буфере с добавлением 0,2 мМ или 10 мМ CaCl ₂ , стимулировали однонаправленным и ламинарным потоком, визуализировали. анализируется как в B .( E и F ) Компетентные к агрегации клетки WT или piezo ^— (два независимых клона) стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и иммуноблотировали с антителами, которые узнают фосфорилированные PKBR1 и ERK2. Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Типичный иммуноблот показан в E . ( F ) Среднюю интенсивность полос фосфо-PKBR1 и фосфо-ERK2 нормировали на интегральную интенсивность полос 0 и 10 с WT.Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка четырех независимых экспериментов. ( G ) Вегетативный WT или piezo ^— (клон 1) клетки, экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком и отображали, как в B . LimE _Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием.

Поскольку приток кальция может способствовать ответу на механический стимул, вероятно, существуют каналы, которые позволяют притоку кальция либо из внеклеточного пространства, либо из внутренних запасов.Недавнее исследование Lima et al. изучили роль нескольких предполагаемых катионных каналов в реотаксисе или миграции клеток, индуцированной сдвиговым потоком, и вовлекли полицистиноподобный канал Pkd2 и, в меньшей степени, муколипин (Mcln) в этот процесс (15). В наших анализах ответов на острую механическую стимуляцию, доставляемую однонаправленным ламинарным потоком, пиковый ответ Pkd2-нулевых или Mcln-нулевых клеток существенно не отличался от клеток WT (фиг. 5 E и Movie S13). Кроме того, мы разрушили ген гомолога Dictyostelium механочувствительного катионного канала Piezo (16) и оценили фосфорилирование PKBR1 и ERK2, а также набор LimE _Δcoil после острой механической стимуляции (рис.S5 E — G ). Ни один из ответов не был значительно нарушен в случае пьезо-нулевых клеток по сравнению с клетками дикого типа.

Напротив, клетки, лишенные гомолога рецептора IP3 IplA, показали значительно более слабое рекрутирование LimE _Δcoil после острого воздействия однонаправленного потока (фиг. 5 E и F , фиг. S5 D и Movie S14). В соответствии с предыдущими наблюдениями IplA-нулевых клеток, высокие концентрации внеклеточного кальция частично спасали ответ (рис.5 F , рис. S5 D и фильм S14) (17). Набор пика LimE _Δcoil значительно улучшился на ~ 8% в 10 мМ CaCl ₂ по сравнению с 0,2 мМ ( P <0,05).

Роль цитоскелета в ответе на острую механическую стимуляцию.

Поскольку актиновый цитоскелет участвует в механочувствительности, мы исследовали, требуется ли он для передачи острого механического стимула в клетку. Ингибирование полимеризации актина с помощью 5 мкМ латрункулина A (LatA) отменяет рекрутирование RBD-GFP в кору клеток после острой стимуляции однонаправленным сдвиговым потоком (рис.6 A и Movie S15). Средняя пиковая реакция RBD-GFP через 6 с после стимуляции была значительно снижена с почти 20% по сравнению с базовыми значениями до 0 ( P <0,001) в клетках, обработанных носителем, по сравнению с клетками, обработанными LatA (фиг.6 A и B и рис. S6 A ). LimE _{Рекрутирование Δcoil} также полностью блокировалось в клетках, обработанных LatA, что подтверждает полное ингибирование полимеризации актина после обработки LatA. Обработка 5 мкМ LatA также ингибировала фосфорилирование PKBR1 и ERK2 через 10 и 30 секунд после 5-секундной механической стимуляции роторным встряхивателем (рис.6 C и D ). Ингибирующий эффект LatA зависел от дозы (фиг. S6 B ). Клетки, обработанные LatA, сохранили способность реагировать на хемоаттрактант. Обработка 100 мкМ фолиевой кислоты или 1 мкМ цАМФ приводила к увеличению кортикальной локализации RBD и фосфорилирования PKBR1 и PKBA в вегетативных и агрегационно-компетентных клетках, соответственно (фиг. S6 C и D ). В отличие от сильной потребности в полимеризованном актине, похоже, не было необходимости в миозине II, потому что клетки, лишенные миозина II, были способны генерировать устойчивый ответ при стимуляции на роторном шейкере или с однонаправленным потоком (рис.6 E и рис. S6 E и F ).

Роль цитоскелета в ответе на острую механическую стимуляцию. ( A и B ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP или RBD-GFP, обрабатывали носителем или 5 мкМ LatA в течение не менее 15 минут, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см ² за 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. Типичные клетки показаны в A .( B ) RBD-GFP и LimE _Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек показаны на рис. S6 A . ( C и D ) Компетентные к агрегации клетки WT предварительно обрабатывали LatA в течение 30 минут, стимулировали на роторном шейкере в течение 5 секунд, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с использованием антител, которые распознают фосфорилированные PKBR1 или ERK2.Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Блот, представляющий три независимых эксперимента, показан в C и количественно представлен на фиг. S6 B . ( D ) Среднюю интенсивность фосфорилированных полос для носителя и 5 мкМ LatA нормализовали на интегральную интенсивность 0-, 10- и 30-секундных полос наполнителя. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 5 (pPKBR1) и 6 (pERK2) независимых экспериментов. ( E ) Компетентные к агрегации myo ^{— Клетки} стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали и иммуноблотировали, как в C .Показан блот, представляющий по крайней мере два независимых эксперимента. ( F и G ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP или RBD-GFP, обрабатывали носителем или 50 мкМ беномила в течение не менее 20 мин, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см ² за 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. Типичные клетки показаны в F . ( G ) RBD-GFP и LimE _{Накопление Δcoil} -RFP в коре головного мозга количественно определяли как инверсию средней интенсивности цитоплазмы, нормализованной для времени 0.Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек показаны на рис. S6 F . *** P <0,001. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга. (Шкала 10 мкм.)

Роль цитоскелета в ответе на острую механическую стимуляцию. ( A ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP или RBD-GFP, обрабатывали носителем или 5 мкМ LatA в течение не менее 15 минут, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см ² в течение 2 с .Изображения собирались каждые 3 с. Пик RBD-GFP и накопление LimE _Δcoil -RFP в коре отдельных клеток количественно определяли как инверсию средней интенсивности цитоплазмы через 6 с после начала стимуляции, нормированной на время 0. Горизонтальные линии и столбики ошибок представляют среднее значение ± стандартное отклонение. , *** P <0,001. ( B ) Компетентные к агрегации клетки WT предварительно обрабатывали LatA в течение 30 минут, стимулировали на роторном шейкере в течение 5 секунд, лизировали в указанные моменты времени и иммуноблотировали с использованием антител, распознающих фосфорилированный ERK2 (фиг.3 С ). Среднюю интенсивность фосфорилированных полос нормировали на интегральную интенсивность полос 0-, 10- и 30-секундного носителя. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка трех независимых экспериментов. ( C ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие RBD-GFP, обрабатывали носителем или 5 мкМ LatA в течение по меньшей мере 15 мин, а затем стимулировали 100 мкМ фолиевой кислоты. Изображения собирались каждые 3 с. Накопление RBD-GFP в коре головного мозга определяли количественно, как показано на рис. 1 F . Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием.( D ) Компетентные к агрегации клетки WT предварительно обрабатывали LatA в течение 30 мин, стимулировали либо механически на роторном шейкере в течение 5 с, либо 1 мкМ цАМФ, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с использованием антител, которые распознают фосфорилированный PKBR1 и ПКБА. ( E и F ) Вегетативные myo ^— клетки, экспрессирующие RBD-GFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см ² в течение 2 с. Изображения собирались каждые 3 с.Типичная ячейка показана в E . ( F ) Накопление RBD-GFP в коре головного мозга количественно определяли как обратное значение средней интенсивности цитоплазмы, нормированной на время 0. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 14 клеток. ( G ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP, обрабатывали носителем или 50 мкМ беномилом в течение 30 минут, фиксировали и иммуноокрашивали антителом против α-тубулина. ( H ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE _Δcoil -RFP или RBD-GFP, обрабатывали носителем или 50 мкМ беномила в течение не менее 20 мин, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см ² в течение 2 с .Изображения собирались каждые 3 с. Пик RBD-GFP и накопление LimE _Δcoil -RFP в коре отдельных клеток количественно определяли как инверсию средней интенсивности цитоплазмы через 6 с после начала стимуляции, нормированной на время 0. Горизонтальные линии и полосы ошибок представляют среднее значение ± стандартное отклонение. . ( I — K ) Компетентные к агрегации клетки WT предварительно обрабатывали носителем или указанными концентрациями беномила в течение 30 минут, стимулировали на роторном шейкере в течение 5 секунд, лизировали в указанные моменты времени и иммуноблотировали с использованием антител, которые распознают фосфорилированный PKBR1 или ERK2.Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Типичный иммуноблот для носителя и 50 мкМ беномила показан в I . ( J ) Средняя интенсивность полос фосфорилированного ERK2 для носителя и 50 мкМ беномила в различные моменты времени после стимуляции была нормализована для времени 0. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка (SE) четырех независимых экспериментов. ( K ) Средняя интенсивность полос фосфорилированного ERK2 для носителя и указанные концентрации беномила в момент времени 0 были нормализованы для носителя.Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка трех независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с носителем. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга. (Шкала, 10 мкм.)

Мы также проверили, будет ли нарушение других структурных компонентов подавлять реакцию на острую механическую стимуляцию. Обработка клеток беномилом в концентрации до 50 мкМ, лекарственным средством, дестабилизирующим микротрубочки, не отменяет рекрутирование RBD или LimE _Δcoil в кортекс после короткого импульса потока (рис.6 F и G и Рис. S6 G и H и Movie S16). Мы также исследовали влияние беномила на фосфорилирование PKBR1 и ERK2 после острой стимуляции на роторном шейкере (рис. S6 I — K ). Беномил не блокировал индуцированное стимуляцией фосфорилирование (рис. S6 I и J ). Следует отметить, что беномил резко снижает количество базального фосфорилирования дозозависимым образом (рис. S6 K ), что вносит ошибку в расчет кратного увеличения фосфорилирования.Таким образом, по-видимому, неповрежденный каркас микротрубочек модулирует базальную активность, но в отличие от актинового цитоскелета его эффекты могут подавляться сильным механическим стимулом.

Обсуждение

Мы обнаружили, что кратковременная стимуляция клеток сдвиговым потоком приводит к быстрой временной активации всех протестированных путей передачи сигнала, а также к полимеризации актина, подобно равномерной стимуляции хемоаттрактантом (рис. 7). Мы наблюдали одновременные изменения активности и / или локализации молекул из нескольких параллельных путей в хемотаксической сигнальной сети, включая ERK2, Ras GTPases, Rap1, KrsB, PKBR1, PIP3, PKBA, PTEN и CynA.Кинетика этих изменений соответствовала изменениям, вызванным хемоаттрактантом. Как и при стимуляции хемоаттрактантами, клетки реагируют на увеличение механической силы насыщенным образом. Насыщающие стимулы вызывают реакции типа «все или ничего», за которыми следует рефрактерный период, в течение которого система не реагирует ни на какие стимулы сопоставимой силы. Эти свойства позволяют предположить, что механические стимулы поступают в ту же возбудимую сеть, которая ранее была обозначена для хемоаттрактантов.Для хемоаттрактантов сигнал поступает через сеть рецептор / G-белок, которая смещает возбудимую сеть передачи сигнала, которая управляет сетью цитоскелета. Конвергенция химических и механических стимулов в сети передачи сигналов позволит клетке интегрировать входные данные. Для механического возмущения мы определили несколько необходимых компонентов, включая полимеризованный актин, кальций и субъединицы βγ G-белка, а также общую активность сети передачи сигнала.Таким образом, вместо того, чтобы указывать на вход через определенную сеть, наши данные предполагают, что реакция на механические стимулы может проникать через любую из сетей.

Активация хемотаксической сигнальной сети химическими и механическими стимулами. Предпосылки: Хемоаттрактанты связываются с GPCR, что приводит к диссоциации и активации субъединиц α и βγ G-белка. Этот сигнал дополнительно усиливается множеством параллельных путей в сети передачи сигнала, что необходимо для смещенной полимеризации актина.В ответ на хемоаттрактант большинство молекул в сети передачи сигналов временно активируются или рекрутируются в кору, хотя PTEN и CynA диссоциируют из коры. В этом отчете: Во-первых, множественные узлы (выделены жирным курсивом) в пределах хемотаксической передачи сигнала и цитоскелетных сетей были протестированы в ответ на острую механическую стимуляцию. Восемь либо накапливались в коре, либо демонстрировали активирующее фосфорилирование (зеленые треугольники), а две потеряли кортикальную локализацию (синие треугольники), все с той же динамикой, что и для хемоаттрактантов.Во-вторых, тесты были повторены после того, как многочисленные компоненты (отмеченные *), участвующие в хемотаксических ответах, механотрансдукции и целостности цитоскелета, были нарушены с использованием генетических делеций и / или фармакологических ингибиторов. Поскольку возмущения внутри всех трех сетей подавляли реакцию на острую механическую стимуляцию (показано красным и коричневым), похоже, что все три сети координируются логическим логическим И-типом ворот, чтобы вызвать глобальный ответ. Возможные точки входа механических раздражителей обсуждаются в тексте.

Мы наблюдали практически полное ингибирование ответа на механическое возмущение в клетках с деполимеризованным актиновым цитоскелетом, предполагая, что интактный актиновый цитоскелет необходим для передачи механического стимула в сеть передачи сигнала. Требование неповрежденного цитоскелета специфично для механического стимула, потому что клетки, обработанные латрункулином, действительно реагируют на хемоаттрактанты (рис. S6 C и D ) (18, 19). Ответ не зависел от общей архитектуры цитоскелета, поскольку деполимеризация сети микротрубочек не оказывала значительного влияния на ответ на механическую стимуляцию.Известно, что клетки, обработанные латрункулином, значительно снизили корковое натяжение, что может быть важным для механоответа (20).

Истощение запасов кальция или нарушение IplA блокирует ответ, предполагая, что он опосредован активностью механочувствительных катионных каналов или может потребовать общего повышения уровня кальция в цитозоле. Биохимические реакции на механические стимулы приписываются механочувствительным катионным каналам, включая каналы транзиторного рецепторного потенциала (TRP), такие как полицистин-2 (Pkd2), а также пьезоканалы (21).Pkd-2 и др. Муколипин канала семейства TRP (Mcln) участвуют в индуцированной сдвиговым потоком миграции клеток Dictyostelium (15). Мы идентифицировали и разрушили гомолог пьезо. Однако в наших анализах пиковый ответ на острую механическую стимуляцию не претерпел заметных изменений в клетках, лишенных какого-либо из этих предполагаемых механочувствительных каналов, хотя возможно, что мутанты проявят измененную реакцию в других условиях (например, при различных скоростях потока, концентрациях кальция, или подложки).Другая возможность состоит в том, что существует функциональная избыточность между различными механочувствительными каналами, как это было постулировано для бактериальных каналов Msc (22). Было бы интересно изучить клетки с комбинированным удалением двух и более каналов. Кроме того, обе клетки pkd2 ^— и mcln ^— , по-видимому, имели некоторые различия в ответе актина после начального пика. Неспособность установить направленный ответ может потенциально объяснить аберрантную миграцию этих клеток, даже если первоначальный ответ устойчив, хотя в текущем исследовании это не рассматривалось.Взятые вместе, эти результаты предполагают, что реакция на механические стимулы требует общего притока кальция, который, вероятно, опосредуется IplA. Участвуют ли в этом остром ответе специфические механочувствительные каналы, остается открытым вопросом.

Возможно, несколько удивительным было наблюдение, что ответ на острую механическую стимуляцию был снижен в клетках, которые лишены субъединиц β или γ G белков. Напротив, клетки, лишенные обоих основных хемоаттрактантных рецепторов cAR1 и cAR3, по-прежнему реагировали.Кроме того, маловероятно, что растворимые факторы, связывающиеся с другим GPCR, опосредуют ответ, потому что перфузионные клетки все еще были способны реагировать на силу сдвига. Тем не менее, возможно, что G-белки непосредственно участвуют в преобразовании механического стимула в биохимический ответ. Фактически, очищенные G-белки в фосфолипидных везикулах активировались в ответ на острое напряжение сдвига в отсутствие других белковых компонентов (23). Однако клетки, лишенные β- или γ-субъединиц G-белков, мигрируют медленнее случайным образом в результате хемотаксиса, электротаксиса и сдвигового потока, а также недостаточны для фагоцитоза, что позволяет предположить, что дефект механочувствительности может быть связан со сниженной исходной активностью (13, 24⇓). –26).

Тот факт, что все возмущения нескольких сетей подавляют реакцию, предполагает, что механический стимул может входить в несколько точек или что изменения, которые влияют на базальное состояние активации возбудимой сети передачи сигнала, также могут влиять на чувствительность к механическим стимулам. В самом деле, возмущения в самой сети передачи сигналов снижали реакцию на механическую стимуляцию. Как отмечалось выше, истощение кальция блокировало реакцию. Кроме того, мы наблюдали выраженное ингибирование (~ 60%) в клетках, у которых отсутствует активность в четырех параллельных путях (sGC, PLA ₂ , Pia и PI3K).Эти возмущения коррелировали со значительным уменьшением случайной миграции этих клеток (рис. 4) (8, 27). Нарушение других сетей за счет нарушения G-белков или актинового цитоскелета также влияет на кажущуюся возбудимость сети передачи сигналов (8, 9, 28). Даже если стимул введен в какой-то момент, например, через актиновый цитоскелет, активация сети передачи сигнала может потребоваться для усиления сигнала. Поскольку сеть передачи сигналов является возбудимой, ее активация требует пересечения порогового значения, и ожидается, что любое возмущение, повышающее порог, ограничит усиление.Присущая вариация в базальном состоянии активации отдельных клеток также, вероятно, объясняет вариацию в ответе, наблюдаемую на фиг. 1 F и G .

Активация сигнальной трансдукции и цитоскелетных сетей в ответ на стимул острого напряжения сдвига не просто следствие миграции клеток в непрерывном потоке, но, вероятно, является предпосылкой для этого способа направленной миграции. Когда клетки стимулируют сдвиговым потоком в течение 10 с, пик реакции наблюдается до окончания стимула, после чего следует временная пауза в миграции.Кроме того, непрерывное воздействие потока сначала вызывает кратковременный всплеск активации передачи сигнала и цитоскелетных сетей, за которым следует направленный ответ и миграция. Эта серия событий аналогична реакции клетки при первом воздействии градиента хемоаттрактанта. Он также показывает однородный отклик, за которым позже следует поляризованный отклик в направлении градиента.

Серия событий, описанных выше, может объяснить миграцию, вызванную сдвиговым потоком, против течения.Мы и другие наблюдаем миграцию клеток WT против потока при более низких уровнях напряжения сдвига, тогда как при более высоких уровнях напряжения сдвига клетки начинают мигрировать в направлении потока (4, 13). Миграция против потока может происходить, если сдвиговый поток стимулирует сеть передачи сигнала и полимеризацию актина, предпочтительно на переднем крае клетки. Соответственно, G-протеин-нулевые клетки, которые не реагировали на острую механическую стимуляцию в типичных условиях, были неспособны мигрировать против потока, но могли мигрировать с потоком.Это говорит о том, что миграция с потоком не зависит от острой реакции. Клетки, мигрирующие с потоком, обнаруживают маркеры переднего края, такие как PIP3, в передней части клетки (7), но это, вероятно, является следствием большего количества псевдопод в направлении миграции. Важно отметить, что значения напряжения сдвига, которые вызывали миграцию против или с потоком, были достаточными для индукции острой реакции. Фактически, даже несмотря на то, что на основе кривой дозы низкие значения напряжения сдвига, которые использовались для анализа миграции, не вызывают полного ответа, когда стимуляция является непрерывной, переходная реакция, вероятно, приближается к насыщению, как видно из рис.3 A (2- против 10-секундного отклика при 15 дин / см ² ). Также стоит отметить, что дефекты в индуцированной сдвиговым потоком миграции клеток, лишенных Pkd2 или Mcln, которые не были дефектными в нашем анализе, были зарегистрированы в условиях относительно высокого сдвигового потока (15). В целом возможность того, что миграция против потока или вместе с ним включает в себя различные механизмы, интригует и требует дальнейшего изучения.

До сих пор очень мало исследований касалось того, как обрабатываются различные внешние стимулы и существует ли интеграция различных входных сигналов.Ли и др. исследовали миграцию Т-клеток в присутствии электрического поля и противоположного градиента хемоаттрактанта (29). В их исследовании клетки продолжали мигрировать с той же скоростью к катоду, хотя их направленность была значительно нарушена противоположным градиентом хемоаттрактанта. Этот вывод согласуется с нашей моделью, в которой различные стимулы объединяются вместе на уровне сети передачи сигнала, и, таким образом, общий ответ зависит от относительной силы двух стимулов.Хотя это технически сложно, будущие исследования должны оценить поведение клеток, которые одновременно подвергаются сдвиговому потоку и градиенту хемоаттрактанта.

Ответ на острую механическую стимуляцию, по-видимому, является консервативным явлением, по крайней мере, среди клеток, претерпевающих амебоидную миграцию. Подобно Dictyostelium , нейтрофилы и Т-лимфоциты также ранее сообщалось о направленной миграции в ответ на сдвигающий поток (30, 31). Однако вопрос о том, является ли острый ответ, наблюдаемый в нейтрофилах человека в этом исследовании, предпосылкой для миграции, вызванной сдвиговым потоком, как это имеет место в случае Dictyostelium , еще предстоит изучить.Мы предполагаем, что реакция на острую механическую стимуляцию, наблюдаемую в этом исследовании, не является специфической для сдвигового потока, но, вероятно, представляет собой реакцию на любое механическое возмущение. И Dictyostelium , и мигрирующие клетки млекопитающих постоянно подвергаются физическим сигналам, когда они перемещаются через трехмерные матрицы в почве или интерстициальном пространстве, соответственно, и эти сигналы, вероятно, интегрируются с другими направленными сигналами, чтобы направлять миграцию клеток.

Наше исследование демонстрирует, что острый механический стимул непосредственно активирует огромное количество молекул в цепи передачи хемотаксического сигнала и в сетях актинового цитоскелета.Большинство исследований направленной миграции сдвигового потока изучали клетки в стационарных условиях, и такой ответ на начальное применение сдвигового потока не наблюдалось. Мы предполагаем, что общая сеть передачи сигналов лежит в основе ответов не только на химические и механические стимулы, но и на другие внешние воздействия, например, изменения в электрических полях, хотя это еще предстоит проверить.

SI Материалы и методы

Культура клеток.

Клетки Dictyostelium discoideum поддерживали в стандартных условиях либо в планшетах для культивирования тканей, либо в суспензии в среде HL-5 с антибиотиками.Для анализа вегетативных клеток клетки выращивали в присутствии Klebsiella aerogenes на пластинах SM. Клетки K. aerogenes выращивали в суспензии на среде HL-5 без антибиотиков при комнатной температуре в течение 16–18 часов. Небольшое количество клеток D. discoideum (∼1 × 10 ⁵ для большинства штаммов) в среде HL-5 без антибиотиков распределяли вместе с 260 мкл суспензии K. aerogenes на планшете SM и выращивали в течение 36–36 дней. 48 ч. Как только клетки начали очищать бактериальный газон, их собирали и трижды промывали развивающим буфером (DB): фосфатным буфером (PB) с добавлением 2 мМ MgSO ₄ и 0.2 мМ CaCl ₂ , пока все бактерии не будут смыты. Конечный осадок клеток ресуспендировали в буфере DB, если не указано иное, до плотности ~ 5 × 10 ⁶ клеток / мл. Для анализа развитых клеток клеток D. discoideum собирали во время экспоненциального роста, голодали и обрабатывали 50 нМ цАМФ каждые 6 минут, как описано ранее (32). Анализ проводился на клетках, которые голодали около 4 часов.

В данном исследовании использовался штамм WT Ax2, щедро предоставленный R.Кей, Лаборатория молекулярной биологии Совета медицинских исследований, Кембридж, Великобритания). Штаммы cAR1 / 3 ^— , aca ^— и gpbA ^— были описаны ранее (25, 33, 34). gpgA ^— клеток любезно предоставлены Y. Kamimura и M. Ueda, Университет Осаки, Осака. IplA ^— , mcln ^— и pkd2 ^— клеток были сгенерированы на фоне Dh2–10 WT, и были щедро предоставлены P.Коссон, Женевский университет, Женева (15). sGC ^— , sGC / pla2 ^— и sGC / pla2 / pia ^— клеток были щедро предоставлены A. Kortholt, University of Haasteringt и PJ van Gasteringt Гронинген, Нидерланды. myoII ^— клеток любезно предоставлены Д. Н. Робинсоном, Университет Джона Хопкинса, Балтимор (35).

В данном исследовании использовались следующие конструкции: LimE _Δcoil -RFP, GpgA, PH _CRAC -GFP, PTEN-GFP, CynA-GFP (36), RalGDS-GFP (37) и RBD _Raf . -GFP (любезно предоставлено А.Kortholt и P. J. van Haastert). Клетки, несущие плазмиды, отбирали либо с 20 мкг / мл G418, либо с 50 мкг / мл гигромицина B по мере необходимости в течение по крайней мере 1 недели перед анализом.

Генерация пьезоэлементов.

piezo ^— клеток были получены путем замены первых 3015 из 3080 нуклеотидов в кодирующей последовательности гена, кодирующего белок, содержащий повтор инволюкрина (DDB_G0282801), гомолог Piezo (16), на BSR кассету путем гомологичной рекомбинации (38).Нокаут-конструкцией трансформировали клеток D. discoideum Ax2. Трансформанты отбирали с использованием 10 мкг / мл сульфата бластицидина S, клонально высевали на лужайку K. aerogenes , и отдельные клоны проверяли на успешное разрушение гена с помощью ПЦР и саузерн-блоттинга.

Механическая стимуляция.

Для оценки изменений фосфорилирования белка в ответ на острый сдвигающий поток 2 × 10 ⁶ развитых клеток помещали в чашки диаметром 35 мм с 2 мл DB.Клеткам давали возможность прикрепиться в течение 10 мин, а затем дважды промывали 1 мл DB. Для экспериментов по оценке роли Ca ²⁺ PB вместо DB использовался для промывок и для всех последующих стадий. После последней промывки клетки инкубировали в DB с 2,5 мМ кофеина без какого-либо нарушения планшетов. Там, где указано, клетки инкубировали с 0,1–5,0 мкМ LatA (Enzo Life Sciences, номер по каталогу BML-T119-0100), 5–50 мкМ беномилом (Sigma-Aldrich, номер по каталогу 45339) или 0,1% носителем ДМСО. во время базализации кофеином.Для применения сдвигового потока планшет помещали на орбитальный шейкер (New Brunswick Scientific G-33), который немедленно включали при 150 об / мин (если не указано иное) на 5 с. Буфер аспирировали в указанные моменты времени после начала стимуляции. Клетки немедленно лизировали на льду с использованием 100 мкл буфера для образцов с ингибиторами протеаз и фосфатаз [62,5 мМ Tris⋅HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 42 мМ DTT, 0,01% бромфенолового синего, 50 мМ NaF, 2 мМ Na ₃ VO ₄ , 25 мМ, NaPP _i , 1 × полная смесь ингибиторов протеазы без ЭДТА (Roche)], собирали и кипятили в течение 10 мин.В течение «времени 0» клетки лизировали без встряхивания. Белки разделяли с помощью 4–15% полиакриламидного геля Tris⋅HCl (Criterion, Bio-Rad), переносили на поливинилиденфторидную мембрану, блокировали и подвергали иммуноблоттингу фосфо-PKCζ Thr410 (для обнаружения фосфо-PKBR1 и фосфо-PKBA; Cell Signaling Technology) или фосфо-Mst1 Thr183 (для обнаружения фосфо-KrsB; Cell Signaling Technology). Сигнал обнаруживали путем инкубации с конъюгированным с пероксидазой хрена вторичным антителом против кролика (GE Healthcare) с последующей хемилюминесценцией с использованием субстрата Clarity Western ECL (Bio-Rad).Затем блот очищали буфером для удаления вестерн-блоттинга Restore Plus (Pierce) и повторно зондировали первичным антителом против фосфо-p42 / 44 MAPK Thr302 / 304 (для обнаружения фосфо-ERK2; Cell Signaling Technology) или KrsB (38). Равную загрузку белка подтверждали окрашиванием мембраны из поливинилиденфторида CBB.

Для анализа поведения отдельных клеток после острой механической стимуляции вегетативные или развитые клетки высевали при ∼1 × 10 ⁶ клеток / мл в µ-Slide III ³ⁱⁿ¹ (Ibidi) и оставляли для прикрепления в течение 10 мин. .Если не указано иное, клетки находились в БД. Для экспериментов по оценке роли Ca ²⁺ анализ проводили в трициновом буфере (ТВ) (5 мМ трицин, pH 7,0 с 5 мМ KCl). Слайд соединяли с системой Ibidi Pump System, и клетки на короткое время промывали буфером. Изображения получали при освещении RFP или GFP на инвертированном микроскопе Zeiss Observer.Z1, оборудованном масляным объективом 40 × / 1,3 с интервалами 3 с. Для биосенсоров PTEN, CynA и RalGDS изображения получали с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском UltraView (DM 16000; Perkin-Elmer), оснащенного 40 × / 1.25–0,75 масляный объектив. После пяти кадров поток был включен при определенном давлении, чтобы получить указанные значения напряжения сдвига. Подача прекращалась через 2, 5 или 10 с. Стимуляцию повторяли, как указано. Обратите внимание на напряжение сдвига, которое было создано с помощью этой установки, варьировалось от ~ 5 дин / см ² (0,5 Па, 0,5 пН / мкм ² ) с использованием только силы тяжести до ~ 60 дин / см ² (6 Па, 6 пН / мкм ² ) при максимальной настройке давления. Где указано, клетки сначала подвергали воздействию потока при ~ 5 дин / см ² в течение нескольких минут с последующей стимуляцией при ~ 60 дин / см ² в течение 5 с.При тестировании эффектов различных обработок на реакцию клеток на механическую стимуляцию слайд соединяли с двумя линиями: одна была заполнена соответствующим носителем, а другая — 5 мкМ LatA, 50 мкМ беномила, 50 мкМ LY294002 (Cell Signaling Technology, cat. № 9901), 1 или 10 мМ CaCl ₂ (в ТБ) или 10 мМ ЭГТА (в ТБ). После выполнения стимуляции носителем линии меняли местами, клетки промывали буфером, содержащим указанное лечение, и инкубировали в течение 30 минут, позволяя буферу течь через каждые ~ 10 минут.На всех показанных изображениях поток применяется слева направо, за исключением Рис. 1 D и E и Фиг. S1 C , где поток применяется сверху вниз. Для стимуляции gpbA ^— при более высоких значениях стресса (фиг. 4 E , нижний ряд ) клетки анализировали с использованием µ-Slide I ^0,2 (Ibidi).

Для альтернативного подхода к стимуляции клеток с помощью сдвигового потока, 25 мкл капель ∼7,5 × 10 ⁵ клеток / мл высевали в однолуночную камеру (Lab-Tek, Thermo Scientific, Nunc), позволяя прилипать в течение по крайней мере 10 мин, покрытые DB и экспонированные микропипеткой, заполненной DB.Компенсационное давление поддерживали на уровне 1500 фунтов на квадратный дюйм. Клетки были изображены, как указано выше. В указанное время была применена функция очистки, которая высвобождает болюс жидкости из микропипетки, с последующим возвратом в поток только после компенсации давления.

Для экспериментов, в которых мы оценивали взаимодействие между механической и химической стимуляцией, капли 20 мкл ∼1 × 10 ⁶ клеток / мл в DB высевали в восьмилуночную камеру (Lab-Tek, Thermo Scientific, Nunc ) и оставлен на 10 мин.Для применения механической стимуляции в лунку быстро добавляли 430 мкл DB. Через 12 или 45 с после механической стимуляции в ту же лунку добавляли 50 мкл фолиевой кислоты (конечная концентрация 20 нМ) или носителя (DB), не вызывая механического ответа. Изображения были получены, как указано выше.

Анализ изображений.

После получения изображения фон вычитался, и средняя интенсивность в прямоугольнике, нарисованном в цитоплазме данной клетки, регистрировалась для каждого кадра с использованием ImageJ 1.50g программное обеспечение (NIH) (39). Значения были нормализованы для времени 0 и инвертированы, чтобы отразить накопление сигнала в коре головного мозга. Для Фиг.2 B площадь ячейки была рассчитана с использованием двоичного изображения как количество пикселей, умноженное на 0,1024 мкм ² / пиксель. Чтобы вычислить новую покрытую площадь, мы вычли двоичное изображение ячейки в кадре ( n -1) из кадра n . Поскольку изображение является двоичным, только новые пиксели, занимаемые ячейкой, которые соответствуют выступам, вычисляются и преобразуются в площадь, как указано выше.Ретракции клеток в анализ не включались.

Для построения кимографов отдельных клеток изображения были автоматически настроены по яркости и контрастности с помощью ImageJ. Для конфокальных изображений также вычитался фон. Чтобы сегментировать изображение, мы проделали следующие манипуляции в ImageJ: отрегулировали порог заполнения ячейки, сделали изображение двоичным, заполнили дыры, расширили. Сегментированные изображения были проанализированы с использованием специальной функции Matlab (MathWorks), как описано ранее (40).

Тепловые карты были сгенерированы с использованием специальной функции Matlab (MathWorks) путем нанесения значений, нормированных на время 0, для отдельных ячеек в рамках эксперимента.Для сравнения тепловых карт были установлены границы 0,5 и 2,0, которые включали большую часть данных. Если ответ одной ячейки выходит за эту границу, это отображается как насыщенный сигнал на тепловой карте.

Анализ подвижности.

Для анализа случайной подвижности ~ 1 × 10 ⁵ вегетативных клеток помещали в восьмилуночную камеру (Lab-Tek, Thermo Scientific, Nunc) в DB, ​​давали возможность прикрепиться в течение 10 минут, с добавлением LY294002 до конечной точки. концентрации 50 мкМ или 0,1% ДМСО, и инкубируют в течение 50 мин.Изображения получали с фазовой подсветкой на инвертированном микроскопе Zeiss Observer.Z1 с 20-кратным объективом с интервалом 20 с.

Сдвиговый поток, а также случайная миграция gpbA ^— , gpgA ^— + GpgA и клеток WT оценивали с использованием насосной системы Ibidi, как описано для механической стимуляции. После посева клетки сначала визуализировали без потока (случайная миграция) в течение 15 мин. Затем подавали поток со скоростью ~ 10 дин / см ² в течение 15 минут, а затем переключили на 25 дин / см ² еще на 15 минут, как указано.Изображения были получены с фазовой подсветкой с интервалом 15 с, как указано выше. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения Tracking Tool PRO (v2.0).

Иммунофлуоресценция.

Приблизительно 1 × 10 ⁵ клеток были засеяны в восьмилуночную камеру (Lab-Tek, Thermo Scientific, Nunc) в БД, позволили прикрепиться в течение 10 мин, переключили на БД с 50 мкМ беномила или 0,2% ДМСО, и инкубировали 30 мин. Клетки фиксировали фиксирующим раствором (2% параформальдегид, 0,8% глутарового альдегида, 0,05% Triton X-100 в среде HL-5) в течение 10 мин, гасили 20 мМ глицином в PBS, дважды промывали промывочным раствором (0.05% Triton X-100, 0,5% BSA в 1 × PBS), блокировали PBS / 3% BSA и инкубировали с первичным антителом против α-тубулина (YL1 / 2, ThermoFisher Scientific, каталожный номер MA1-80017) в блокирующем растворе в течение ночи при 4 ° C. Лунки дважды промывали промывным раствором и инкубировали с конъюгированными с Alexa Fluor 488 козьими вторичными антителами против крыс в блокирующем растворе при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки промывали промывочным раствором трижды, ополаскивали и хранили в 1 × PBS при 4 ° C. Изображения были получены с использованием освещения GFP на Zeiss Observer.Инвертированный микроскоп Z1 с масляным объективом 40x / 1.3.

Механическая стимуляция и анализ клеток HL-60.

Клетки HL-60 культивировали и дифференцировали, как описано ранее (40). Дифференцированные клетки промывали модифицированным HBSS (mHBSS), ресуспендировали в mHBSS с добавлением 0,2% BSA, высевали в µ-Slide III ³ⁱⁿ¹ (Ibidi) и позволяли прикрепиться в течение 10 минут при 37 ° C. Клетки механически стимулировали, как описано выше для клеток Dictyostelium , с использованием mHBSS / 0.2% BSA. Фазовые изображения получали с помощью инвертированного микроскопа Zeiss Observer.Z1, оснащенного 20-кратным объективом, с интервалом 15 с. Площадь клетки измеряли, вручную очерчивая периметр клетки в каждый момент времени с помощью программного обеспечения ImageJ 1,50 g.

Статистический анализ.

Непарный двусторонний тест t использовался для оценки различий между двумя образцами. Для сравнения множественных выборок использовали дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями и посттест Стьюдента – Ньюмана – Кеулса. П <0.05 считалось значительным.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Pierre Cosson, Peter J. van Haastert, Yoichiro Kamimura, Robert R. Kay, Arjan Kortholt, Douglas N. Robinson и Masahiro Ueda, а также dictyBase для предоставления экспрессионных конструкций и штаммов, используемых в этом исследовании, и члены P.N.D. Лаборатория для полезных предложений и обсуждения. Эта работа была поддержана грантом NIH R35 GM118177 (P.N.D.).

Сноски

• Автор: Y.А. и П.Н.Д. спланированное исследование; Y.A., L.A. и J.B. проводили исследования; P.A.I. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Ю.А. и Лос-Анджелес проанализировали данные; и Ю.А. и П.Н.Д. написал газету.

• Рецензенты: П.К., Университет Калгари, медицинский факультет; и C.A.P., Национальный институт рака, NIH.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073 / pnas.1608767113 / — / DCSupplemental.

Механические системы и обработка сигналов — Журнал

Механические системы и обработка сигналов (MSSP) — междисциплинарный журнал в области машиностроения, авиакосмической промышленности и гражданского строительства, целью которого является освещение научных достижений высочайшего качества, связанных с новыми технологиями в области машиностроения. зондирование, приборы, обработка сигналов, моделирование и управление динамическими системами. Ожидается, что документы MSSP внесут очевидный оригинальный вклад в инженерные знания, который должен быть значительным с точки зрения продвижения по сравнению с установленными методами.Особенно востребованы статьи, которые включают как теоретические, так и экспериментальные аспекты или содержат теоретический материал, имеющий большое значение для практических приложений. MSSP является лидером в своей области и охватывает следующие области исследований:

• Обработка сигналов при мониторинге состояния оборудования
• Нестационарные и случайные колебания
• Методы временных рядов
• Динамика ротора
• Обработка сигналов при производстве / обработке
• Силовые агрегаты и трансмиссии
• Акустика, волны и SEA
• Контроль вибраций и шума
• Контроль состояния конструкций
• Идентификация конструкции
• Нелинейные колебания (включая сбор энергии)
• Количественная оценка неопределенности в инженерной динамике

Рассмотрены следующие области исследований быть за рамками MSSP:

• Многотельная динамика и робототехника, включая управление роботами
• Управление транспортными средствами
• Теоретический контроль — статьи, лучше подходящие для специализированного журнала управления
• Теоретическая нелинейная d динамика без экспериментальной проверки
• Количественная оценка неопределенности без четко определенной значимости для инженерной динамики

Документы, представленные в MSSP, должны включать в сопроводительное письмо четкое изложение первоначального научного вклада работы.Об этом также следует кратко заявить в аннотации и расширить во введении. Также во Введении важно четко определить конкретную проблему, рассматриваемую с учетом всех сделанных условий и допущений, и сопоставить ее вклад как с исторической литературой (обычно в хронологическом порядке), так и с состоянием искусства. Состояние дел следует, насколько это возможно, резюмировать и классифицировать, но не просто перечислять документы. Конкретная причина (ы) для внедрения нового метода или подхода должна стать ясной на основе представленного состояния техники.Любые преимущества предлагаемых методов по сравнению с общепринятыми методами должны быть четко и подробно объяснены, включая сравнительные испытания и экспериментальные данные, где это возможно.

MSSP стремится поддерживать высокий уровень письменного английского языка, и ответственность за то, чтобы язык был понятным, лежит на авторах. Невыполнение этого требования может привести к отклонению вашей статьи.

Авторам статей, посвященных машинному обучению или обработке сигналов, следует ознакомиться с руководящими принципами MSSP по этим темам: https: // media.journals.elsevier.com/content/files/machine-learning-04180327.pdf
https://www.elsevier.com/__data/promis_misc/SignalProcessing.pdf

как неинвазивное средство воздействия на мезенхимальные стволовые клетки Судьба, развитие костей и подавление жирового фенотипа

Bonekey Osteovision. Авторская рукопись; доступно в PMC 2012 11 января.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC3255555

NIHMSID: NIHMS228511

Yen K.Luu

¹ Диабетический исследовательский центр, Медицинский факультет, Отдел эндокринологии, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Бронкс, Нью-Йорк, США

Джеффри Э. Пессин

¹ Диабетический исследовательский центр, Медицинское отделение, Отделение Эндокринология, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Бронкс, Нью-Йорк, США

Стефан Джудекс

² Департамент биомедицинской инженерии, Университет Стони Брук, Стоуни-Брук, Нью-Йорк, США

Джанет Рубин

³ Департамент медицины, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США

Клинтон Т.Рубин

² Департамент биомедицинской инженерии, Университет Стоуни-Брук, Стони-Брук, штат Нью-Йорк, США

¹ Центр исследований диабета, Департамент медицины, Отдел эндокринологии, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Бронкс, Нью-Йорк, США

² Департамент биомедицинской инженерии, Университет Стоуни-Брук, Стоуни-Брук, штат Нью-Йорк, США

³ Департамент медицины, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, штат Северная Каролина, США

Abstract

Плюрипотентные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) считаются идеальными терапевтическими мишенями в регенеративной медицине, поскольку они обладают способностью дифференцироваться в соединительные ткани более высокого порядка. Возможность использования МСК для лечения заболеваний и ускорения восстановления будет в конечном итоге зависеть от лучшего понимания того, как физические и / или химические сигналы регулируют их активность, и способности экзогенных стимулов усиливать пролиферацию МСК и определять судьбу МСК.Недавнее понимание того, что остеопрогениторы костного мозга обратно пропорциональны предшественникам адипоцитов, предполагает, что их общий предшественник, MSC, будет связываться с одним клоном за счет другого. Эта взаимосвязь может способствовать фенотипу людей, ведущих сидячий образ жизни, у которых больше жира и меньше костей, и наоборот, в результате упражнений будет меньше жира и больше костей. Механическое смещение отбора клонов МСК предполагает, что физические сигналы могут влиять на количество как жира, так и костей через пути развития, а также метаболические или адаптивные пути.Принимая во внимание недавнее открытие, что механические сигналы малой величины (LMMS) подавляют развитие подкожного и висцерального жира без увеличения расхода энергии, это указывает на то, что МСК идеально позиционируются как механочувствительные элементы, имеющие центральное значение для скелетно-мышечной адаптации, но что сигналы не должны быть сильными. быть влиятельным. Смещение дифференцировки МСК механическими сигналами представляет собой уникальное средство подавления ожирения, одновременно способствуя улучшению скелета, и может обеспечить основу для безопасной, неинвазивной, нефармакологической стратегии предотвращения как ожирения, так и остеопороза, но все же однозначно — без воздействия на резидентные жировые или костные клетки.

Введение

Остеопороз и ожирение, две из самых страшных болезней в США, затрагивают более 30% населения Америки и приводят к ежегодным расходам на здравоохранение почти в 200 миллиардов долларов. (1) Остеопороз, заболевание, характеризующееся пониженной плотностью костей, является одним из наиболее распространенных возрастных заболеваний, при котором атравматические переломы серьезно ухудшают качество жизни человека. По оценкам Главного хирурга США, 50% женщин старше 65 подвержены риску перелома костей, и в течение 50 лет затраты на профилактику и лечение только этого заболевания могут превысить 250 миллиардов долларов.(1) Переходя от пожилых к молодым, консервативные оценки показывают, что 25% американских детей имеют избыточный вес, а 11% страдают ожирением; (2) оба процента значительно выше, чем всего 10 лет назад. Эта тучная популяция предрасположена к диабету 2 типа (3) и повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний и рака в течение жизни (4).

До 1994 года сахарный диабет 2 типа был необычным для детей; однако в настоящее время некоторые клиники сообщают, что до одной трети детей-подростков с диабетом страдают заболеванием типа 2 (5–7).Висцеральное ожирение и повышенный уровень свободных жирных кислот сильно коррелируют с инсулинорезистентностью (8), проблемой, которая становится еще более серьезной по мере того, как дети с избыточным весом превращаются во взрослых с ожирением (9). Факторы образа жизни, в частности отсутствие физической активности и плохое питание, являются важными целями для первичной профилактики ожирения и диабета. Исследования на взрослых показывают, что изменение образа жизни и потеря веса могут снизить инсулинорезистентность, улучшить показатели гликемического контроля и уменьшить липемию (10; 11).К сожалению, контролируемые клинические испытания, направленные на определение того, могут ли изменения образа жизни предотвратить диабет 2 типа у взрослых (12; 13), редко бывают успешными или устойчивыми среди населения США в целом, поскольку прибавка в весе и сопутствующие ему осложнения быстро возвращаются. У детей даже самые исчерпывающие интервенционные исследования, финансируемые из федерального бюджета, не дали убедительных положительных результатов (14; 15). Роль упражнений в предотвращении ожирения сосредоточена на расходе калорий, но игнорируется любая «неметаболическая» роль.В недавнем комментарии в статье Obesity (16) говорится об относительном успехе интенсивных вмешательств, связанных с физической активностью, но предполагается, что положительные результаты на самом деле частично связаны с механическая стимуляция тканей, а не метаболизм калорий.

В то время как остеопороз и ожирение привлекли большое внимание общественности, эффективные и безопасные фармакологические вмешательства в любом масштабе для любого заболевания оказались труднодостижимыми.Даже контрольный из либо остеопороз, либо ожирение оказались трудными: возможно, наиболее распространенным этиологическим фактором является «малоподвижный образ жизни», а наиболее частым вмешательством являются упражнения (17), что указывает на решающую роль механических сигналов в определении состояния костей и костей. масса жира. Но является ли эта болезненная реакция на механические сигналы совпадением или существует биологическая связь? Здесь исследуется способность механических сигналов влиять на жировой и костный фенотип, не столько с точки зрения прямого механического воздействия на резидентную популяцию жировых или костных клеток, сколько с точки зрения принятия решений их общего предшественника, мезенхимального ствола. ячейка (MSC) ().

Схематическое изображение клонального потенциала мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в костном мозге. Развитие зрелых клеток, таких как адипоциты и остеобласты, происходит через промежуточные клетки-предшественники, преостеобласты и преадипоциты. Хотя это не было полностью охарактеризовано, несколько комбинаций поверхностных маркеров были использованы для обогащения МСК, а также коммитированных, но еще не полностью дифференцированных клеток-предшественников. Процессы коммитирования и дифференцировки сложны и также недостаточно хорошо изучены, но было показано, что определенные факторы транскрипции, такие как Runx2 (кость) и PPARγ (жир), способствуют дифференцировке одного типа клеток и подавляют дифференцировку другого.

Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Количество исследований, изучающих терапевтический потенциал MSCs, быстро увеличилось в последние годы (18–20), но понимание того, что движет принятием решений в отношении этих предшественников, остается на начальной стадии. Эту трудность усугубляет конкретная идентификация in situ и ex vivo того, что на самом деле составляет популяцию МСК, является источником жарких споров, поскольку выделение стволовых клеток от их соседей оказалось разочаровывающим на основе современных гистологических и цитометрических методов.Чтобы проиллюстрировать эту точку зрения, комбинация маркеров, которые отличают как МСК, так и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) от 99,9% других клеток, находящихся в костном мозге, дает популяцию, оцениваемую в лучшем случае с чистотой 3% (21).

Для MSCs, экспрессия специфических эксклюзивных поверхностных маркеров еще не была хорошо охарактеризована, и особенности, которые категорически определяют MSCs, не описаны. Хотя клеточные популяции, полученные с помощью современных методов выделения, представляют собой по существу гетерогенные смеси нескольких типов клеток, они, безусловно, обогащены МСК (22).Неудивительно, что вопрос о том, какие факторы определяют, дифференцируется ли МСК в адипоцит, остеобласт или другой тип клеток, остается неизвестным и является предметом интенсивных исследований. Из различных сигналов, способных вызывать дифференцировку, сообщалось о различных биохимических факторах, которые обычно приводят к дифференцировке в направлении одного типа клеток с параллельным подавлением другого пути. Недавняя работа по дифференцировке остеобластов от МСК выдвигает на первый план открытие, что на решения клеточной судьбы может заметно влиять активация очень небольшого подмножества конкретной сигнальной сети, вместо того, чтобы требовать больших сдвигов экспрессии генов (23).Таким образом, даже незначительные изменения в среде MSC могут иметь драматические эффекты на фенотип.

Механическая стимуляция для индукции дифференцировки клеток

Помимо биохимических факторов, способных изменять судьбу стволовых клеток, механические сигналы становятся все более важными и взаимодействующими в определении пути дифференцировки. Механотрансдукция — это процесс, с помощью которого клетки преобразуют сигналы, вызванные физической силой, в биохимические реакции, что приводит к изменению экспрессии генов, функции и морфологии клеток и продукции внеклеточного матрикса.Этот адаптивный процесс имеет решающее значение для обеспечения соответствующих реакций на акклиматизацию и приспособление к функциональной нагрузке во многих тканях (24). Основа механотрансдукции заключается в том, что клетки образуют сети, которые связаны комплексами межклеточной адгезии, такими как адгезивные соединения, щелевые соединения или локальные паракринные сигналы (25). Эти сети способны действовать как интегрированные единицы для преобразования различных стимулов, таких как механическая нагрузка, в скоординированные реакции тканей. Неудивительно, что для передачи механического сигнала требуется взаимодействие многих сигнальных путей (25), и из-за сложности это все еще недостаточно охарактеризовано.Различные пути, такие как взаимодействия клетки с внеклеточным матриксом, цитокины, передача вторичных мессенджеров через щелевые соединения и межклеточные адгезивные соединения, позволяют клеткам передавать механические сигналы другим клеткам (26).

В качестве примера клеточной механотрансдукции в определении клонов роль механических сил в контроле адипогенеза была связана с изменениями белков внеклеточного матрикса (ЕСМ) и матриксных металлопротеиназ (27). Компоненты ECM играют важную роль в регуляции ремоделирования жировой ткани во время дифференцировки адипоцитов, путем трансляции клеточных сигналов, которые могут изменять транскрипцию гена адипоцитов во время адипогенеза (28).Примеры важности механических сигналов для костей и костного мозга освещены в следующем разделе.

Механотрансдукция в костном и костном мозге

В основе сути механотрансдукции лежит необходимость того, чтобы определенные клетки в биологической среде могли действовать как рецепторы, которые, в свою очередь, могут генерировать вторичные цитогенные сигналы, нацеленные на клетки-мишени. То, как механические факторы ощущаются в кости, составляет большой объем активных исследований с множеством различных гипотез относительно механосенсорного элемента (29; 30).Преобладает мнение, что остеоциты отвечают за обнаружение механических сигналов и реагируют, передавая сигналы эффекторным клеткам, остеобластам и остеокластам, которые модулируют фактическое формирование и резорбцию кости (31; 32). Однако механической нагрузке подвергаются не «просто» костный матрикс и клетки, заключенные в материале. Столь же сложным является множество сил, возникающих в полости костного мозга в ответ на механическую нагрузку, и включает в себя деформацию, давление, поток жидкости, электрические потенциалы и ускорение (32).Несмотря на то, что механотрансдукция клетками опорно-двигательного аппарата долгое время была в центре внимания исследований и развития технологий, способность механических сигналов влиять и изменять паттерны дифференцировки МСК была отмечена только недавно (33; 34).

Внутри взаимодействия кость / костный мозг заключена концепция «ниши» стволовых клеток, специализированного места, где располагаются и регулируются плюрипотентные клетки. Мысль о том, что полость костного мозга представляет собой такую ​​нишу, стала популярной в последние годы, поскольку эндостальная поверхность кости является основным местом регенерации костного мозга (35; 36).Несколько моделей с использованием трансгенных мышей показали, что увеличение гематопоэза происходит в сочетании с увеличением как остеобластов, так и трабекулярной кости, поскольку увеличение размера ниши необходимо для поддержки увеличения HSC (37). Было высказано предположение, что внутри этой ниши остеобласты могут играть прямую роль в функции стволовых клеток, обеспечивая поддержку HSC (38). Таким образом, способность механических сил вызывать изменения в кости и костном мозге взаимосвязаны, и, возможно, способность кости реагировать на механические сигналы может дать представление о способности клеток костного мозга реагировать.

Отсутствие механических сигналов способствует появлению жирового фенотипа

Локальное истощение костной ткани, которое происходит при старении, постельном режиме и другом сидячем образе жизни, сопровождается уменьшением механических сигналов, отражающих динамику сократимости мышц (39). Конечно, возможно, что отсутствие механического сигнала, приводящего МСК к формированию кости и / или мышц (40), позволяет дифференцировать МСК, чтобы они преимущественно передавались или по умолчанию передавались в другой клон, такой как адипоциты.Магнитно-резонансная томография (МРТ) предоставляет доказательства этой ассоциации, показывающей, что у женщин в постменопаузе в костном мозге вдвое больше жира, чем у женщин в пременопаузе, и что у женщин с низкой плотностью костного мозга больше жира в костном мозге, чем у женщин с нормальной плотностью костей ( 41). Процесс старения обычно связан с перераспределением жира из периферических депо в органы (, т.е. . Костный мозг, печень и мышцы). Причинно-следственная связь обратной связи между костью и костным мозгом не ясна, и, безусловно, другие факторы, такие как возраст, уровень активности и гормональный статус, также влияют на реакцию.Важно отметить, что применение механических сигналов к МСК в культуре может эффективно подавлять их дифференцировку в сторону адипогенеза, даже в условиях культивирования, которые явно предпочитают «жировой» путь (42). Таким образом, хотя механические сигналы обеспечивают ключевые анаболические сигналы к формированию кости, также оказывается, что отсутствие этих сигналов способствует адипогенезу. В самом деле, именно так обстоит дело с некоторыми изолированными стволовыми клетками in vitro , где в отсутствие экзогенно применяемого сигнала дифференцировки ( i.е. , химические или биофизические стимулы), по умолчанию образуются адипоциты, нагруженные липидами. (43)

Механические сигналы, управляющие костным фенотипом

Существующие модели привели к гипотезе о том, что опосредованные амплитудой параметры упражнения, такие как величина деформации (44) или плотность энергии деформации (45), имеют решающее значение для определения реакции кости и полученная морфология скелета (46). Существуют убедительные доказательства того, что резидентные костные клетки распознают и реагируют на механически генерируемые сигналы, которые стимулируют сеть остеобластов / остеоцитов (47) и ингибируют остеокластогенез (48), процесс, опосредованный деформацией тканей (49), усиленным потоком жидкости (50), интрамедуллярное давление (51) и / или потенциалы течения (52).Важно отметить, что каждый из этих физических параметров сильнее коррелирует с динамикой среды нагрузки (удар (53), скорость деформации (54) и градиенты деформации (55)), чем фактическая величина деформации, создаваемая нагрузкой.

Было продемонстрировано, что механически опосредованное ремоделирование кости демонстрирует сильную взаимозависимость величины деформации и количества циклов, так что костная масса может быть увеличена либо с помощью нескольких событий большой деформации (56), либо 100000 случаев деформации крайне низкой величины. сигналов (57), что приводит к парадигме, согласно которой структура кости в такой же степени зависит от постоянных, невысоких напряжений, возникающих во время преобладающих видов деятельности ( i.е. , стоя), как и при более редких событиях напряжения, возникающих во время напряженной деятельности (58). Хотя способность сильных деформаций приводить к образованию кости была признана в течение некоторого времени, более поздние исследования показали, что очень небольшие механические сигналы, индуцируемые с относительно высокой частотой (циклов в секунду), также могут способствовать образованию кости (59).

Взрослая самка овцы при условии кратковременного пребывания в течение 1 года (20 мин · d ⁻¹ ), низкой магнитуды (0,3 г, где 1 г — гравитационное поле Земли), высокой частоты (30 Гц, где 3 Гц — частота шага для элиты. бегун), механические сигналы реализованы 34.Увеличение плотности трабекул в проксимальном отделе бедра на 2% по сравнению с контролем (CON) (p <0,01) (59). Значительное увеличение было отмечено как в объеме трабекул (+ 32%; p <0,04), так и в количестве (+ 45%; p <0,01), параллельно с уменьшением расстояния между ними (-36%; p = 0,02) (60). Реконструкции µCT дистального мыщелка бедренной кости (61) показали на 10,6% большее содержание минералов в костях (BMC) у экспериментальных животных (p <0,05) из-за увеличения трабекул на 8,3% (p <0,01). Прочность до отказа была на 26,7% больше (p <0.05), что указывает на улучшение качества кости по сравнению с контролем. Эти результаты предполагают общую адаптацию, которая увеличивает жесткость кости и обеспечивает более равномерное распределение напряжения (62), обеспечивая доказательство того, что, как и наши результаты с кортикальной костью (63; 64), градиенты напряжения могут иметь решающее значение для адаптации кости к механическим сигналам. . Благодаря этому стремлению к образованию кости и привлечению остеобластов из пула предшественников стало понятно, что при наличии конечного числа мезенхимальных предшественников может происходить параллельное ингибирование образования жировой ткани.

Механические сигналы подавляют фенотип жира

Принимая во внимание важность физических упражнений в борьбе с остеопорозом и ожирением, а также анаболический ответ скелетной системы на механические сигналы малой величины (LMMS), мы предположили, что механические сигналы, анаболические для костей, будут в параллельно ограничить производство жира у растущего животного. Сорок 7-недельных мышей-самцов C57BL / 6J (B6) на нормальной диете были рандомизированы в группы LMMS или CON. В течение 15 недель мышей LMMS подвергали 15 мин ^-1 при 90 Гц, 0.4g _p-p сигнал. В 12 недель (возраст 19 недель) in vivo CT показал, что объем торсального жира у мышей LMMS был на 27,4% ниже, чем у CON (p = 0,008;). Напротив, общий безжировой объем туловища (общий объем за вычетом жира и костей) был одинаковым для LMMS и CON (p = 0,7), в то время как безжировой объем по отношению к массе тела был на 5,0% больше при LMMS, чем CON (p = 0,01). .

Продольная (вверху) и поперечная (внизу) µКТ-реконструкция содержания абдоминального жира через туловище контрольной (слева) и LMMS (справа) мыши B6, выполненная in vivo через 12 недель с использованием параметров КТ-сигнала, специфически чувствительных к толстый.После 12 недель ежедневной 15-минутной LMMS жир в туловище был на 27% ниже, чем в контрольной группе. Воспроизведено из Proc Natl Acad Sci U S A . 2007 6 ноября; 104 (45): 17879-84.

Данные об объеме жира, полученные из in vivo CT, рассчитанный объем жира был подтвержден относительно веса рассеченных жировых подушечек, собранных после умерщвления через 15 недель (возраст 22 недели), в которых у мышей LMMS было на 26,2% меньше эпидидимальной функции (p = 0,01) и на 20,8% меньше подкожного жира (p = 0,02), чем у мышей CON. Еженедельный прием пищи LMMS (26.4g · w ^-1 ± 2,1) и CON (27,0 г · w ^-1 ± 2,1) были по существу идентичными. Отсутствие корреляции между потреблением пищи и общей массой тела (r ² = 0,15; p = 0,7) или объемом жира (r ² = 0,008; p = 0,6) указывает на то, что более низкое ожирение при LMMS не может быть объяснено различия в потреблении пищи.

Хотя наблюдалось небольшое снижение уровней глюкозы и инсулина натощак в группе LMMS (p = 0,07), этот результат не был значимым, что позволяет предположить, что применяемый LMMS не повлиял на функцию печени или бета-клеток.При умерщвлении триглицериды (TG, общее количество мг в ткани) в жировой ткани мышей LMMS были на 21,1% (p = 0,3) ниже, чем CON, и на 39,1% ниже в печени (p = 0,02). Общее количество неэтерифицированных свободных жирных кислот (NEFA, общее количество ммоль в ткани) в жировой ткани было на 37,2% ниже у мышей LMMS по сравнению с CON (p = 0,01), в то время как NEFA в печени мышей LMMS было на 42,6% ниже (p = 0,02). Многочисленные исследования показали, что дислипидемия может оказывать серьезное негативное влияние на метаболизм, рост и развитие — в частности, накопление внутриклеточных липидов и внутримышечных липидов тесно связаны с инсулинорезистентностью — и считается лучшим предиктором будущего развития инсулина. сопротивление (65).Способность подавлять расширение жировой ткани с помощью механических сигналов, а также ограничивать выработку NEFA и триглицеридов предполагает, что механический подход к ограничению ожирения также может улучшить дислипидемию.

LMMS подавляет ожирение, влияя на пути дифференцировки МСК

Исследования трансплантатов костного мозга, в которых GFP-меченный костный мозг вводили мышам-реципиентам дикого типа, были использованы для определения того, было ли достигнуто подавление ожирения у растущих животных с помощью LMMS путем перенаправления кости МСК костного мозга лишены адипоцитарной судьбы (66).Для этого использовали в качестве доноров костного мозга мышей с гетерозиготным зеленым флуоресцентным белком B6 (GFP ⁺ ) (67). После имплантации мышам дикого типа (16 самцов мышей B6 дикого типа, возраст 8 недель) судьбу стволовых клеток костного мозга можно отслеживать по продукции GFP. Через одну неделю после трансплантации половину мышей-реципиентов GFP ⁺ подвергали LMMS (как указано выше), а половину использовали в качестве ложно нагруженного CON. Унесенные через 6 недель, жировые подушечки придатка яичка и костный мозг большеберцовой кости были взяты для исследования.FACS-анализ проводили на эпидидимальной жировой подушке и костном мозге, выделенных от реципиентов GFP ⁺ , с использованием сигнала флуоресценции GFP. Чтобы помочь идентифицировать МСК в общей популяции клеток костного мозга, клетки метили антигеном стволовых клеток-1 (Sca-1), антигеном, обычно связанным с гемопоэтическими клетками, но недавно было показано, что он экспрессируется на клетках с адипогенными, хондрогенными и остеогенными свойствами. потенциал (68).

Было показано, что соотношение адипоцитов GFP ⁺ в жировой подушке придатка к МСК GFP ⁺ было на 19% ниже (p <0.02) у животных, подвергнутых LMMS, относительно контроля (CON: 101,2% ± 16,1%; LMMS 82,0% ± 11,1%). Данные, указывающие на снижение приверженности адипоцитам, были подтверждены весом эпидидимальной жировой подушечки после 6 недель LMMS, который был на 12,2% меньше, чем CON (p <0,03).

Краткость сигнала и то, что нагрузка, присущая LMMS, низкая по сравнению даже с нормальной нагрузкой на вес, предполагает, что ингибирование адипогенеза было достигнуто другими путями, а не повышением метаболической активности, опосредованным физической нагрузкой.Принимая во внимание данные, полученные от этих мышей-реципиентов GFP ⁺ , эти результаты показывают, что снижение ожирения в результате LMMS достигается за счет влияния на дифференцировку предшественников адипоцитов, МСК, удерживая их от адипоцитарного клона, и, если параллельно, за счет увеличения в безжировой массе (см. ниже), что привело их к скелетно-мышечной судьбе. Несмотря на подобную диету, LMMS сдерживала набор жира, «просто» избегая образования адипоцитов.

Если процессы образования жира и костей обратно связаны, это должно быть очевидно при одновременной оценке обеих систем; Улучшение качества опорно-двигательного аппарата также может непосредственно служить эффективной мерой для предотвращения ожирения (65; 69).Чтобы оценить эффективность сигнала LMMS в ответ на модель ожирения (вызванного диетой), молодых взрослых (7-недельных C57 / BL6) мышей-самцов кормили диетой с высоким содержанием жиров (45 ккал% жира) и рандомизировали в одну из групп CON или группы, обработанные LMMS. В 12 недель (возраст 19 недель) ни прирост массы тела, ни среднее еженедельное потребление пищи существенно не различались между группами LMMS или CON (CON весил 32,9 ± 4,2 г, в то время как мыши LMMS были на 6,8% легче при 30,7 ± 2,1 г. ; p = 0,15). TG и NEFA, измеренные в плазме, эпидидимальной жировой ткани и печени, были ниже при LMMS по сравнению с CON.Уровни ТГ в печени снизились на 25,6% (p = 0,19) у животных с LMMS, при этом одновременно произошло снижение уровней NEFA на 33,0% (p = 0,022). Отражая снижение жировой нагрузки, уровни адипокинов натощак были снижены при LMMS. По сравнению с CON, уровни циркулирующего лептина были снижены на 35,3% (p = 0,05), адипонектина на 21,8% (p = 0,009) и резистина на 15,8% (p = 0,26). На уровни циркулирующего сывороточного остеопонтина (-7,5%, p = 0,41) и остеокальцина (-14,6%, p = 0,22) механические сигналы существенно не влияли.Таким образом, поскольку сигнал предотвращает образование адипоцитов, общее метаболическое состояние животного кажется улучшенным в результате стимуляции LMMS.

На основе недавно разработанной методологии, позволяющей пространственно разделить жировую ткань на подкожные и висцеральные жировые отложения у мелких животных с помощью микрокомпьютерной томографии с низким разрешением () (70; 71), далее было замечено, что висцеральное ожирение было более чувствительным, чем подкожное ожирение до механического сигнала. (72) Полное абдоминальное ожирение было разделено на подкожную или висцеральную жировую ткань (SAT или VAT).Животные с LMMS имели на 28,5% (p = 0,021) меньше НДС по объему и на 19,0% (p = 0,016) меньше SAT по расчетному объему. Поскольку исследователи ожирения давно отметили, что метаболический риск, как правило, выше и корреляция с висцеральным ожирением выше, чем с подкожным ожирением (73; 74), специфическое сокращение висцерального жира у этих животных обнадеживает.

(а) . Реконструированное сканирование µCT мыши, в котором можно легко идентифицировать скелет для определения интересующей области. (б) . Большая часть жировой ткани у мышей локализована в брюшной области, поскольку в грудной полости и ногах наблюдается меньшее преобладание (жировой) ткани низкой плотности. (с) . Чтобы количественно определить объем жира в этих различных отделах тела, ткани разной плотности были разделены и классифицированы как жир (желтый), мышечная масса (красный) или кости (белый). г. . Репрезентативные изображения трех разных животных с низким, средним или высоким ожирением, с примененным порогом, специфичным для жира.Подкожный жир показан серым цветом, висцеральный жир — красным. Воспроизведено из Med Eng Phys . 2009 г., 31 (1): 34–41 с разрешения Elsevier Limited.

В этих исследованиях важно отметить, что реальная мощность этого механического сигнала, особенно в отношении смещения дифференцировки МСК, будет иметь место, когда существует наибольшая популяция клеток, «доступная» для воздействия. Таким образом, можно легко утверждать, что наиболее важным моментом для стратегий механической нагрузки является молодость субъекта, и поэтому наиболее актуальной целью должно быть предотвращение, а не лечение потери костной массы и предотвращение ожирения, а не лечение. ожирения.

Как свидетельствует подавленное влияние физических упражнений на большие изменения МПК у пожилых людей, мы подозреваем, что реальная сила метода воздействия на дифференцировку МСК проявляется в периоды, когда имеется готовый запас недифференцированных клеток в «нейтральных» окружающая среда, на которую нужно воздействовать. Пожилые люди со значительным количеством жира в костном мозге попадают в своего рода петлю положительной обратной связи, когда присутствующий жир выделяет в местную среду факторы, которые препятствуют развитию костей, одновременно способствуя выработке дополнительного жира.Тем не менее, также возможно, что «все» вмешательства, основанные на физическом или химическом воздействии, имеют большее влияние на молодых, чем на старых, именно по этой причине: в первые годы существует больше клеток, на которые можно воздействовать, чем в последние годы. Конечно, если механическое (или другое) вмешательство в конечном итоге замедлит прогрессирование костного мозга в сторону жира, возможно, фармакологические вмешательства также будут более успешными, поскольку потенциальные популяции клеток, доступные для ответа, будут намного больше.

Механические сигналы на клеточном уровне

Хотя известно, что деформации матрикса на два порядка ниже пиковых функциональных деформаций в кости являются анаболическими (75; 76), средства, с помощью которых такие LMMS вызывают образование кости, неясны.Матричные деформации менее 0,001% возмущают клетки менее чем на один ангстрем, деформация, per se , но та, которая вряд ли распознается клетками (77; 78). Скорее, побочные продукты деформации матрикса ( т.е. ., Напряжения сдвига, вызванные потоком жидкости, потенциалы потока, сопротивление жидкости перицеллюлярным процессам) или, возможно, усиленный транспорт питательных веществ, могут способствовать реакции клетки на механические сигналы (32; 79).

Вместо зависимого от деформации матрикса пути механотрансдукции частотная чувствительность адаптивной системы кости указывает на более фундаментальный путь, посредством которого физические сигналы взаимодействуют с клетками в ткани.Физическое ускорение клетки может представлять собой общий сигнал, который может передавать физические проблемы, изменяя внутриклеточные цитоскелетные отношения (80–82). Таким образом, возможно, что механизм, с помощью которого МСК воспринимают механические сигналы, основан на ускорении и замедлении клетки, а не на искажении субстрата. Следовательно, клетки могут реагировать на LMMS, несмотря на фактическое отсутствие деформации матрикса (83–85) через ускорения / замедления клетки, вызывающие противофазное движение по отношению к привязанному ядру, достаточное для активации биологической реакции (85).

Кроме того, другие физические сигналы, такие как импульсные электромагнитные поля или импульсный ультразвук низкой интенсивности (LIPUS), могут оказывать аналогичные эффекты на костную и жировую ткань, основанную на аналогичных путях механотрансдукции. Существует множество доклинических и клинических доказательств того, что ультразвук в целом и сигнал, используемый в устройстве звукового ускоренного сигнала заживления перелома (SAFHS), в частности, ускоряют заживление перелома, катализируя ряд гипотез относительно каскада событий и эффекторные клетки.Потенциально популяция МСК, которая рекрутируется в место перелома, может быть дополнительно стимулирована к пролиферации и дифференцировке с помощью LIPUS.

Преобразование механического сигнала в биологический ответ

Доказательства того, что химические и физические сигналы влияют на дифференцировку МСК в направлении остеобластов по адипоцитарному клону, растут. Например, проникновение МСК в клон адипоцитов продвигается за счет экспрессии и действия PPARγ, который, когда он отсутствует или присутствует в единственной копии, обеспечивает усиленный остеогенез (86).Стимуляция PPARγ МСК в направлении отбора адипогенного клона достигается, по крайней мере частично, за счет ингибирования канонической передачи сигналов Wnt (87), пути, критически важного для входа МСК в остеогенный клон и расширения пула остеопрогениторов (88). Также был продемонстрирован реципрокный эффект передачи сигналов β-катенина на выбор клонов остеобластов / адипоцитов с помощью МСК, где фенотип с высокой костной массой, обусловленный конститутивно активированным сигналом Lrp5 / Wnt, сопровождается снижением содержания жира в костном мозге (89).Если рассматривать в контексте чувствительности кости к механическим сигналам, известно, что такие факторы, как деформация и сдвиг, усиливают функцию костных клеток, ускоряя дифференцировку по остеогенному пути (90), способствуя активности остеобластов (91), а также подавляя резорбцию кости ( 49). Действительно, активация и ядерная транслокация β-катенина (92; 93) происходит в течение нескольких минут после введения механических сигналов. Активация β-катенина зависит от способности штамма инактивировать GSK3β, что позволяет увеличить пул β-катенина, который может быть активирован (94), что приводит к усилению дифференцировки остеобластов и большей приверженности костно-мышечной системе.

Критическая роль β-catenin в раннем выборе линии остеопрогенитора и способность механических сигналов активировать клеточный β-catenin, вызывает вопрос о том, могут ли механические сигналы влиять на дифференцировку остеобластов на очень ранних стадиях. Первичные стволовые клетки костного мозга, подвергнутые ежедневной механической нагрузке, экспрессируют маркеры костей в два раза чаще, чем клетки, лишенные деформации (42). Постепенное снижение как активного, так и общего β-катенина сопровождало адипогенную трансформацию МСК, но механические сигналы полностью предотвращали такое снижение β-катенина и тем самым ограничивали экспрессию как PPARγ, так и адипонектина (95).В соответствии с эффектами деформации на дифференцированные костные клетки (94), механическое сохранение клеточных уровней β-катенина зависит, по крайней мере частично, от способности штамма инактивировать GSK3β. Было высказано предположение, что в состоянии «неиспользования» — или в отсутствии напряжения — активный GSK3β допускает адипогенез, нацеливая β-катенин на деградацию, и что механические факторы, через различные проксимальные эффекторы, в первую очередь нацелены на β-катенин, чтобы регулировать выбор клонов МСК. склонны к остеобластогенезу, а не к адипогенезу.

Помимо воздействия механических сигналов на клеточную дифференцировку, мы показали, что сигнал LMMS также увеличивает количество предшественников стволовых клеток in vivo . Проточно-цитометрические измерения общего костного мозга в наших исследованиях на животных (как для животных с нормальной пищей, так и с животными с высоким содержанием жиров) дали неожиданный результат: 6 недель лечения LMMS значительно увеличили общую популяцию стволовых клеток (включая HSC и MSC) по сравнению с контролем. LMMS-стимулированные животные демонстрировали 37.2% (p = 0,024) увеличение количества стволовых клеток по сравнению с фиктивными животными с CON на основании экспрессии Sca-1. МСК, представленные клетками, положительными как по Sca-1, так и по фактору предипоцитов-1 (Pref-1), составляли гораздо меньший процент от общего числа клеток. Выявленные таким образом животные, получавшие LMMS, имели увеличение специфических МСК на 46,1% (p = 0,022) по сравнению с CON (). Хотя механизм все еще изучается, эта механическая модуляция популяций стволовых клеток и потенциально их пролиферативной способности представляет собой уникальную терапевтическую мишень для регенеративной терапии тканей.

Точечные графики репрезентативной плотности из экспериментов проточной цитометрии показывают способность LMMS увеличивать количество стволовых клеток в целом (одиночный положительный Sca-1, верхний квадрант) и МСК в частности (положительный результат Sca-1 и Pref-1, верхний квадрант). правый квадрант). Красный, высокая плотность клеток; синий, низкая плотность клеток. По сравнению с контрольными животными (A) LMMS увеличивает количество стволовых клеток в костном мозге животных LMMS (B). Фактическое увеличение общего количества стволовых клеток костного мозга (С) и количества МСК (D) рассчитывали как процент положительных клеток / общее количество клеток для фракции клеток, показывающей наиболее интенсивное окрашивание.Воспроизведено из J Bone Miner Res 2009; 24; 50–61 с разрешения Американского общества исследований костей и минералов.

Резюме

Очевидно, что взаимодействие между костью и жиром является сложным и сильно зависит от множества факторов, включая генетические, биохимические и механические факторы, которые координируют общее взаимодействие и результирующий фенотип. Фенотипический ответ, измеряемый количеством жировой и костной ткани, а также биохимические изменения, измеряемые в различных органах, включая печень, несомненно, являются результатом более сложных взаимодействий, чем те, которые исследуются в настоящее время.В частности, необходимо дополнительно оценить роль сигналов, исходящих из других клеточных источников со специфичностью в отношении МСК, адипоцитов и / или остеобластов, как в качестве факторов, способствующих ответу LMMS, так и в качестве результатов стимуляции. Однако ясно то, что растущая распространенность остеопороза и ожирения и связанные с ними расходы представляют собой серьезную проблему для здоровья. Кроме того, для людей с ожирением избыточное ожирение фактически подвергает их риску развития множества дополнительных заболеваний, таких как диабет, сердечно-сосудистые заболевания и рак.Фармакологические методы лечения обоих видов имеют ограниченный успех и сопряжены с рядом рисков. Вместо того, чтобы просто исследовать методы лечения скомпрометированного состояния после развития болезни, общепризнано, что особое внимание следует уделять первичной профилактике. Таким образом, фундаментальное понимание некоторых взаимодействующих факторов, которые управляют дифференцированным развитием стволовых клеток в костей или жировой ткани, дает надежду на открытие новых стратегий профилактики и лечения (2).Способность механических сигналов влиять на дифференцировку МСК и разрушать формирование адипоцитов МСК в сторону формирования более здоровых тканей (, то есть , кости или мышцы), обещает ограничить общий прирост жировой ткани за счет развития, а не метаболических путей.

Способность LMMS увеличивать костную ткань при уменьшении жира связана с обычными стволовыми клетками-предшественниками, из которых дифференцируются остеобласты и адипоциты. Хотя ранее наблюдалась обратная взаимосвязь между костной и жировой тканями, теперь мы показываем, что LMMS увеличивает дифференциацию костей за счет уменьшения дифференциации жира, создавая обратную связь между ожирением и остеопорозом в процессе развития.Показано на реконструированных изображениях µCT, полученное LMMS животное (справа) показано в сравнении с имитацией CON (слева) соответствующего возраста. Светло-серый цвет представляет собой кость, прозрачный серый — подкожный жир, красный — висцеральный жир. Увеличение количества жира у животного имеет тенденцию накапливаться во внутреннем (а не подкожном) отделе и увеличивает окружность животного без значительного влияния на длину скелета.

Сноски

Конфликт интересов: Dr.Луу, доктор Пессин, доктор Джудекс и доктор Клинтон Рубин сообщают, что они подали предварительные патенты в USPTO на способность механических сигналов контролировать судьбу стволовых клеток и модулировать метаболические нарушения; Доктор Клинтон Рубин также является основателем Juvent Medical, Inc. Доктор Джанет Рубин: сообщений не поступало.

Ссылки

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Механический сигнал влияет на развитие каст социальной осы

U.S. Forest Service
Забота о земле и обслуживание людей

Министерство сельского хозяйства США

1. Механический сигнал влияет на развитие каст социальной осы

   Автор (ы): Саинат Сурьянараянан; Джон К. Хермансон; Роберт Л. Жанна
   Дата: 2011
   Источник: Текущая биология. Vol. 21, нет. 3 (8 февраля 2011 г.): стр. 231-235.
   Серия публикаций: Научный журнал (JRNL)
   PDF: Скачать публикацию (184.16 KB)
   
   Описание Понимание ближайших механизмов развития каст в эусоциальных таксонах может показать, как социальные виды произошли от одиночных предков. У ос Polistes текущая парадигма утверждает, что различное количество пищи на личиночной стадии вызывает расхождение каст рабочих и гинек (потенциальных маток). Но сам по себе уровень питания не может объяснить, как быстро развиваются первые несколько самок, рожденных в колонии, но при этом имеют небольшие размеры тела и рабочие фенотипы.Здесь мы приводим доказательства того, что механический сигнал смещает касту в сторону рабочего фенотипа. У Polistes fuscatus сигнал принимает форму барабанного боя усиков (AD), при котором самка синхронно трепещет своими антеннами на краях ячеек гнезда, скармливая личинкам добываемую жидкость. Частота возникновения AD высока в начале цикла колонии, когда выращивают личинок, которым суждено стать рабочими, и низка в конце цикла, когда выращивают гинекологов. Подвергание предназначенного гинекологу выводка симулированным вибрациям с частотой AD привело к тому, что они превратились во взрослых особей с пониженными жировыми отложениями, что является рабочей чертой.Это говорит о том, что AD влияет на траекторию развития личинок, подавляя физиологический элемент, необходимый для запуска диапаузы, гинекологической особенности.
   Примечания к публикации
   • Мы рекомендуем вам также распечатать эту страницу и прикрепить ее к распечатке статьи, чтобы сохранить полную информацию о цитировании.
   • Эта статья была написана и подготовлена ​​служащими правительства США в официальное время и поэтому находится в открытом доступе.
   Цитата Сурьянараянан, Саинат; Хермансон, Джон С.; Жанна, Роберт Л. 2011. Механический сигнал влияет на развитие каст социальной осы. Современная биология. Vol. 21, нет. 3 (8 февраля 2011 г.): стр. 231-235.
   Процитировано
   Ключевые слова Осы, перепончатокрылые, Polistes fuscatus, сообщества насекомых, поведение насекомых, фенотип, генетика насекомых, поведение личинок, личинки насекомых, усики, барабанный язык, питание животных, биология развития, генетика развития, размер тела , диапауза, общение с животными, каста
   Связанный поиск

   ---

   XML: Просмотреть XML

Показать больше

Показать меньше

https: // www.