Site Loader

Содержание

Какими бывают слуховые аппараты

Слуховой аппарат — электроакустический звукоусиливающий прибор индивидуального пользования. Его основное назначение — преобразование сигнала, создаваемого источником звуковой информации, таким образом, чтобы этот сигнал смог быть воспринят слабослышащим человеком с достаточно высокой степенью слухового ощущения. Для этого слуховой аппарат усиливает звуковые сигналы, а также изменяет их динамические и частотные характеристики в соответствии со степенью и характером нарушения слуха.

В связи с многообразием функций слуховых аппаратов существует несколько вариантов их классификации. Любой слуховой аппарат рассматривается с разных точек зрения и находит свое место в каждой из классификаций.

По способу обработки сигнала слуховые аппараты делятся на два типа: аналоговые и цифровые.

Аналоговый слуховой аппарат состоит из трех основных частей: микрофона, электронного усилителя и телефона. Микрофон воспринимает механические звуковые колебания и преобразует их в аналоговые электрические сигналы, которые подает в усилитель. Там они усиливаются и передаются на телефон, который превращает усиленные электрические сигналы вновь в звуковые колебания и подает их в ухо.


Цифровой слуховой аппарат  дополнительно преобразует аналоговые сигналы в цифровые, после чего обрабатывает их с помощью компьютерной технологии. Вместо усилителя он имеет интегральную электронную схему, состоящую из трех элементов.

Аналоговый сигнал из микрофона поступает в аналого-цифровой преобразователь,  который преобразует электрические сигналы в цифровой вид — двоичный код, как это происходит при записи на компакт-диск. (В новейших моделях слуховых аппаратов уже появились цифровые микрофоны, исключающие эту операцию). Далее сигнал поступает на цифровой сигнальный процессор,  крохотную компьютерную микросхему. Она обрабатывает цифровые сигналы, то есть усиливает их и изменяет их характеристики в зависимости от индивидуальной потери слуха. После этого цифро-аналоговый преобразователь вновь превращает цифровой сигнал в аналоговый и посылает его на телефон.

Цифровые технологии, бурно развивающиеся в последнее время, позволили достигнуть невиданных ранее возможностей электроакустической коррекции слуха. Крошечный микрочип обладает быстродействием самых современных компьютерных процессоров, что позволяет реализовать очень сложные и высокоэффективные алгоритмы обработки звука. Фактически цифровой СА можно назвать «разумной слуховой системой» и даже «слуховым компьютером». Он «умеет» отличать речь от шума, выделяя речевой сигнал и усиливая его при одновременном подавлении шумового сигнала, что значительно облегчает понимание речи в шумной обстановке. Он может быть очень точно настроен в соответствии с индивидуальной потерей слуха, поскольку его частотный диапазон разделен на несколько частотных каналов, в каждом из которых проводится независимая настройка параметров. Цифровой аппарат имеет комфортное звучание, приближенное к естественному, благодаря практически полному отсутствию искажений и собственных шумов. Наконец, он устойчив к воздействию электромагнитных полей, что позволяет в условиях активной современной жизни без помех пользоваться мобильным телефоном и компьютером.

По способу настройки слуховые аппараты также делятся на два типа.

Непрограммируемый слуховой аппарат настраивается вручную, при помощи отвертки и регуляторов (триммеров), а громкость звучания по мере необходимости регулирует сам владелец посредством регулятора громкости.

Программируемый слуховой аппарат подключается через кабель к компьютеру и настройка осуществляется в цифровом виде, что обеспечивает более точное ее соответствие индивидуальным особенностям слуха. Аппарат может сохранять и изменять запрограммированную настройку. Большинство программируемых слуховых аппаратов могут иметь две и более слуховые программы с разными настройками: для прослушивания речи в шумной обстановке, для прослушивания музыки, программу комфортного слуха и пр.

Существует еще одна вспомогательная классификация слуховых аппаратов: по способу усиления они делятся на линейные и нелинейные.

Линейный слуховой аппарат  — аппараты этого типа усиливают входные сигналы независимо от их уровня (громкости) на одну и ту же величину, зафиксированную при помощи регулятора усиления. В линейных аппаратах с выходным уровнем звукового давления, превышающим 130 дБ, предусматривается регулятор ограничения выходного уровня (пик-клиппирование), который вводится в действие при восприятии пользователем дискомфортной громкости звуков.

Нелинейный слуховой аппарат — коэффициент усиления этих аппаратов, имеющих функцию автоматической регулировки усиления (АРУ или компрессия) зависит от уровня входного сигнала. До тех пор, пока уровень входного сигнала не достигнет определенной величины, называемой порогом срабатывания АРУ, коэффициент усиления остается постоянным, как у линейного аппарата. При превышении входным сигналом порога срабатывания АРУ, который устанавливается слухопротезистом в соответствии с индивидуальной потерей слуха, коэффициент усиления аппарата снижается. При этом происходит сжатие (компрессия) динамического диапазона выходных сигналов (для протезирования сенсоневральной тугоухости с ФУНГом).

По способу звукопроведения слуховые аппараты разделяются на два вида: костной и воздушной проводимости.

Слуховой аппарат костной проводимости — применяется для протезирования только кондуктивных потерь слуха. Его телефон выполнен в виде костного вибратора, который помещается за ухом и плотно прилегает к сосцевидному отростку. На выходе усиленный сигнал преобразуется не в звуковой, а в вибрационный.

Слуховой аппарат  воздушной проводимости — используется для протезирования всех видов потерь слуха. Звук с телефона передается через ушной вкладыш, который помещается в слуховой проход (см. выше).

Конструктивно (по месту ношения) слуховые аппараты разделяются на четыре вида: заушные, внутриушные, карманные и очковые.

Внутриушной слуховой аппарат полностью размещается в слуховом проходе. Все электронные компоненты находятся в корпусе аппарата, который изготавливается индивидуально, в соответствии с анатомическим строением уха владельца. Основное достоинство аппарата заключается в его малозаметности и в том, что отверстие приема звука располагается внутри ушной раковины, то есть там, где это предусмотрено природой.

В классификации внутриушных аппаратов выделяют аппараты внутриканального типа, которые располагаются глубоко в слуховом проходе, не закрывая полость ушной раковины. Самый маленький аппарат CIC (с английского -«полностью внутри канала»), размещается у барабанной перепонки и снаружи практически не виден.

Карманный слуховой аппарат состоит из прямоугольного корпуса, в котором расположены микрофон, усилитель и источник питания. Телефон карманного аппарата при помощи шнура соединяется с корпусом и помещается в ухо вместе с вкладышем. Карманный слуховой аппарат, в отличие от других конструкций, может иметь максимальную мощность, так как микрофон и телефон  и телефон находятся на значительном расстоянии, что предотвращает возникновение акустической обратной связи.

Очковый слуховой аппарат — аппарат, компоненты которого вмонтированы в дужку очков. В очковом слуховом аппарате костной проводимости телефон (вибратор) расположен на внутренней стороне дужки так, чтобы при одевании очков обеспечивалось его надежное прилегание к сосцевидному отростку (мастоиду).

Заушный слуховой аппарат помещается за ушной раковиной. К нему с помощью звукопроводящей трубочки присоединен ушной вкладыш, который вставляется в слуховой проход. Он проводит звук в ухо и обеспечивает фиксацию аппарата. Заушный слуховой аппарат обеспечивает большее усиление и предоставляет дополнительные технические возможности по сравнению с внутриушным слуховым аппаратом.

На рисунке 1 представлен внешний вид заушного слухового аппарата с наиболее распространенными названиями его составных частей:

       Рис. 1. Внешний вид слухового аппарата     



1) Корпус.
2) Крышка.
3) Держатель элемента питания (обойма, батарейный отсек).
4) Переход (рожок, звуковой крючок).
5) Регулятор громкости (регулятор усиления, оперативный регулятор).
6) Регуляторы настройки (триммеры, неоперативные регуляторы) — могут находиться с внутренней стороны слуховые аппараты.

7) Переключатель режимов (включение-выключение).
8) Звукопроводящая трубочка.
9) Стандартный ушной вкладыш, он же звуковод.

Ушной вкладыш является неотъемлемой частью заушного слухового аппарата. От него во многом зависит успех слухопротезирования. Ушные вкладыши бывают стандартные и индивидуальные, изготавливаемые по форме уха пациента. Индивидуальный вкладыш имеет ряд преимуществ перед стандартным: его форма и размеры точно соответствуют особенностям анатомии слухового прохода, что обеспечивает герметичность и надежную фиксацию в ухе. Изготовление вкладыша любой формы, различных диаметров звукопроводящего и вентиляционного отверстий существенно влияет на частотную характеристику слухового аппарата. Наличие во вкладыше вентиляционного отверстия (при потере слуха не более 80 дБ) способствует также «проветриванию» уха и предотвращает скапливание конденсата.
Без использования индивидуального вкладыша невозможно достичь успешного слухопротезировния.

Пресс-центр – АО «ВНИИ «Сигнал»

Работник ВНИИ «Сигнал» занесен на областную «Галерею Славы»

Губернатор Владимир Сипягин утвердил список организаций, передовиков и новаторов производства, представителей творческой интеллигенции и работников организаций социальной сферы Владимирской области для занесения на региональную «Галерею Славы» по итогам 2020 года. Туда вошли 10 организаций и предприятий Владимирской области, а также 30 специалистов в различных отраслях экономики и социальной сферы, среди которых монтажник радиоэлектронной аппаратуры и приборов ВНИИ «Сигнал» (входит в холдинг НПО «Высокоточные комплексы» Госкорпорации Ростех, член Владимирского регионального отделения СоюзМаш России) Денис Тувыкин.

Работать в «Сигнал» Денис пришел сварщиком в 1998 году, позднее перешел на монтажный участок. За несколько лет смог повысить свой профессиональный разряд до максимального, получить личное клеймо качества.

«Работа интересная, всегда что-то новое узнаешь. А еще важно, что здесь отзывчивый и профессиональный коллектив. В «Сигнале» работает моя жена, отец и двоюродный брат», — рассказывает Денис.

За 23 года работы Денис несколько раз получал благодарности от руководства, но эта награда имеет особое значение, ведь это большая ответственность перед коллективом и родным городом.

По словам замначальника опытного производства, начальника сборочного цеха ВНИИ «Сигнал» Михаила Розенкова, Денис всегда подходит к своей работе очень ответственно, уже подготовил несколько молодых специалистов.

«В нашем Институте регулярно создаются новые изделия. Все разработки наших конструкторов реализуют, в том числе, наши монтажники. Здесь нужны и важны уникальные навыки, как раз такие есть у Дениса», — рассказал Михаил Розенков.

Кроме «сигнальца» на областную галерею будут занесены еще 6 ковровчан. Это главный врач санатория-профилактория ОАО «Завод им. В.А.Дегтярева» Владимир Грехов, начальник цеха АО «КМЗ-Спецмаш» Владимир Кошелев, директор Ковровского транспортного колледжа Михаил Малышев, изготовитель стеклопластиковых изделий ПАО «Ковровский механический завод» Светлана Скобелева, водитель-испытатель АО «Ковровский электромеханический завод» Александр Старостин, начальник службы ремонта и обслуживания электрооборудования района электрических сетей г. Ковров АО «Объединённые региональные электрические сети» Владимир Тетерин.

Если компьютер Mac подает звуковые сигналы в процессе запуска

При возникновении определенных условий, связанных с памятью или прошивкой, компьютер Mac может подавать один или несколько звуковых сигналов в процессе запуска.

На некоторых моделях Mac эти последовательности звуковых сигналов могут воспроизводиться в начале процесса запуска, когда на экране еще нет изображения. Не следует путать их со звуком (мелодией), который может воспроизводиться при нормальном запуске компьютера Mac. 

Один звуковой сигнал каждые 5 секунд

Компьютер Mac не обнаруживает память (ОЗУ). Если вы недавно добавляли или заменяли модули памяти, убедитесь, что они установлены правильно.

Три звуковых сигнала, 5-секундная пауза, повторение

При проверке целостности памяти компьютера Mac обнаружена ошибка. Если вы добавляли или заменяли модули памяти, убедитесь, что они установлены правильно.

Три длинных звуковых сигнала, три коротких и еще три длинных

Чтобы устранить неполадку с прошивкой, компьютер Mac восстанавливает прошивку. На экране может отображаться индикатор выполнения, после заполнения которого компьютер Mac должен нормально запуститься.

Дата публикации: 

DS-T226S | Продукты | Hi.Watch

Матрица 2 Мп CMOS
Количество эффективных пикселей 1944×1092
Чувствительность 0.003 лк @(F1.2, AGC вкл.), 0 лк с EXIR-подсветкой
Скорость электронного затвора 1/25 (1/30) с ~ 1/50,000 с
Объектив 5 – 50 мм, моторизированный вариофокальный объектив
Крепление объектива Ф14
Угол обзора объектива 59.8° — 6.2°
Регулировка угла установки Поворот: 0 ° — 360 °; наклон: 0 ° — 90 °; вращение: 0 ° — 360 °
Синхронизация Внутренняя
Разрешение 1080P @25 к/с
Режим «день/ночь» Механический ИК-фильтр с автопереключением
Отношение «сигнал-шум» менее 62 дБ
HD-TVI видеовыход 1
CVBS-видеовыход 1 В p-p композитный (75 Ом/BNC)
Автоэкспозиция В помещении/ на улице/ в помещении 1/при низком освещении
AGC Поддерживается
Переключение «день/ночь» Цвет/ ч/б / расширенный
Маскирование Вкл./выкл, 8 областей
Обнаружение движения Вкл./выкл, 4 области
WDR 120 дБ
BLC Поддерживается
Особенности HSBLC, DNR,цифровой зум (62x), медленный затвор, зеркалирование, антитуман, коррекция дефектных пикселей, SMART D-ZOOM, LSC
Питание DC 12 В ± 15% / AC 24 В ± 15 % (подогрев доступен только при AC 24 В ± 15 %)
Потребляемая мощность 20 Вт макс.
Рабочие условия -40 °C…+60 °C, влажность 90% или меньше (без конденсата)
Защита IP66
Дальность действия EXIR-подсветки До 110 м, интеллектуальная EXIR-подсветка
Размеры 313.5 × 100.8 × 107.3 мм
Вес 1650 г

Пять действенных способов защитить автомобиль от угона — Российская газета

Сигнализация, как известно, далеко не единственный, и, как показывает практика, не самый эффективный способ уберечь автомобиль от угона. В нашем обзоре — еще пять действенных вариантов обезопасить свой транспорт от похитителей.

Механические блокираторы

Сегодня официальные дилеры, сторонние конторы и даже частники предлагают огромное количество противоугонных механических блокираторов. Такие устройства устанавливаются на руль, педали, тормоза, коробку передач. Все их роднит схема использования — фиксирующим компонентом выступает металлический штырь, оснащенный замком и фиксатором.

Но, к сожалению, с фиксаторами на руль, тормоза, капот и даже коробку передач воры быстро справляются, используя мощные свертки, электродрели и сабельные пилы. Или, скажем, некоторые злоумышленники вскрывают замки блокиратора методом бампинга — забивая особую болванку в замочную ячейку блокиратора и постукивая по ней.

Таким образом из большого числа моделей блокираторов могут быть рекомендованы лишь те, до которых буквально трудно добраться. В их числе, к примеру, — некоторые модели бесштыревых замков рулевого вала с механизмом открывания в удаленном от рулевой колонки месте.

Дополнительный иммобилайзер

Иммобилайзер — вполне эффективное противоугонное средство, считывающее сигнал с ключа-транспондера и разрешающее, либо запрещающее запуск двигателя. Однако с заводским иммобилайзером опытный угонщик легко справится, поскольку ему наверняка известны возможные варианты взлома штатных алгоритмов.

Поэтому специалисты рекомендуют дополнительно оснащать автомобиль нештатным иммобилайзером.

Все что нужно водителю, это носить с собой дополнительный брелок или чип-карту, при нахождении которой вблизи авто дублирующий иммобилайзер деактивируется. Хотите еще большей защиты, установите доп- иммобилайзер с «ручным управлением» — электроника в таком случае идентифицирует владельца при помощи PIN-кода, который можно будет ввести, воспользовавшись штатными кнопками.

Скрытая кнопка блокировки

Так называемые электронные «секретки» — еще один эффективный способ борьбы со злоумышленниками, нацелившимися на вашу машину.

Суть технологии состоит в «разрыве» цепи, задействуемой для запуска автомобиля. Как вариант, такой прерыватель можно «врезать» в цепь питания бензонасоса или в жгут проводов электронного блока управления двигателем.

Перед запуском мотора автовладелец должен будет нажать на клавишу, спрятанную от посторонних глаз, приложить магнитный ключ и ввести секретный код.

В противном случае при попытке зажигания произойдет блокировка устройств движения. Стандартная «секретка» состоит из выключателя (кнопка или магнитный геркон) и системы проводов для подключения к автомобилю. Кроме установки самой системы, водителю необходимо придумать специальный код, который будет состоять из нескольких нажатий кнопок в определенной последовательности.

Неоригинальные детали под капотом

Сумев вскрыть автомобиль и добравшись в подкапотное пространство, угонщик с большой степенью вероятности попытается заменить штатный блок управления двигателем (ЭБУ) на свой (так называемый «паук»).

Как предотвратить такой сценарий? Один из способов — соорудить механическую защиту ЭБУ с замком и фиксаторами. Но даже более действенный вариант — установка нестандартных разъемов вместо штатных, к которым вор рассчитывает подключится. Подойдут, к примеру, компьютерный или от автомагнитолы. Позаботьтесь только о «переходнике», который понадобится, когда, к примеру, вы повезете вашу машину на сервис.

Защита от «кодграбберов»

Согласно статистике, более 50% дорогих автомобилей сегодня угоняют с помощью специальных устройств — «кодграбберов». Такие гаджеты, как известно, перехватывают сигнал автомобильных охранных систем, а затем воспроизводят его, когда водителя уже нет поблизости. Чем проще охранная система, тем примитивнее требуется «кодграббер».

Снизить риск воровства с помощью кодграббера поможет установка сложных охранных «сигналок» с хорошо защищенным диалоговым кодом, а иногда — уникальной автосигнализации неизвестного на российском рынке производителя.

Проблемой для воров может стать, как это ни парадоксально, простейшая китайская сигнализация, с алгоритмом которой «кодграбберы» попросту не знакомы. Весьма полезна также такая функция, как автоматическая постановку машины на охрану (без нажатия на кнопку ключа-транспондера), реализованная в ряде современных моделей.

Ленинский | Администрация г. Челябинска

Ленинский район был создан в 1935 году, когда местные органы власти приняли решение об образовании в Челябинске трех районов: Ленинского, Сталинского, Кировского.

Сейчас Ленинский район расположен в юго-восточной части города и граничит на западе с Советским, на севере — с Тракторозаводским районами. Площадь Ленинского района — 75 тыс. кв.м., численность населения — 191.288 тыс. человек (по состоянию на 1 января 2018 года).

Особенностью района является то, что он создавался как военно-промышленный комплекс. Все крупные промышленные предприятия района того времени — завод имени С.Орджоникидзе, завод электромашин, ТЭЦ-1, трубопрокатный завод, завод металлоконструкций, ГП «Сигнал», кузнечно-прессовый завод, механический завод, начавшие выпускать свою продукцию именно в годы войны — сыграли заметную роль в обеспечении победы в Великой Отечественной войне. Переход всей страны на мирные рельсы после окончания войны меньше всего отразился на Ленинском районе: многие годы он развивался под грифом «секретно», основную часть его индустриальной мощи составляла оборонная промышленность.

Ленинский район и сегодня остается базой развития важнейших сфер российской экономики: машиностроения, черной металлургии, энергетики, производства стройматериалов, деревообрабатывающей и пищевой промышленности. Район занимает в городе второе место по объёму промышленного производства. Его потенциал — это 16 гигантов машиностроения, металлургии, военно-промышленного комплекса, в том числе: ПАО «Челябинский трубопрокатный завод», ОАО «Электромашина», ПАО «Челябинский кузнечно-прессовый завод», ОАО «Челябинский механический завод», АО «Челябинский завод металлоконструкций», ОАО «Сигнал». А всего в районе ведут свою деятельность более четырех тысяч предприятий и организаций, различных по численности и формам собственности.

В Ленинском районе широкая сеть учебных заведений — от дошкольных до среднего профессионального образования и высших.


 Уникальность Ленинского района ещё и в том, что на его территории находятся крупные Дворцы культуры, библиотеки, школы искусств. Каждое учреждение культуры имеет свое неповторимое лицо.

 Также Ленинский район по праву считается одним из самых спортивных в Челябинске. Регулярно физической культурой и спортом занимаются около 25 тысяч человек. Для этого созданы все       необходимые условия. На территории района действуют крупные стадионы, бассейны, свыше 50 спортивных залов, около 20 хоккейных коробок. Здесь начинали путь к золотым олимпийским медалям   звезды мирового хоккея Сергей Макаров, Сергей Бабинов и Сергей Стариков. В элиту современного российского и мирового спорта входят баскетбольный клуб «Славянка», футбольный клуб «Зенит»,   волейбольный клуб «Торпедо».

 На территории Ленинского района расположено озеро Смолино. На его берегу в 1996 году был заложен храм Утоли Моя Печали. Органично вписанный в природный ландшафт, он стал центром духовного единения людей. 

Благоустроена набережная Смолино. Здесь приятно пройтись по вымощенным дорожкам, отдохнуть, посидеть на аккуратных скамейках, выходящих к воде, где открывается красивый вид на строения города, подступающие к берегу озера.

В 2017 году благодаря поддержке Губернатора Челябинской области Бориса Александровича Дубровского завершено строительство сквера «Семейный» и благоустроена территория вокруг пруда «Девичьи слезы».

  

Глава Ленинского района — Орел Александр Евгеньевич

Администрация Ленинского района города Челябинска

Почтовый адрес: 454010, г. Челябинск, ул. Гагарина, д. 22

Телефон/факс: (351) 251-06-17

Официальный сайт: http://lenadmin74.eps74.ru

Адрес электронной почты: [email protected]

График приема граждан по личным вопросам руководителями администрации Ленинского района города Челябинска

 

Ф.И.О. должность

Время приема

Орел Александр Евгеньевич, глава Ленинского района

2-й и 4-й понедельник с 14.00 (по предварительной записи). Тел.: (351) 256-22-25

Нургалиев Зуфар Фанусович, заместитель главы Ленинского района

1-й и 3-й вторник с 14.00 до 17.00 (кабинет 205)

Вартанова Марина Борисовна, заместитель главы Ленинского района

каждый четверг с 15.00 до 17.00 (кабинет 307)

Тишина Ирина Юрьевна, заместитель главы Ленинского района

1-й и 3-й понедельник с 14.00 до 17.00 (кабинет 314)

Копейкина Мария Александровна, начальник общего отдела

каждая пятница с 13.00 до 16.00 (кабинет 308)

Евдокимов Сергей Иванович, начальник отдела благоустройства и обеспечения жизнедеятельности территории

2-я и 4-я среда с 14.00 до 17.00 (кабинет 203)

Калинина Наталья Владимировна, начальник отдела содействия развитию потребительского рынка

каждая среда с 14.00 до 17.00 (кабинет 101)

Бакшеванова Ольга Николаевна, начальник отдела экономики и финансов

каждый четверг с 10.00 до 12.00 (кабинет 313)

Трофимова Алевтина Зульфаровна, начальник правового отдела

каждый вторник с 14.00 до 16.00 (кабинет 402)

Дунаева Ирина Сергеевна, начальник отдела по культуре, физической культуре, работе с молодежью и общественными организациями

1-я среда с 11.00 до 17.00 (кабинет 210)

 

 

 

 

 

 

Принцип работы инкрементального энкодера | MegaSensor.com

Описание работы инкрементального энкодера, квадратура выходных сигналов, особенности механического сопряжения, особенности оптической и магнитной технологии.

Что такое инкрементальный энкодер?

Импульсный (пошаговый) энкодеротносится к типу энкодеров, которые предназначены для указания направления движения и/или углового перемещения внешнего механизма. Пошаговый (также именуемый инкрементный или инкрементальный) энкодер формирует импульсы, количество которых соответствует повороту вала на определенный угол. Этот тип энкодеров, в отличие от абсолютных, не формирует код положения вала, когда вал находится в покое.
Пошаговый энкодер связан со счетным устройством, это необходимо для подсчета импульсов и преобразования их в меру перемещения вала.

Конструкция инкрементального энкодера

Диск с метками оптического инкрементного энкодера

Инкрементальный энкодер (он же пошаговый энкодер) состоит из следующих компонентов: источника света, диска с метками, фототранзисторной сборки и схемы обработки сигнала. Диск пошагового энкодера подразделен на точно позиционированные отметки. Количество отметок определяет количество импульсов за один оборот. К примеру, если диск поделен на 1000 меток, тогда за 250 импульсов вал должен повернуться на 90 градусов.

Технология (оптическая и магнитная)

В настоящее время широко распространены две технологии исполнения — оптическая и магнитная.
1. В оптическом энкодере первичным датчиком сигнала является оптический диск (как на картинке выше). Количество черных/прозрачных секторов на диске определяет разрешение оптического инкрементального энкодера, также именуемое как количество меток в обороте.
2. В настоящее время становятся очень популярными магнитные энкодеры. В магнитном энкодере сигнал положения вала формируется датчиком Холла. Данная технология открывает новые возможности, например, программируемое количество импульсов в обороте, причем некоторые производители энкодеров предоставляют такую возможность (программирования) самому Заказчику, что значительно облегчает подбор энкодера для своей конкретной задачи. Так, например, стало простой задачей заменить в оборудовании вышедший из строя энкодер с «экзотическим» числом импульсов в обороте, например, 1234 вместо более привычных 1024. В оптическом энкодере такое разрешение, как упоминалось выше, возможно только при «физическом» наличии нанесенных на диск меток.

Квадратура выхода (выходы А и В)Квадратура сигналов инкрементального датчика угла поворота

Для квадратуры выхода энкодера используются два выходных канала, для того чтобы определить — вращается вал по часовой стрелке или против часовой стрелки, основанное на сдвиге фазы 90°±0° , допуск ±45° — приемлемый для спецификации сдвига фазы. Энкодер с единственным выходом (A) более известен как тахометр.

Максимальная частота ответа

Максимальная частота ответа является частотой, при которой вращающийся энкодер может дать электрический ответ. Такая частота имеет отношение к количеству выходных импульсов, на которые энкодер реагирует в секунду. Следовательно, энкодер пошагового типа должен удовлетворить следующее отношение:
(rpm/60) x (разрешение) ≤ максимальной частоты ответа.

Указатель нулевой отметки / импульс полного оборота (выход N)

В энкодере, имеющем этот выход, импульс на этом выходе появляется в каждом обороте вала. Функция показателя нуля может использоваться для сброса внешне связанного счетчика или для регистрации начальной (нулевой) позиции.

Функция оповещения Light reserve warning

Опциональная функция оповещения о снижении интенсивности (старении) светодиода подсветки считывающей матрицы энкодера.
В таких энкодерах имеется специальный выход (ножка разъема) именуемая «Light reserve warning» (в англ. документации) или «Frühwarnausgang» (в нем. документации). При снижении яркости свечения до критического уровня (когда возникает вероятность сбоя в работе энкодера) на этом выходе появляется предупреждающий положительный потенциал (например, +5V). Это позволяет своевременно принять меры и подумать о замене энкодера. Однако эта опция очень редко используется клиентами. К тому же параметры долговечности / стабильности светоизлучения светодиодов последние годы значительно улучшились в связи с чем данная опция вообще потеряла актуальность и практически больше не предлагается производителями энкодеров.

Разрешение

— это количество выходных импульсов за вращение вала.

Соединительный вал

Для механического соединения вала датчика с внешним механизмом следует использовать специальный гибкий соединитель (эластичную муфту), который предназначен для компенсации возможного биения валов, как в радиальном, так и в осевом направлении. Это позволяет резко снизить вероятность преждевременного износа подшипников вала датчика. Уже незначительный, возникший в осевом направлении вала, люфт может привести к полному электрическому отказу энкодера. Это связано с тем, что для достижения высокого разрешения, оптический диск и считывающая матрица располагаются в непосредственной близости друг от друга и минимальное осевое биение вала может привести к их механическому контакту, что в последствии приведет к разрушению нанесенных на диск меток.

Что такое механосигнализация? | MBInfo

Клетки, будь то прокариотические (одноклеточные) или эукариотические (многоклеточные), постоянно взаимодействуют со своей средой. В случае прокариотических клеток сигналы окружающей среды могут инициировать клеточные функции, такие как деление клеток, споруляцию или подвижность клеток. Эти функции обычно предназначены для выживания и воспроизводства каждой отдельной клетки.

Однако у многоклеточных организмов клетки работают в гармонии друг с другом, образуя специализированные ткани и органы, которые реагируют на сигналы окружающей среды для окончательного выживания всего организма.Например, даже в холодную погоду наши тела могут поддерживать внутреннюю температуру около 37 ° C. Это достигается за счет увеличения основной скорости метаболизма в организме за счет секреции гормонов по механизму, опосредованному гипоталамусом. Эти гормоны действуют как сигналы для клеток по всему телу, чтобы запустить механизмы, которые генерируют тепло внутри тела. Точно так же передача сигналов между клетками имеет первостепенное значение в иммунной системе. Когда нейтрофилы сталкиваются с чужеродными объектами, такими как бактериальные клетки, грибковые клетки или вирусы, цитокины секретируются в кровоток, чтобы привлечь другие иммунные клетки к месту инфекции и обеспечить надлежащий иммунный ответ.

Такая биология на «системном» уровне возможна только благодаря клеточным механизмам, которые эволюционировали для обеспечения связи между клетками. Эти механизмы могут позволить клеткам влиять на функцию своих соседних клеток или модулировать определенные свойства своего окружения. Как и многие клеточные процессы, передача сигналов должна строго регулироваться, часто с помощью других механизмов передачи сигналов.

Междугородная и местная связь

Клетки не только взаимодействуют со своим непосредственным микроокружением, но также могут обнаруживать и реагировать на сигналы, исходящие гораздо дальше.Сигнальные пути можно классифицировать в соответствии с источником сигнальной молекулы или лиганда.

В зависимости от происхождения лиганда (из той же клетки, из соседней клетки или издалека) взаимодействие рецептор-лиганд и активация сигнального пути подразделяются на четыре различных типа: аутокринный, эндокринный, паракринный и юкстакринный. Активация любого из этих путей в конечном итоге приводит к экспрессии генов.

Эндокринная передача сигналов

Эндокринная передача сигналов является примером связи на больших расстояниях между продуцирующими гормоны клетками, тканями и железами и клетками, которые экспрессируют молекулы рецепторов гормонов.Сами гормоны представляют собой небольшие молекулы или гликопротеины, которые обычно секретируются в кровоток, прежде чем распространяться по организму. Эндокринные сигналы часто исходят из головного мозга, однако другие железы и органы, включая щитовидную железу, желудок, поджелудочную железу, печень, почки и репродуктивные органы, также производят гормоны. Одним из эндокринных сигналов, которые должны проходить на большое расстояние, является сигнал фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), который отправляется из передней доли гипофиза в яички или яичники, где он стимулирует созревание половых клеток.

Паракринная сигнализация

Паракринная передача сигналов происходит между клетками, находящимися в непосредственной близости друг от друга. Здесь растворимая сигнальная молекула, секретируемая одной клеткой, диффундирует в другую клетку по соседству. Например, нейротрансмиттеры, секретируемые нейронами, диффундируют на несколько нанометров перед связыванием с рецепторами на нейронах-мишенях или мышечных клетках. Другой пример — высвобождение хемокинов нейтрофилами, которые привлекают другие клетки посредством процесса, известного как хемотаксис.

Юкстакрин сигнальный

Передача сигналов Juxtacrine происходит между соседними клетками, которые находятся в физическом контакте друг с другом.В этом случае сигнальная молекула не свободна, а вместо этого связана с мембраной клетки. Затем он может взаимодействовать с рецептором на мембране соседней клетки. Примером передачи сигналов юкстакрина является взаимодействие между рецептором notch и его лигандом «дельта». Соединения клетки-клетки, содержащие комплексы кадгерина, также работают аналогичным образом.

Автокринная сигнализация

При аутокринной передаче сигналов сигнальная молекула происходит из самой клетки-мишени. Это происходит, когда клетки экспрессируют рецепторы к лиганду, который они секретируют.Например, тромбоциты крови выделяют эйкозаноиды, которые влияют на их собственную активность. Аутокринная передача сигналов также наблюдалась во время развития эмбриона.

Как клетки общаются?

Так же, как люди обладают уникальными органами, которые позволяют нам взаимодействовать с окружающей средой с помощью пяти органов чувств, клетки также ощущают окружающую среду с помощью различных механизмов и субклеточных структур. Это позволяет клеткам производить и обнаруживать различные типы сигналов, от растворимых молекул или химикатов до электрического тока и даже механических сигналов, которые передаются посредством толчка и притяжения биомолекул.

Клетки ощущают окружающую среду с помощью различных механизмов и субклеточных структур. Это позволяет клеткам производить и обнаруживать различные типы сигналов, от растворимых молекул или химикатов до электрического тока и даже механических сигналов, которые передаются посредством толчка и притяжения биомолекул.

Электрическая сигнализация

Передача электрических сигналов ограничена только несколькими типами клеток нервной системы, такими как нейроны и астроциты. Этот высокоскоростной метод связи включает поток заряженных ионов, в частности Na +, K +, Ca2 + и Cl-, через мембрану в процессе, известном как распространение потенциала действия.Клетки, которые обеспечивают передачу электрических сигналов, обычно переплетаются с порами с низким сопротивлением, такими как щелевые переходы, которые позволяют проходить ионам и другим растворенным веществам небольшого размера между клетками. Эти ячейки часто существуют в сетях, и электрический сигнал одной ячейки быстро распространяется на соседние ячейки. Этот механизм позволяет передавать электрические импульсы по аксонам нейронов и вызывает сокращение мышц. Таким образом, постоянное биение сердца является прямым результатом электрической связи между одним миокардиоцитом и его соседями.

Химическая сигнализация

Это наиболее широко изученный метод связи между клетками и их средой. Обычно он включает связывание лиганда или сигнальной молекулы с рецептором, расположенным на плазматической мембране или рядом с ней. Во многих случаях это вызовет сигнальные каскады, в которых один белок активирует другой белок, который впоследствии активирует другой, и так далее. Этот метод передачи внутриклеточного сигнала включает множество биомолекул как липидов, так и белков.

Механическая сигнализация

Механическая передача сигналов относится к процессу, при котором сигнал запускается механической силой, такой как напряжение сдвига или притяжение / толчок, приложенное к биомолекулам. Обычно приложение такой силы вызывает конформационное изменение белка / рецептора, таким образом подвергая функциональные домены воздействию окружающей среды. Было показано, что такой механизм облегчает связывание винкулина с талином, которое происходит только при растяжении последнего [1]. Такое растяжение может запускать многие другие сигнальные механизмы в клетке, приводя к реорганизации цитоскелета и модуляции клеточной и ядерной формы, а также к экспрессии генов.Механосигналы часто могут запускать клеточные сигнальные процессы намного быстрее, чем чисто химические средства активации. Это иллюстрируется механической стимуляцией очаговых спаек в гладкомышечных клетках, в которых Src активировался менее чем за 0,3 с. Эта быстрая реакция контрастировала с медленной (12 секунд) реакцией, следующей за химической активацией [2].

Ключевые компоненты клеточной сигнализации

Есть много компонентов, которые облегчают передачу сигналов в ячейке. Хотя полный набор отдельных молекул не может быть подробно обсужден здесь, можно описать функции или роли, которые они играют.В некоторых случаях белковые компоненты могут служить рецепторами, в других случаях они могут действовать как внутриклеточные мессенджеры или они могут служить сенсорами или эффекторами.

Рецепторы

Рецепторы

— это белки, которые взаимодействуют со специфическими лигандами и передают полученные сигналы внутрь клетки. Эти белки чаще всего являются трансмембранными, с внеклеточным доменом для связывания лиганда и внутриклеточным доменом, который часто химически связан с нижележащим сигнальным путем.Связывание лиганда с внеклеточной областью рецептора часто инициирует конформационные изменения в цитозольном домене, и это инициирует серию биохимических реакций, известных как сигнальные каскады. Эти сигнальные каскады передают сигнал от одной молекулы к другой до того, как будет достигнут клеточный ответ

Рецепторы

можно условно разделить на три категории.

  1. Рецептор, связанный с G-белком (GPCR).
  2. Ионные каналы
  3. Ферментно-связанные рецепторы

Как следует из названия, GPCR связаны с мономерным или тримерным G-белком через свой цитозольный домен.Активация GPCR, которая является результатом обмена GDP на GTP в этом связанном G-белке, впоследствии активирует ряд киназ, которые, в свою очередь, способствуют событиям фосфорилирования целевых белков.

Точно так же активация ионного канала также происходит через взаимодействия с лигандом и также вызывает конформационные изменения внутри белка. Однако в этом случае белок приобретет открытую конформацию, позволяющую ионам проникать в клетку. Ионные каналы обычно транспортируют ионы определенного типа, из которых наиболее распространены Na +, K +, Ca2 + и Cl-, которые связаны с «информационным потоком» или передачей сигнала.Ионные каналы, связанные с передачей электрических сигналов, чаще всего наблюдаются в мышечных клетках и клетках мозга.

Следует отметить, что внутриклеточные рецепторы, такие как стероидные рецепторы, также имеют отношение к передаче сигналов. Эти рецепторы активируются гидрофобными лигандами, которые могут проходить через липидную мембрану и, следовательно, пассивно проникать в клетку. Газ оксида азота и стероиды, такие как эстроген, являются примерами таких лигандов.

Мессенджеры внутриклеточные

Внутриклеточные мессенджеры или вторичные мессенджеры — это промежуточные белки или небольшие молекулы, передающие сигнал от рецептора к внутриклеточным сенсорам и эффекторам.Для каждого активируемого рецептора активируются множественные внутриклеточные молекулы-мессенджеры, и поэтому говорят, что именно на этой стадии сигнал усиливается. Примеры внутриклеточных мессенджеров включают ионы кальция, ферменты, такие как аденилатциклаза, или липиды, такие как инозитолтрифосфат, и т. Д. [3] [4] [5]. Одним из ключевых суперсемейств внутриклеточных мессенджеров являются малые GTPases. Следует отметить, что эти молекулы редко функционируют в одиночку. Вместо этого каждый внутриклеточный мессенджер будет действовать в рамках более крупного сигнального пути.

Датчики и исполнительные органы

Сенсорные и эффекторные белки, которые считаются последней стадией сигнального пути или каскада, отвечают за реакцию клетки на сигнал. Они могут способствовать таким процессам, как экзоцитоз, эндоцитоз, миграция, ремоделирование актина, экспрессия генов и т. Д.

Примеры включают факторы транскрипции, которые индуцируют экспрессию генов или актин-связывающие белки, которые вызывают ремоделирование актина, миграцию клеток и т. Д.

Механизмы выключения

Ячейки не реагируют на какой-либо один сигнал непрерывно.Вместо этого многие сигнальные пути контролируются «молекулярными переключателями», которые могут выключить заданный ответ, если он станет пагубным для необходимого состояния или функции клетки. Это может быть достигнуто с помощью ряда механизмов.

Например, рецепторы могут быть десенсибилизированы к лиганду, как это обычно наблюдается для ионных каналов. Внутриклеточные сигнальные молекулы также могут быть разрушены. Это происходит, например, с липидами, такими как IP3, которые метаболизируются инозитолфосфатазами, и циклическим AMP / циклическим GMP, которые разлагаются фосфодиэстеразами.В другом механизме ионы Ca2 + перекачиваются обратно в запасы кальция с помощью насосов, таким образом восстанавливая их нормальную концентрацию в цитозоле. Эти механизмы гарантируют, что клеточный ответ контролируется путем подавления потока информации и остановки клеточного ответа даже после клеточного обнаружения данного сигнала.

Роль в болезнях

Клеточная коммуникация составляет саму основу выживания и роста клеток. Иногда эти пути могут быть изменены в результате адаптации к определенным физиологическим условиям.Например, во время физических нагрузок каналы Ca2 + модулируются таким образом, чтобы клетки сердца могли генерировать более мощные, чем обычно, сигналы Ca2 +. Точно так же во время формирования памяти в головном мозге одни синапсы устанавливаются с большей эффективностью, чем другие.

Дефектные сигнальные пути могут нарушить передачу сигнала, что в конечном итоге приводит к форме клеточного «недопонимания». Клетки могут не реагировать на лиганд или могут начать реагировать на аномально низкие концентрации лиганда.Они могут не выключить ответ вовремя или могут ответить не в то время и в неправильном месте тела.

Есть несколько причин, по которым сотовая связь не работает; дефекты сигнальных путей могут быть результатом генетических мутаций в одном или нескольких белках, участвующих в этом пути, или могут быть вызваны внешними агентами. Многие бактерии, грибки и вирусы используют сигнальные пути в своих интересах, такие как токсин холеры, который индуцирует циклическую передачу сигналов АМФ в клетках кишечника, вызывая, таким образом, диарею.Большинство заболеваний связано с дефектом по крайней мере одного сигнального пути, однако в некоторых случаях могут быть затронуты несколько сигнальных путей. Это случай рака, при котором могут быть затронуты несколько уровней клеточной коммуникации. В конечном итоге это позволяет клетке расти и размножаться в крайне неблагоприятных условиях низкого снабжения кислородом и питательными веществами.

В последние годы взаимосвязь между клеточной механикой, передачей сигналов и заболеванием стала более ясной, при этом начало многих заболеваний приписывается дефектному компоненту путей механотрансдукции клеток.Например, мышечные дистрофии — это заболевания, при которых мышцы становятся слабыми из-за мутаций в белках, которые обеспечивают механический баланс и передачу сигналов в мышечных клетках, таких как дистрофин [3] [4]. Точно так же, когда механизм обратной связи, обеспечиваемый ренин-ангиотензиновой системой, не работает, сужение или расширение кровеносных сосудов и, следовательно, артериальное давление также могут стать проблематичными, вызывая заболевания сердечно-сосудистой системы [5] [6]. Наконец, функциональный белок полицистина 1 способствует притоку кальция в почечные протоки в ответ на напряжение сдвига.В отсутствие полицистина 1 приток кальция нарушается, и в протоках могут образовываться множественные кальцийсодержащие кисты [7].

Mechanical Signal — обзор

8 Механосигналы в дифференцировке TSC

Механически чувствительные ткани, такие как сухожилия, обнаруживают и обрабатывают механические сигналы, которые передаются клетками, чтобы стимулировать биохимические пути и инициировать различные клеточные процессы, включая миграцию, пролиферацию и дифференцировку [32, 99]. Этот процесс, называемый механотрансдукцией, относится к инициированию внутриклеточного ответа силами, которые вызывают деформацию матрикса и клеток сухожилия, что, в свою очередь, приводит к усилению транскрипции генов и синтеза белка.Штаммы, наносимые извне, напрямую передаются в клетки через сенсоры, такие как интегрины, которые связывают ECM с цитоскелетом и ядром. Теноциты изменяют экспрессию интегринов в ответ на растягивающее напряжение [100]. В механотрансдукцию вовлечен ряд механизмов и сигнальных путей, которые реагируют быстрыми изменениями в миллисекундах и более длинными изменениями в минутах-часах-днях [99]. Быстрые ответы могут включать активацию различных ионных каналов, вторичных мессенджеров (например, PGE 2 ) и киназ [100].Последующие ответы включают перестройку фокальной адгезии, изменения цитоскелета, передачу сигналов киназой и активацию факторов транскрипции и трансляции. Долгосрочные изменения влияют на различные клеточные процессы, такие как деление, миграция, дифференцировка и апоптоз.

Становится все более очевидным, что механическая нагрузка влияет на распространение, самообновление и дифференциацию TSC. Однако точные механизмы, с помощью которых механические сигналы транслируются в биохимические сигналы, пока неясны.Предлагается широкий спектр сенсоров, сигнальных молекул и путей, которые способны регулировать дифференцировку TSC в сухожилиях. Например, первичная ресничка, единичное сенсорное клеточное расширение, которое присутствует в большинстве клеток, включая теноциты, играет механосенсорную роль во многих тканях, включая почки и печень [101]. Первичные реснички теперь, как известно, функционируют как хаб для различных сигнальных путей и многих путей, рецепторы которых локализованы в ресничках, таких как передача сигналов Wnt и Hedgehog, и, как полагают, они участвуют в механотрансдукции и обязательстве клонов MSC [102].Было показано, что удлинение первичных ресничек увеличивает механочувствительность клеток к механическим сигналам и было идентифицировано как биомаркер изменений клеточного гомеостаза. Первичные реснички с большим разнообразием длины были обнаружены в основном не только на теноцитах, но, возможно, также и на TSC, поскольку в предыдущих исследованиях использовались смеси клеток [14,103]. Клетки сухожилий-реснички удлиняются в отсутствие механической нагрузки и адаптируют свою длину в ответ на различные условия механической нагрузки, а длина ресничек в клетках сухожилий зависит от механических сигналов, таких как сила и деформация внеклеточного матрикса [14,104].Отклонение in situ клеток-ресничек сухожилий за счет растягивающей нагрузки подтверждает концепцию, что реснички участвуют в механоответе клеток сухожилий [105]. Первичные реснички в сухожильном пучковом матриксе (FM) и эндотеноне или межпучковом матриксе (IFM) по-разному реагируют на депривацию стресса, при этом удлинение больше в IFM, что связано с большей потерей биомеханической целостности в этой области [104].

Различные сигнальные молекулы, такие как факторы транскрипции и роста, индуцируют и регулируют дифференцировку TSC в теноциты.Механическая нагрузка и экспрессия генов, выработка факторов роста и синтез коллагена в сухожилиях тесно связаны, хотя причинно-следственная связь еще не определена. Факторы роста, такие как члены суперсемейства TGF-β и GDF-5, и некоторые важные факторы транскрипции, включая Mkx и Egr1 / 2, идентифицированы как основные регуляторы дифференцировки TSC в теногенные клоны в сухожилиях [15]. Два сигнальных пути, TGFβ-SMAD2 / 3 и FGF-ERK / MAPK, как полагают, в основном ответственны за механотрансдукцию в сухожилиях [2,106].Потенциальные анаболические эффекты механического растяжения на физиологическом уровне в теноцитах человека вызываются снижением двух основных коллагеназ (MMP-1 и MMP-13), сопровождаемым увеличением Col1a1, возможно, посредством механизма передачи сигналов TGF-β [107].

Ирокез способствует теногенезу мезенхимальных стволовых клеток посредством активации сигнального пути TGF-β [108,109]. Подобный путь может также контролировать теногенез в TSC. Фактически, TNF-α и TGF-β способствуют дифференцировке и пролиферации TSC in vitro [110].Экспрессия теногенных / остеогенных маркеров (Scx, Tnmd, Col1a1, Runx-2 и Alpl) и пролиферация значительно усиливаются после одновременной или последовательной обработки TSC TGF-β1 и TNF-α. Сигнальные пути TGF-β и BMP сильно активированы, поскольку Smad2 / 3 и Smad1 / 5/8 сильно фосфорилируются после лечения [110]. Дополнительные исследования могут определить точные молекулярные механизмы, касающиеся того, как Mkx координирует экспрессию разнообразного набора генов в TSC и роль сигнальных путей TGF-β и BMP в пролиферации и / или дифференцировке TSC, что может быть полезно при разработке терапевтических мишеней для ремонт сухожилий.

Ошибочная дифференцировка TSCs при чрезмерной механической нагрузке может приводить к дифференцировке клеток в направлении большего адипоцитарного, хондроцитарного и остеогенного фенотипа потенциально посредством различных сигнальных механизмов. PGE 2 играет важную роль в индукции аномальной дифференцировки TSC, что подтверждается данными как in vitro, так и in vivo. Интенсивная механическая нагрузка на сухожилия индуцирует PGE 2 , а обработка TSC с PGE 2 снижает пролиферацию клеток и индуцирует дифференцировку TSC в адипоциты и остеоциты [57].PGE 2 TSC, обработанные , при имплантации голым крысам образуют отложение липидов и накопление GAG. Однако PGE 2 может проявлять двухфазные эффекты в TSC. В то время как более высокие концентрации могут снижать пролиферацию клеток и вызывать дифференцировку нетеноцитов, более низкие концентрации могут усиливать пролиферацию клеток и экспрессию маркеров стволовых клеток [73], то есть они стимулируют поддержание стволовости TSC. Тем не менее, молекулярные механизмы двухфазного действия PGE 2 , особенно в условиях механической нагрузки, еще предстоит выяснить.

BMPs, группа сигнальных молекул, которые принадлежат суперсемейству TGF-β, являются еще другими молекулами-кандидатами, которые, как предполагается, участвуют в дифференцировке TSC в нетеноцитарные фенотипы. BMPs передают сигнал через канонический Smad-зависимый путь и неканонический путь MAPK [111]. Активированные Smads индуцируют экспрессию Runx-2, одного из основных регуляторов остеогенеза [112]. TSC экспрессируют высокий уровень рецепторов BMP [113], а механическое растяжение увеличивает экспрессию BMP-2 в TSC, облегчая остеогенную дифференцировку [55].Более того, PGE 2 активирует Akt и индуцирует остеогенную дифференцировку TSC через продукцию BMP-2 [57,114,115]. Сигнальный каскад фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) важен для индуцированного PGE 2 продукции BMP-2 и BMP-опосредованной остеогенной дифференцировки в TSCs [114]. IGF-1 и BMP-2 вместе обеспечивают PGE 2 -индуцированную адипогенную дифференцировку TSCs посредством CREB и Smad-зависимого механизма [116]. PGE 2 увеличивает фосфорилирование CREB и Smad через IGF-1 и BMP-2.Кроме того, путь ERK1 / 2, который является ветвью пути передачи сигналов MAPK, также предположительно участвует в остеогенной дифференцировке TSCs [117].

Передача сигналов Wnt, которая играет жизненно важную роль в регуляции дифференцировки в MSCs [118], также важна в управлении ошибочной дифференцировкой TSC, ведущей к патогенезу тендинопатии [119]. Вызванная механическим растяжением остеогенная дифференцировка TSCs опосредуется через путь Wnt5a-Rho A и путь Wnt5a / 5b / JNK [54,56].Wnt3a способствует остеогенной дифференцировке TSC. Более того, медиаторы Wnt увеличиваются в моделях на животных и клинических образцах тендинопатии, что может способствовать тканевой метаплазии и неудачному заживлению в некоторых случаях тендинопатии [119].

Химические и механические стимулы действуют на общую передачу сигналов и цитоскелетные сети.

Значение

Клетки направленно мигрируют в ответ на множество внешних сигналов, включая химические, электрические и механические стимулы; однако на молекулярном уровне охарактеризована только реакция на хемоаттрактанты.Связывание хемоаттрактантов со специфическими поверхностными рецепторами запускает быструю временную активацию многих событий передачи сигналов и цитоскелета. Мы обнаружили, что кратковременное приложение напряжения сдвига к клеткам, вероятно, вызывает активацию всех тех же событий. Ответы на хемоаттрактанты и напряжение сдвига восприимчивы ко многим из одних и тех же возмущений, хотя на механическую стимуляцию однозначно блокируется нарушение актинового цитоскелета. Наше открытие дает представление о молекулярном механизме клеточного ответа на механические стимулы и имеет важное значение для интеграции химических и механических входов.

Abstract

Пути передачи сигналов, активируемые хемоаттрактантами, широко изучены, но мало что известно о событиях, опосредующих ответы на механические стимулы. Мы обнаружили, что острое механическое возмущение клеток запускает временную активацию всех протестированных компонентов сети передачи хемотаксического сигнала, а также полимеризацию актина. Подобно хемоаттрактантам, события передачи сигнала, вызванные сдвиговым потоком, демонстрировали особенности возбудимости, включая способность устанавливать полный ответ независимо от продолжительности стимуляции и рефрактерного периода, который является общим с периодом, генерируемым хемоаттрактантами.Потеря субъединиц G-белка, ингибирование множественных событий передачи сигнала или нарушение передачи сигналов кальция ослабляли ответ на острую механическую стимуляцию. В отличие от реакции на хемоаттрактанты, интактный актиновый цитоскелет необходим для реакции на механическое возмущение. Эти результаты, взятые вместе, предполагают, что хемотаксические и механические стимулы запускают активацию общей сети передачи сигналов, которая объединяет внешние сигналы для регулирования активности цитоскелета и управления миграцией клеток.

Миграция эукариотических клеток определяется рядом химических и физических сигналов в окружающей их среде. Хемотаксис, который относится к миграции вверх по градиенту растворимого хемоаттрактанта, на сегодняшний день является наиболее понятным способом направленной миграции клеток. Однако клетки также могут управляться градиентами хемоаттрактантов, связанных с субстратом (гаптотаксис), переменной жесткостью субстратов (дуротаксис), электрическими полями (электротаксис или гальванотаксис) или сдвиговым потоком (реотаксис). Эти различные способы направленной миграции вовлечены в различные физиологические и патофизиологические процессы, включая эмбриогенез, заживление ран, хронические воспалительные заболевания и метастазирование рака (1–3).Важно отметить, что миграция клеток in vivo, несомненно, включает интеграцию множества различных сигналов.

В отличие от хемотаксиса, полное понимание сигнальных механизмов, которые управляют различными др. Способами направленной миграции, отсутствует. Как и в случае с хемотаксирующими клетками, в нескольких исследованиях сообщалось об активации и / или локализации типичных передовых маркеров, включая полимеризацию актина, фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (PIP3) и / или киназу, регулируемую внеклеточными сигналами (ERK) 1/2. , в передней части клеток, претерпевающих либо миграцию, опосредованную сдвиговым потоком, либо электротаксис (4-7).Однако эти активности наблюдались в стационарных условиях, и, поскольку эти активности связаны со случайными выступами, их появление на переднем крае, скорее всего, просто отражает обилие выступов на фронте, вызванных механическими или электрическими силами.

Большая часть нашего понимания регуляторных механизмов хемотаксиса основана на исследованиях социальной амебы Dictyostelium discoideum . Эффективный хемотаксис зависит от интеграции моторики, направленного восприятия и полярности.Это поведение можно описать с точки зрения рецептора / G-белка, передачи сигнала, цитоскелета и сетей полярности. Связывание хемоаттрактанта с его рецептором, связанным с G-белком, передает сигнал через гетеротримерные G-белки в нижележащую сеть передачи сигнала, которая усиливает направленный сигнал. Множественные пути внутри сети передачи сигналов действуют параллельно смещению полимеризации актина и, как следствие, выпячиванию псевдоподов в направлении градиента. Механизмы обратной связи в сети передачи сигнала вместе с полярностью клеток еще больше усиливают ответ.Важные части этой парадигмы были подтверждены на других клетках, которые претерпевают быструю миграцию амебоидного типа, включая нейтрофилы и метастатические раковые клетки (3).

До недавнего времени считалось, что случайная миграция клеток связана исключительно с активностью актинового цитоскелета, которая смещается в присутствии хемоаттрактантов G-белком и сетями передачи сигналов. Однако накапливаются доказательства в пользу точки зрения, что и передача сигнала, и сети актинового цитоскелета необходимы для случайной подвижности.В отсутствие передачи сигнала быстрые колебания цитоскелета вызывают волнообразные колебания только по периметру клетки (8, 9). Более крупные выступы, которые управляют миграцией клеток, требуют локального спонтанного запуска возбудимой сети передачи сигналов для организации цитоскелета. Дополнительным подтверждением этой схемы связывания является наблюдение, что большинство мутантов по хемотаксису влияют на передачу сигнала и нарушают случайную миграцию.

Модель передачи сигналов с цитоскелетом предполагает, что различные направляющие сигналы могут сходиться в общей сети передачи сигналов, которая управляет случайной миграцией клеток.Случайное открытие, что клетки Dictyostelium проявляют биохимические реакции на острую механическую силу, позволило нам проверить эту гипотезу. Сдвиговый поток запускал быструю и временную активацию каждого пути, который мы исследовали в сети передачи хемотаксического сигнала. Более того, похоже, что напряжение сдвига и хемоаттрактанты активируют одну и ту же сеть передачи возбудимого сигнала, обеспечивая взаимодействие и / или интеграцию двух процессов.

Результаты

Острая механическая стимуляция запускает активацию нескольких ветвей сети передачи хемотаксического сигнала.

В ходе эксперимента, предназначенного для мониторинга реакции передачи сигнала, мы обнаружили, что приложение острого напряжения сдвига в течение всего 5 секунд к адгезивным агрегационным клеткам Dictyostelium привело к временному фосфорилированию киназ PKBR1, ERK2 и KrsB с определенным временем. обычно наблюдается при стимуляции, вызванной хемоаттрактантом (рис. 1 A и рис. S1 A ). Фосфорилирование PKBR1 и KrsB достигает пика через 10-15 секунд, тогда как ERK2 максимально фосфорилируется примерно через 30 секунд после стимуляции.Острое напряжение сдвига также активировало PKBA, хотя эта реакция была ослаблена из-за присутствия кофеина (рис. S1 A ).

Рис. 1.

Острая механическая стимуляция активирует множественные пути передачи сигналов. ( A ) Компетентные к агрегации клетки WT стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с использованием антител, которые распознают фосфорилированные PKBR1, ERK2 и KrsB, а также общий KrsB. Мембрану окрашивали кумасси бриллиантовым синим (CBB), чтобы показать равную загрузку белка.Среднюю интенсивность фосфорилированных полос нормировали на интенсивность соответствующих полос общего KrsB и наносили на график в зависимости от времени. Другой пример динамики фосфорилирования белка в ответ на острую механическую стимуляцию показан на рис. S1 A . ( B G ) Компетентные к агрегации клетки WT, экспрессирующие различные флуоресцентно меченые биосенсоры, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 15 дин / см 2 ( B D ) или 21 дин / см 2 ( E ) на 2–5 с.Изображения собирались каждые 3 с. ( B E ) Репрезентативная клетка, демонстрирующая транслокацию LimE Δcoil ( B ), PH-Crac ( C ), PTEN ( D ) и CynA ( E ) в ответ к механическому раздражению. Кимограмма, показывающая изменения коркового сигнала по всему периметру клетки (показана вертикальной линией) во времени, показана для каждой клетки. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга. ( F и G ) Накопление LimE Δcoil ( F ) или PH-Crac ( G ) в коре головного мозга было выражено как инверсия средней интенсивности цитоплазмы, нормированной для времени 0.Ответы отдельных ячеек представлены в виде строк на тепловой карте. Средний ответ 18 ( F ) или 20 ( G ) ячеек показан на внизу . Значения являются средними ± SE. Аналогичный анализ PTEN и CynA показан на рис. S1 D и E . (Шкала 10 мкм.)

Рис. S1.

Острая механическая стимуляция активирует множественные пути передачи сигналов. ( A ) Динамика фосфорилирования белка в ответ на острую механическую стимуляцию (как на рис.1 А ). Компетентные к агрегации клетки WT стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с использованием антител, которые распознают фосфорилированные PKBR1 и PKBA, ERK2 и KrsB, а также общий KrsB. Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. ( B и C ) Компетентные к агрегации клетки WT, экспрессирующие RBD-GFP ( B ) или RalGDS-GFP ( C ), стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 ( B ) или 21 ( C). ) дин / см 2 в течение 2 с.Изображения собирались каждые 3 с. Кимограмма, показывающая изменения коркового сигнала по всему периметру клетки (показана вертикальной линией) во времени, показана для каждой клетки. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга. ( D и E ) Накопление PTEN ( D ) или CynA ( E ) в коре было количественно выражено как инверсия средней интенсивности цитоплазмы, нормализованной для времени 0, как показано на рис.1 F и G . Ответы отдельных ячеек представлены в виде строк на тепловой карте.Средний ответ шести ячеек показан на Нижний . Значения являются средними ± SE. (Масштабная шкала, 10 мкм.)

Чтобы наблюдать влияние острой механической стимуляции на поведение отдельных клеток, мы проанализировали локализацию нескольких биосенсоров в клетках после короткого импульса однонаправленного ламинарного потока в перфузионной камере. Типичные «передние» маркеры, такие как LimE Δcoil , который обнаруживает недавно полимеризованный актин, и датчик PIP3 PH-Crac временно перемещается из цитозоля в кору, достигая пика примерно через 9 секунд после стимуляции (рис.1 B и C и фильм S1). Биосенсоры для активированного Ras (RBD) и Rap1 (RalGDS) также показали аналогичное поведение (рис. S1 B и C ). Напротив, «задние» маркеры фосфатазы и гомолог тензина (PTEN) и Callipygian (CynA) показали противоположную локализацию с немного задержкой по времени, при этом наибольшее накопление в цитозоле наблюдалось через 15–18 с (Рис. 1 D и E и фильм S1). Хотя большинство клеток показали ответ LimE Δcoil , PH-Crac, PTEN или CynA, величина ответа различалась среди клеток (рис.1 F и G и рис. S1 D и E ). Таким образом, кратковременное приложение напряжения сдвига запускает полимеризацию актина, а также активацию множества ветвей сети передачи хемотаксического сигнала.

Стимуляция вегетативных клеток коротким импульсом однонаправленного ламинарного потока в перфузионной камере также привела к устойчивой полимеризации актина и активации Ras в коре клеток с пиком примерно через 6 секунд после стимуляции (Рис. 2 A и Movie S2) .Важно отметить, что рекрутирование LimE Δcoil в клеточную кору в ответ на острую механическую стимуляцию не происходило из-за индуцированной сдвигом миграции клеток (фиг. 2 B ). Фактически, клетки временно остановились после острой механической стимуляции, о чем свидетельствует значительное уменьшение образования новых выступов между 9 и 18 секундами после стимуляции ( P <0,05 между 9 и 18 секундами по парному тесту t по сравнению со временем 0 ). Ответ LimE Δcoil также сопровождался небольшим временным уменьшением общей площади клетки между 15 и 21 с, аналогично «съеживанию», которое следует после стимуляции хемоаттрактантом, и расширяющейся реакции между 36 и 45 с, соответственно. клеткам, возобновляющим миграцию ( P <0.05 в указанные моменты времени парным тестом t по сравнению со временем 0). Последняя фаза также коррелировала с увеличением сигнала LimE Δcoil в коре головного мозга из-за его накопления на вновь образованных выступах. Непрерывная стимуляция вегетативных клеток Dictyostelium однонаправленным ламинарным потоком также приводила к временному ответу LimE Δcoil с последующим поляризованным ответом и миграцией против потока через ~ 2 мин после индукции потока (рис.S2 A и B и фильм S3). Чувствительность к механическим воздействиям, по-видимому, является консервативным поведением эукариотических клеток, поскольку острая стимуляция нейтрофилоподобных клеток HL-60 человека с помощью сдвигового потока также приводит к расширяющейся реакции, при которой клетки появляются в фазе темноты через ~ 1-2 мин после стимуляции ( P <0,05 при 60 с; Рис. S2 C и Movie S4). Переходный отклик расширения также наблюдался после непрерывного воздействия сдвигового потока (Movie S4).

Рис. 2.

Реакция на сдвиговый поток обусловлена ​​механическими возмущениями, а не растворимыми факторами. ( A и B ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP или RBD-GFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 в течение 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. Типичные изображения показаны в A . ( B ) LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F .Новая площадь, занимаемая ячейкой, рассчитывалась с использованием количества новых пикселей, покрытых ячейкой в ​​последовательных кадрах. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 8 клеток. (C) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, стимулировали при указанных значениях напряжения сдвига, отображали и анализировали, как в B . Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием. ( D ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, подвергали воздействию микропипетки, которая обеспечивала фоновый поток буфера для анализа.В момент времени 0 был введен короткий болюс буфера для анализа, после чего клетки были возвращены в состояние фоновой скорости потока. Изображения собирались каждые 3 с. ( E ) Пик накопления LimE Δcoil -RFP в коре после стимуляции в D для 15 отдельных клеток наносили на график в зависимости от расстояния между центроидом клетки и кончиком микропипетки. Накопление пика количественно определяли как обратную величине средней интенсивности цитоплазмы через 6 с после начала стимуляции, нормированной на время 0.Линия тренда соответствует однофазному распаду. ( F и G ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, отображали при постоянном сдвиговом потоке при ~ 5 дин / см 2 . В момент времени 0 напряжение сдвига увеличивалось до ~ 60 дин / см 2 в течение 5 с за счет кратковременного увеличения скорости потока. ( F ) LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 20 ячеек. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга.Типичная ячейка показана в G . (Шкала 10 мкм.)

Рис. S2.

Реакция на сдвиговый поток возникает из-за механических возмущений, а не из-за растворимых факторов. ( A и B ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, подвергали непрерывному однонаправленному ламинарному потоку при 15 дин / см 2 и отображали каждые 3 секунды. Дорожки из 11 ячеек показаны в B . ( C ) Дифференцированные клетки HL-60 стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 15 дин / см 2 в течение 5 с.Изображения собирались каждые 15 с, а площадь ячеек измерялась в каждом кадре. Средняя площадь 17 ячеек показана как среднее значение ± стандартная ошибка справа . ( D ) Компетентные к агрегации клетки WT стимулировали на роторном шейкере при 50, 100 или 150 об / мин в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с использованием антитела, которое распознает фосфорилированный PKBR1. Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. ( E ) Компетентные к агрегации клетки aca клетки стимулировали на роторном шейкере при 150 об / мин в течение 5 с, лизировали и иммуноблотировали, как в D .( F и G ) Компетентные к агрегации aca клеток, экспрессирующих LimE Δcoil -RFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 15 дин / см 2 в течение 5 с. Изображения собирались каждые 3 с. Типичная ячейка показана в F . ( G ) LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 16 ячеек. ( H и I ) Вегетативные cAR1 / 3 Клетки , экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 15 дин / см 2 в течение 2 с.Изображения собирались каждые 3 с. Типичная ячейка показана в H . ( I ) LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 23 ячеек. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга. (Масштаб, 10 мкм.)

Ответ отдельных клеток, измеренный с помощью транслокации LimE Δcoil , а также реакция популяции клеток, измеренная с помощью фосфорилирования PKBR1, увеличивались с увеличением приложенного однонаправленного напряжения сдвига (рис.2 C , рис. S2 D и ролик S5). Точно так же, когда клетки подвергались увеличению напряжения сдвига, доставляемого микропипеткой, заполненной буфером для анализа, клетки поблизости демонстрировали временное рекрутирование LimE Δcoil в кору клеток (фиг. 2 D ). Отклик обратно коррелировал с расстоянием от клетки до микропипетки, что снова указывает на то, что он зависел от уровня приложенного сдвига (рис. 2 E ).

Несколько контролей предположили, что реакция зависела от механического возмущения.Во-первых, они не зависели от хемоаттрактанта цАМФ, потому что клетки, лишенные аденилатциклазы или рецепторов цАМФ 1 и 3, которые не могут продуцировать цАМФ или отвечать на них, соответственно, все еще были способны полимеризовать актин после острой механической стимуляции потоком сдвига (рис. S2 ). E I ). Во-вторых, несколько наблюдений показали, что эти ответы не зависели от накопления других растворимых факторов в аналитическом буфере: () Когда мы стимулировали клетки, которые уже находились под перфузией, временное увеличение скорости потока, которое увеличивало напряжение сдвига. от 5 до 60 дин / см 2 , запускает устойчивую полимеризацию актина в коре клетки (рис.2 F и G и Movie S6). ( ii ) В экспериментах с микропипеткой, описанных выше, был основной поток из микропипетки до стимула. Кроме того, как показано ниже, клетки неоднократно реагировали на кратковременные увеличения напряжения сдвига, разделенные промежутком всего в 45 с.

Реакция на острую механическую стимуляцию имеет характеристики возбудимой системы.

Поскольку механическая стимуляция и хемоаттрактанты запускают активацию одной и той же сети передачи сигналов, можно ожидать, что ответы на механическую стимуляцию будут возбудимыми по своей природе, подобно ответам, индуцированным хемоаттрактантами.Две особенности возбудимых систем, которые наблюдаются для хемоаттрактантов, — это полный или нулевой характер ответа, а также наличие рефрактерного периода. Когда мы тестировали реакцию на 2-секундный или 10-секундный импульс при низких значениях напряжения сдвига, мы увидели увеличение набора LimE Δcoil с большей продолжительностью стимула (рис. 3 A ). Однако при высоком напряжении сдвига пиковая реакция на 2-секундную стимуляцию существенно не отличалась от 10-секундной стимуляции (рис. 3 A ), аналогично полной реакции, наблюдаемой после кратковременной или продолжительной стимуляции насыщающими количествами. хемоаттрактанта (8).

Рис. 3.

Ответ на острое механическое раздражение имеет характеристики возбудимости. ( A ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 15 или 60 дин / см 2 в течение 2 или 10 с. Изображения собирались каждые 3 с. LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 40 и 34 ячеек для 15 дин / см 2 для 2 с и 10 с и 25 и 30 ячеек для 60 дин / см 2 для 2 с и 10 с.( B и C ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 дважды, разделенных различными задержками (ΔT), и изображения собирали каждые 3 секунды. . LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Средние значения показаны на рис. S3 A . ( B ) Ответ отдельных ячеек, представленный строками на тепловой карте, показывает вариации от ячейки к ячейке.( C ) Среднее отношение пиковой реакции через 6 с после второй стимуляции к 6 с после первой стимуляции наносили на график в зависимости от ΔT. Значения являются средними ± стандартная ошибка 10–14 клеток. Линия тренда основана на функции однофазного затухания. ( D ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, сначала вручную стимулировали сдвиговым потоком; после задержки в 12 или 45 с их затем стимулировали 20 нМ фолиевой кислотой. Изображения собирались каждые 3 с. Накопление LimE Δcoil -RFP в коре головного мозга определяли как обратное значение средней интенсивности цитоплазмы, нормализованное для времени 0 применения фолиевой кислоты и скорректированное на добавление только носителя.Показан интегральный ответ между 0 и 24 с после стимуляции фолиевой кислотой. Горизонтальные линии и полосы ошибок представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение, * P <0,05.

Чтобы оценить рефрактерный период ответа на механическую стимуляцию, мы подвергали клетки последовательным 2-секундным стимулам со скоростью 41 дин / см 2 , варьируя интервал между двумя сигналами от 12 до 45 с (рис. 3 B ). и C , фиг. S3 A и ролик S7). В этих условиях реакция на второй стимул отсутствовала, если интервал был менее 12 с, что соответствует периоду абсолютной рефрактерности.После этого реакция восстановилась с полупериодом ~ 7 с, как это наблюдалось для стимуляции, индуцированной хемоаттрактантом (8). Ответ полностью восстановился, когда интервал составил 45 с.

Рис. S3.

Ответ на острую механическую стимуляцию имеет характеристики возбудимости. ( A ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 дважды с различными интервалами. Изображения собирались каждые 3 с. LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга определяли количественно, как показано на рис.1 Ф . Значения являются средними ± стандартная ошибка 10–14 клеток. ( B и C ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, стимулировали вручную сдвиговым потоком с последующей стимуляцией 20 нМ фолиевой кислоты через 12 или 45 с после первой стимуляции. Изображения собирались каждые 3 с. Накопление LimE Δcoil -RFP в коре головного мозга определяли как обратное значение средней интенсивности цитоплазмы, нормализованное для времени 0 применения фолиевой кислоты и скорректированное на добавление только носителя.( B ) Тепловые карты, показывающие изменение ответа 24 отдельных клеток на каждую обработку. Отдельные ячейки представлены в виде строк на тепловой карте. ( C ) Среднее поведение клеток в B показано как среднее ± SE, * P <0,05.

Наконец, чтобы оценить, включает ли рефрактерность к механическим и хемотаксическим стимулам один и тот же процесс, клетки подвергались механическому воздействию, которое доставлялось болюсным добавлением буфера, а затем однородной фолиевой кислотой (рис.3 D , рис. S3 B и C и фильм S8). Когда интервал между двумя стимулами составлял 45 с, ответ на 20 нМ фолиевой кислоты был аналогичен ответу без предшествующей стимуляции. Напротив, когда интервал между механической и химической стимуляцией составлял 12 с, интегральный ответ на фолиевую кислоту снижался более чем на 60%. Таким образом, механическая стимуляция и стимуляция хемоаттрактантом, по-видимому, разделяют рефрактерный процесс.

Роль сети передачи сигналов в ответ на острую механическую стимуляцию.

Чтобы определить, необходима ли клетка сети передачи сигнала, активируемой механической стимуляцией, для передачи стимула, мы исследовали поведение клеток с нарушенными путями передачи одного или нескольких сигналов. Обработка клеток LY294002, который ингибирует PI3K, не влияла на их способность рекрутировать LimE Δcoil после кратковременного воздействия сдвигающего потока (фиг. 4 A и фиг. S4 A ). Предыдущие исследования показали, что нарушение четырех путей (PI3K, TORC2, PLA 2 и sGC) одновременно устраняет хемотаксические реакции (10, 11).В наших руках эти клетки были способны рекрутировать LimE Δcoil после короткого импульса потока, хотя ответ был значительно снижен по сравнению с клетками, лишенными одного (sGC) или двух (sGC и PI3K) путей (рис. 4 B ). , Рис. S4 B и Movie S9). Для клеток, лишенных путей sGC, PLA 2 и TORC2, которые имели наименее устойчивый ответ на механическую стимуляцию, также наблюдалось очевидное отсутствие отключения после ответа, хотя это не относилось к клеткам, лишенным активности PI3K, поскольку хорошо.Возможно, что медленное восстановление sGC / pla 2 / pia связано с повышенной базальной активностью этих клеток, поскольку в них оказалось больше макропиносом, чем в других двойных или тройных пустые ячейки. Соответственно, ингибирование пути PI3K, которое, как ранее было показано, важно для образования макропиносом (12), по-видимому, несколько улучшает профиль ответа в этих клетках.

Рис. 4.

Влияние ингибирования сети передачи сигнала и G белков на ответ на острую механическую стимуляцию.( A и B ) Вегетативные клетки WT ( A ) или sGC , sGC / pla2 и sGC / — pia2 / pia Клетки ( B ), экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, обрабатывали носителем или 50 мкМ LY294002 в течение по меньшей мере 30 мин, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 в течение 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга определяли количественно, как показано на рис.1 Ф . Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек показаны на рис. S4 A и B . ( C и D ) Беспорядочно мигрирующий вегетативный WT ( C ) или sGC , sGC / pla2 и sGCia ( D ) клеток, обработанных носителем или 50 мкМ LY294002 в течение 60 минут, визуализировали каждые 20 с в течение 20 минут.Показаны треки из 20 ячеек. ( E и F ) Вегетативный gpgA экспрессирующий вектор или GpgA, а также LimE Δcoil -RFP стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при указанном давлении в течение 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. Типичные клетки показаны в E . ( F ) Пиковое накопление LimE Δcoil -RFP в коре отдельных клеток количественно определяли как инверсию средней интенсивности цитоплазмы через 6 с после начала стимуляции, нормированной на время 0.Горизонтальные линии и полосы ошибок представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение, * P <0,05, ** P <0,01. ( G ) WT или gpgA клеток, мигрирующих в отсутствие или в присутствии потока, отображали каждые 15 с в течение 15 мин. Показаны треки из 50 ячеек. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга. (Шкала 10 мкм.)

Рис. S4.

Влияние ингибирования сети передачи сигналов и G-белков на реакцию на острую механическую стимуляцию.( A и B ) Вегетативные клетки WT ( A ) или sGC , sGC / pla2 и sGC / — pia2 / pia Клетки ( B ), экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, обрабатывали носителем или 50 мкМ LY294002 в течение по меньшей мере 30 мин, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 в течение 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. Пик накопления LimE Δcoil -RFP в коре отдельных клеток был определен как величина, обратная средней интенсивности цитоплазмы через 6 с ( A ) или 9 с ( B ) после начала стимуляции, нормализованной для времени 0.Горизонтальные линии и полосы ошибок представляют среднее значение ± стандартное отклонение, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с sGC с носителем. ( C ) WT или gpbA клеток, мигрирующих в отсутствие или в присутствии потока при двух различных давлениях, отображали каждые 15 с в течение 15 мин. Показаны треки из 50 ячеек.

Затем мы проверили, влияют ли возмущения, влияющие на реакцию на механическую стимуляцию, на подвижность, потому что это предсказание, которое можно сделать на основе модели сцепления, в которой передача сигнала и цитоскелетные сети действуют вместе, вызывая образование выпячиваний.Действительно, способность клеток с нарушенным путем (ами) передачи сигнала отвечать на механическую стимуляцию коррелирует с их случайной миграцией. Клетки, лишенные путей sGC, TORC2 и PLA 2 , с передачей сигналов PI3K или без нее, имели значительное снижение скорости миграции (фиг. 4 C , Movie S10 и таблица S1). Как упоминалось выше, отсутствие активности PI3K немного улучшало направленность клеток, вероятно, из-за уменьшения образования макропиносом (12). В целом, это открытие предполагает, что острая механическая стимуляция может действовать в той же сети, которая контролирует случайную активность и миграцию.

Таблица S1.

Анализ случайной подвижности клеток с нарушенными путями передачи сигнала

Fache et al. ранее сообщалось о снижении подвижности, вызванной сдвиговым потоком, для клеток, лишенных G β (13). Таким образом, мы исследовали, участвуют ли гетеротримерные G-белки в ответе на острую стимуляцию сдвиговым потоком. Клетки, в которых отсутствует G β ( gpbA ) или G γ ( gpgA ), были чрезвычайно устойчивы к кратковременной стимуляции потоком даже при значениях напряжения сдвига выше, чем обычно для клеток WT (60 по сравнению с 41 дин / см 2 ; рис.4 E и F и Movie S11). Мы действительно наблюдали набор LimE Δcoil в клетках gpgA при более высоких значениях напряжения сдвига время от времени (рис. 4 E , нижний ряд и F и Movie S11). Экспрессия G γ спасла фенотип gpgA клеток. Подобно клеткам, лишенным множественных путей передачи сигнала, случайная миграция клеток gpbA и gpgA клеток была значительно нарушена (рис.4 G , рис. S4 C , фильм S12 и таблица S2). Кроме того, в соответствии с предыдущими исследованиями (13), мы также наблюдали уменьшение индуцированной сдвиговым потоком миграции клеток gpbA и gpgA клеток (рис. 4 G , Рис. S4 C и Movie S12). Увеличение скорости сдвигового потока улучшило направленную миграцию клеток gpbA (рис. S4, , C, и таблица S2).Следует отметить, что клетки WT мигрировали против сдвигового потока при 10 дин / см 2 , но переключили свое направление миграции на движение с потоком при 25 дин / см 2 (рис. S4 C ). Напротив, G-протеин-нулевые клетки мигрировали с потоком даже при 10 дин / см 2 (фиг. 4 G и фиг. S4 C ).

Таблица S2.

Случайный и индуцированный сдвиговым потоком анализ подвижности клеток WT и нулевых G-белков.

Роль потока кальция в ответе на острую механическую стимуляцию.

Поскольку механочувствительность в различных типах клеток сопровождается всплеском уровней Ca 2+ (14), мы исследовали, играет ли передача сигналов Ca 2+ роль в ответе Dictyostelium на острую механическую стимуляцию. Стандартным буфером, используемым до сих пор в экспериментах, был фосфатный буфер с добавлением 2 мМ MgSO 4 и 200 мкМ CaCl 2 . Когда мы оценивали чувствительность развитых клеток в фосфатном буфере без добавления катионов, мы наблюдали снижение фосфорилирования PKBR1 и ERK2 через 10 с после острой стимуляции сдвиговым потоком на роторном шейкере (рис.5 A и B ). Ответ был устранен добавлением 1 мМ CaCl 2 или MgCl 2 (рис. S5 A ). Клетки на стадии роста менее чувствительны к внеклеточному кальцию, потому что в этих клетках было устойчивое рекрутирование LimE Δcoil или RBD в фосфатном или трициновом буфере без добавления катионов (фиг. 5 C и фиг. S5 B ). Добавление 1 мМ CaCl 2 немного улучшило пик полимеризации актина в коре головного мозга после воздействия острого однонаправленного ламинарного потока, а добавление CaCl 2 до 10 мМ не увеличивало дополнительно ответ.С другой стороны, истощение запасов кальция при длительной обработке EGTA значительно ингибировало рекрутирование LimE Δcoil в этих клетках (фиг. 5 D и фиг. S5 C ). Вместе эти результаты предполагают, что вегетативные клетки имеют большие запасы кальция, чем развитые клетки, и, следовательно, менее восприимчивы к колебаниям внешнего уровня кальция.

Рис. 5.

Роль катионов и катионных каналов в ответе на острую механическую стимуляцию. ( A и B ) Компетентные к агрегации клетки WT в фосфатном буфере (PB) или PB с добавлением 2 мМ MgSO 4 и 0.2 мМ CaCl 2 [развивающий буфер (DB)] стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с антителами, которые распознают фосфорилированные PKBR1 и ERK2. Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Типичный иммуноблот показан в A . ( B ) Среднюю интенсивность полос фосфо-PKBR1 и фосфо-ERK2 нормировали на интегральную интенсивность полос DB 0 и 10 с. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка четырех независимых экспериментов.( C и D ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, хранили в трициновом буфере, обработанном указанными концентрациями CaCl 2 в течение не менее 5 минут ( C ) или 10 мМ EGTA. или носитель в течение не менее 30 мин ( D ), а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 в течение 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F .Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек показаны на фиг. S5 B и C . ( E и F ) Вегетативный WT, iplA , pkd2 или mcln 103 клетки Limco, экспрессирующие ΔFP трициновый буфер с добавлением 0,2 мМ CaCl 2 ( E и F ) или 10 мМ CaCl 2 ( F ), а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком, отображали и анализировали, как в C .Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 30 ячеек. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек в F показаны на рис. S5 D . * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с контролем дикого типа или носителем, если не указано иное.

Рис. S5.

Роль катионов и катионных каналов в ответе на острую механическую стимуляцию. ( A ) Компетентные к агрегации клетки WT в DB [фосфатном буфере (PB) с добавлением 2 мМ MgSO 4 и 0.2 мМ CaCl 2 ], PB или PB с добавлением 1 мМ CaCl 2 или 1 мМ MgCl 2 по отдельности или в комбинации стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и иммуноблоттинг с использованием антител, распознающих фосфорилированные PKBR1 и ERK2. Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Показан иммуноблот, представляющий два независимых эксперимента. ( B и C ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, содержались в трициновом буфере, обработанном указанными концентрациями CaCl 2 в течение не менее 5 минут ( B ) или 10 мМ EGTA. или носитель в течение не менее 30 мин ( C ), а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 в течение 2 с.Изображения собирались каждые 3 с. Пик накопления LimE Δcoil -RFP в коре отдельных клеток количественно определяли как обратную среднюю интенсивность цитоплазмы через 6 с после начала стимуляции, нормированную на время 0. Горизонтальные линии и столбики ошибок представляют среднее значение ± стандартное отклонение. ( D ) Вегетативный WT и iplA Клетки , экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, содержали в трициновом буфере с добавлением 0,2 мМ или 10 мМ CaCl 2 , стимулировали однонаправленным и ламинарным потоком, визуализировали. анализируется как в B .( E и F ) Компетентные к агрегации клетки WT или piezo (два независимых клона) стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали в указанные моменты времени и иммуноблотировали с антителами, которые узнают фосфорилированные PKBR1 и ERK2. Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Типичный иммуноблот показан в E . ( F ) Среднюю интенсивность полос фосфо-PKBR1 и фосфо-ERK2 нормировали на интегральную интенсивность полос 0 и 10 с WT.Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка четырех независимых экспериментов. ( G ) Вегетативный WT или piezo (клон 1) клетки, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком и отображали, как в B . LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием.

Поскольку приток кальция может способствовать ответу на механический стимул, вероятно, существуют каналы, которые позволяют притоку кальция либо из внеклеточного пространства, либо из внутренних запасов.Недавнее исследование Lima et al. изучили роль нескольких предполагаемых катионных каналов в реотаксисе или миграции клеток, индуцированной сдвиговым потоком, и вовлекли полицистиноподобный канал Pkd2 и, в меньшей степени, муколипин (Mcln) в этот процесс (15). В наших анализах ответов на острую механическую стимуляцию, доставляемую однонаправленным ламинарным потоком, пиковый ответ Pkd2-нулевых или Mcln-нулевых клеток существенно не отличался от клеток WT (фиг. 5 E и Movie S13). Кроме того, мы разрушили ген гомолога Dictyostelium механочувствительного катионного канала Piezo (16) и оценили фосфорилирование PKBR1 и ERK2, а также набор LimE Δcoil после острой механической стимуляции (рис.S5 E G ). Ни один из ответов не был значительно нарушен в случае пьезо-нулевых клеток по сравнению с клетками дикого типа.

Напротив, клетки, лишенные гомолога рецептора IP3 IplA, показали значительно более слабое рекрутирование LimE Δcoil после острого воздействия однонаправленного потока (фиг. 5 E и F , фиг. S5 D и Movie S14). В соответствии с предыдущими наблюдениями IplA-нулевых клеток, высокие концентрации внеклеточного кальция частично спасали ответ (рис.5 F , рис. S5 D и фильм S14) (17). Набор пика LimE Δcoil значительно улучшился на ~ 8% в 10 мМ CaCl 2 по сравнению с 0,2 мМ ( P <0,05).

Роль цитоскелета в ответе на острую механическую стимуляцию.

Поскольку актиновый цитоскелет участвует в механочувствительности, мы исследовали, требуется ли он для передачи острого механического стимула в клетку. Ингибирование полимеризации актина с помощью 5 мкМ латрункулина A (LatA) отменяет рекрутирование RBD-GFP в кору клеток после острой стимуляции однонаправленным сдвиговым потоком (рис.6 A и Movie S15). Средняя пиковая реакция RBD-GFP через 6 с после стимуляции была значительно снижена с почти 20% по сравнению с базовыми значениями до 0 ( P <0,001) в клетках, обработанных носителем, по сравнению с клетками, обработанными LatA (фиг.6 A и B и рис. S6 A ). LimE Рекрутирование Δcoil также полностью блокировалось в клетках, обработанных LatA, что подтверждает полное ингибирование полимеризации актина после обработки LatA. Обработка 5 мкМ LatA также ингибировала фосфорилирование PKBR1 и ERK2 через 10 и 30 секунд после 5-секундной механической стимуляции роторным встряхивателем (рис.6 C и D ). Ингибирующий эффект LatA зависел от дозы (фиг. S6 B ). Клетки, обработанные LatA, сохранили способность реагировать на хемоаттрактант. Обработка 100 мкМ фолиевой кислоты или 1 мкМ цАМФ приводила к увеличению кортикальной локализации RBD и фосфорилирования PKBR1 и PKBA в вегетативных и агрегационно-компетентных клетках, соответственно (фиг. S6 C и D ). В отличие от сильной потребности в полимеризованном актине, похоже, не было необходимости в миозине II, потому что клетки, лишенные миозина II, были способны генерировать устойчивый ответ при стимуляции на роторном шейкере или с однонаправленным потоком (рис.6 E и рис. S6 E и F ).

Рис. 6.

Роль цитоскелета в ответе на острую механическую стимуляцию. ( A и B ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP или RBD-GFP, обрабатывали носителем или 5 мкМ LatA в течение не менее 15 минут, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 за 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. Типичные клетки показаны в A .( B ) RBD-GFP и LimE Δcoil -RFP Накопление в коре головного мозга количественно определяли, как показано на рис. 1 F . Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек показаны на рис. S6 A . ( C и D ) Компетентные к агрегации клетки WT предварительно обрабатывали LatA в течение 30 минут, стимулировали на роторном шейкере в течение 5 секунд, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с использованием антител, которые распознают фосфорилированные PKBR1 или ERK2.Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Блот, представляющий три независимых эксперимента, показан в C и количественно представлен на фиг. S6 B . ( D ) Среднюю интенсивность фосфорилированных полос для носителя и 5 мкМ LatA нормализовали на интегральную интенсивность 0-, 10- и 30-секундных полос наполнителя. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 5 (pPKBR1) и 6 (pERK2) независимых экспериментов. ( E ) Компетентные к агрегации myo Клетки стимулировали на роторном шейкере в течение 5 с, лизировали и иммуноблотировали, как в C .Показан блот, представляющий по крайней мере два независимых эксперимента. ( F и G ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP или RBD-GFP, обрабатывали носителем или 50 мкМ беномила в течение не менее 20 мин, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 за 2 с. Изображения собирались каждые 3 с. Типичные клетки показаны в F . ( G ) RBD-GFP и LimE Накопление Δcoil -RFP в коре головного мозга количественно определяли как инверсию средней интенсивности цитоплазмы, нормализованной для времени 0.Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием. Пиковые значения отклика для отдельных ячеек показаны на рис. S6 F . *** P <0,001. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга. (Шкала 10 мкм.)

Рис. S6.

Роль цитоскелета в ответе на острую механическую стимуляцию. ( A ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP или RBD-GFP, обрабатывали носителем или 5 мкМ LatA в течение не менее 15 минут, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 в течение 2 с .Изображения собирались каждые 3 с. Пик RBD-GFP и накопление LimE Δcoil -RFP в коре отдельных клеток количественно определяли как инверсию средней интенсивности цитоплазмы через 6 с после начала стимуляции, нормированной на время 0. Горизонтальные линии и столбики ошибок представляют среднее значение ± стандартное отклонение. , *** P <0,001. ( B ) Компетентные к агрегации клетки WT предварительно обрабатывали LatA в течение 30 минут, стимулировали на роторном шейкере в течение 5 секунд, лизировали в указанные моменты времени и иммуноблотировали с использованием антител, распознающих фосфорилированный ERK2 (фиг.3 С ). Среднюю интенсивность фосфорилированных полос нормировали на интегральную интенсивность полос 0-, 10- и 30-секундного носителя. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка трех независимых экспериментов. ( C ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие RBD-GFP, обрабатывали носителем или 5 мкМ LatA в течение по меньшей мере 15 мин, а затем стимулировали 100 мкМ фолиевой кислоты. Изображения собирались каждые 3 с. Накопление RBD-GFP в коре головного мозга определяли количественно, как показано на рис. 1 F . Значения являются средними ± SE. Число проанализированных клеток указано рядом с каждым условием.( D ) Компетентные к агрегации клетки WT предварительно обрабатывали LatA в течение 30 мин, стимулировали либо механически на роторном шейкере в течение 5 с, либо 1 мкМ цАМФ, лизировали в указанные моменты времени и проводили иммуноблоттинг с использованием антител, которые распознают фосфорилированный PKBR1 и ПКБА. ( E и F ) Вегетативные myo клетки, экспрессирующие RBD-GFP, стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 в течение 2 с. Изображения собирались каждые 3 с.Типичная ячейка показана в E . ( F ) Накопление RBD-GFP в коре головного мозга количественно определяли как обратное значение средней интенсивности цитоплазмы, нормированной на время 0. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 14 клеток. ( G ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP, обрабатывали носителем или 50 мкМ беномилом в течение 30 минут, фиксировали и иммуноокрашивали антителом против α-тубулина. ( H ) Вегетативные клетки WT, экспрессирующие LimE Δcoil -RFP или RBD-GFP, обрабатывали носителем или 50 мкМ беномила в течение не менее 20 мин, а затем стимулировали однонаправленным ламинарным потоком при 41 дин / см 2 в течение 2 с .Изображения собирались каждые 3 с. Пик RBD-GFP и накопление LimE Δcoil -RFP в коре отдельных клеток количественно определяли как инверсию средней интенсивности цитоплазмы через 6 с после начала стимуляции, нормированной на время 0. Горизонтальные линии и полосы ошибок представляют среднее значение ± стандартное отклонение. . ( I K ) Компетентные к агрегации клетки WT предварительно обрабатывали носителем или указанными концентрациями беномила в течение 30 минут, стимулировали на роторном шейкере в течение 5 секунд, лизировали в указанные моменты времени и иммуноблотировали с использованием антител, которые распознают фосфорилированный PKBR1 или ERK2.Мембрану окрашивали CBB, чтобы показать равную загрузку белка. Типичный иммуноблот для носителя и 50 мкМ беномила показан в I . ( J ) Средняя интенсивность полос фосфорилированного ERK2 для носителя и 50 мкМ беномила в различные моменты времени после стимуляции была нормализована для времени 0. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка (SE) четырех независимых экспериментов. ( K ) Средняя интенсивность полос фосфорилированного ERK2 для носителя и указанные концентрации беномила в момент времени 0 были нормализованы для носителя.Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка трех независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с носителем. Стрелки указывают на области скопления биосенсора в коре головного мозга. (Шкала, 10 мкм.)

Мы также проверили, будет ли нарушение других структурных компонентов подавлять реакцию на острую механическую стимуляцию. Обработка клеток беномилом в концентрации до 50 мкМ, лекарственным средством, дестабилизирующим микротрубочки, не отменяет рекрутирование RBD или LimE Δcoil в кортекс после короткого импульса потока (рис.6 F и G и Рис. S6 G и H и Movie S16). Мы также исследовали влияние беномила на фосфорилирование PKBR1 и ERK2 после острой стимуляции на роторном шейкере (рис. S6 I K ). Беномил не блокировал индуцированное стимуляцией фосфорилирование (рис. S6 I и J ). Следует отметить, что беномил резко снижает количество базального фосфорилирования дозозависимым образом (рис. S6 K ), что вносит ошибку в расчет кратного увеличения фосфорилирования.Таким образом, по-видимому, неповрежденный каркас микротрубочек модулирует базальную активность, но в отличие от актинового цитоскелета его эффекты могут подавляться сильным механическим стимулом.

Обсуждение

Мы обнаружили, что кратковременная стимуляция клеток сдвиговым потоком приводит к быстрой временной активации всех протестированных путей передачи сигнала, а также к полимеризации актина, подобно равномерной стимуляции хемоаттрактантом (рис. 7). Мы наблюдали одновременные изменения активности и / или локализации молекул из нескольких параллельных путей в хемотаксической сигнальной сети, включая ERK2, Ras GTPases, Rap1, KrsB, PKBR1, PIP3, PKBA, PTEN и CynA.Кинетика этих изменений соответствовала изменениям, вызванным хемоаттрактантом. Как и при стимуляции хемоаттрактантами, клетки реагируют на увеличение механической силы насыщенным образом. Насыщающие стимулы вызывают реакции типа «все или ничего», за которыми следует рефрактерный период, в течение которого система не реагирует ни на какие стимулы сопоставимой силы. Эти свойства позволяют предположить, что механические стимулы поступают в ту же возбудимую сеть, которая ранее была обозначена для хемоаттрактантов.Для хемоаттрактантов сигнал поступает через сеть рецептор / G-белок, которая смещает возбудимую сеть передачи сигнала, которая управляет сетью цитоскелета. Конвергенция химических и механических стимулов в сети передачи сигналов позволит клетке интегрировать входные данные. Для механического возмущения мы определили несколько необходимых компонентов, включая полимеризованный актин, кальций и субъединицы βγ G-белка, а также общую активность сети передачи сигнала.Таким образом, вместо того, чтобы указывать на вход через определенную сеть, наши данные предполагают, что реакция на механические стимулы может проникать через любую из сетей.

Рис. 7.

Активация хемотаксической сигнальной сети химическими и механическими стимулами. Предпосылки: Хемоаттрактанты связываются с GPCR, что приводит к диссоциации и активации субъединиц α и βγ G-белка. Этот сигнал дополнительно усиливается множеством параллельных путей в сети передачи сигнала, что необходимо для смещенной полимеризации актина.В ответ на хемоаттрактант большинство молекул в сети передачи сигналов временно активируются или рекрутируются в кору, хотя PTEN и CynA диссоциируют из коры. В этом отчете: Во-первых, множественные узлы (выделены жирным курсивом) в пределах хемотаксической передачи сигнала и цитоскелетных сетей были протестированы в ответ на острую механическую стимуляцию. Восемь либо накапливались в коре, либо демонстрировали активирующее фосфорилирование (зеленые треугольники), а две потеряли кортикальную локализацию (синие треугольники), все с той же динамикой, что и для хемоаттрактантов.Во-вторых, тесты были повторены после того, как многочисленные компоненты (отмеченные *), участвующие в хемотаксических ответах, механотрансдукции и целостности цитоскелета, были нарушены с использованием генетических делеций и / или фармакологических ингибиторов. Поскольку возмущения внутри всех трех сетей подавляли реакцию на острую механическую стимуляцию (показано красным и коричневым), похоже, что все три сети координируются логическим логическим И-типом ворот, чтобы вызвать глобальный ответ. Возможные точки входа механических раздражителей обсуждаются в тексте.

Мы наблюдали практически полное ингибирование ответа на механическое возмущение в клетках с деполимеризованным актиновым цитоскелетом, предполагая, что интактный актиновый цитоскелет необходим для передачи механического стимула в сеть передачи сигнала. Требование неповрежденного цитоскелета специфично для механического стимула, потому что клетки, обработанные латрункулином, действительно реагируют на хемоаттрактанты (рис. S6 C и D ) (18, 19). Ответ не зависел от общей архитектуры цитоскелета, поскольку деполимеризация сети микротрубочек не оказывала значительного влияния на ответ на механическую стимуляцию.Известно, что клетки, обработанные латрункулином, значительно снизили корковое натяжение, что может быть важным для механоответа (20).

Истощение запасов кальция или нарушение IplA блокирует ответ, предполагая, что он опосредован активностью механочувствительных катионных каналов или может потребовать общего повышения уровня кальция в цитозоле. Биохимические реакции на механические стимулы приписываются механочувствительным катионным каналам, включая каналы транзиторного рецепторного потенциала (TRP), такие как полицистин-2 (Pkd2), а также пьезоканалы (21).Pkd-2 и др. Муколипин канала семейства TRP (Mcln) участвуют в индуцированной сдвиговым потоком миграции клеток Dictyostelium (15). Мы идентифицировали и разрушили гомолог пьезо. Однако в наших анализах пиковый ответ на острую механическую стимуляцию не претерпел заметных изменений в клетках, лишенных какого-либо из этих предполагаемых механочувствительных каналов, хотя возможно, что мутанты проявят измененную реакцию в других условиях (например, при различных скоростях потока, концентрациях кальция, или подложки).Другая возможность состоит в том, что существует функциональная избыточность между различными механочувствительными каналами, как это было постулировано для бактериальных каналов Msc (22). Было бы интересно изучить клетки с комбинированным удалением двух и более каналов. Кроме того, обе клетки pkd2 и mcln , по-видимому, имели некоторые различия в ответе актина после начального пика. Неспособность установить направленный ответ может потенциально объяснить аберрантную миграцию этих клеток, даже если первоначальный ответ устойчив, хотя в текущем исследовании это не рассматривалось.Взятые вместе, эти результаты предполагают, что реакция на механические стимулы требует общего притока кальция, который, вероятно, опосредуется IplA. Участвуют ли в этом остром ответе специфические механочувствительные каналы, остается открытым вопросом.

Возможно, несколько удивительным было наблюдение, что ответ на острую механическую стимуляцию был снижен в клетках, которые лишены субъединиц β или γ G белков. Напротив, клетки, лишенные обоих основных хемоаттрактантных рецепторов cAR1 и cAR3, по-прежнему реагировали.Кроме того, маловероятно, что растворимые факторы, связывающиеся с другим GPCR, опосредуют ответ, потому что перфузионные клетки все еще были способны реагировать на силу сдвига. Тем не менее, возможно, что G-белки непосредственно участвуют в преобразовании механического стимула в биохимический ответ. Фактически, очищенные G-белки в фосфолипидных везикулах активировались в ответ на острое напряжение сдвига в отсутствие других белковых компонентов (23). Однако клетки, лишенные β- или γ-субъединиц G-белков, мигрируют медленнее случайным образом в результате хемотаксиса, электротаксиса и сдвигового потока, а также недостаточны для фагоцитоза, что позволяет предположить, что дефект механочувствительности может быть связан со сниженной исходной активностью (13, 24⇓). –26).

Тот факт, что все возмущения нескольких сетей подавляют реакцию, предполагает, что механический стимул может входить в несколько точек или что изменения, которые влияют на базальное состояние активации возбудимой сети передачи сигнала, также могут влиять на чувствительность к механическим стимулам. В самом деле, возмущения в самой сети передачи сигналов снижали реакцию на механическую стимуляцию. Как отмечалось выше, истощение кальция блокировало реакцию. Кроме того, мы наблюдали выраженное ингибирование (~ 60%) в клетках, у которых отсутствует активность в четырех параллельных путях (sGC, PLA 2 , Pia и PI3K).Эти возмущения коррелировали со значительным уменьшением случайной миграции этих клеток (рис. 4) (8, 27). Нарушение других сетей за счет нарушения G-белков или актинового цитоскелета также влияет на кажущуюся возбудимость сети передачи сигналов (8, 9, 28). Даже если стимул введен в какой-то момент, например, через актиновый цитоскелет, активация сети передачи сигнала может потребоваться для усиления сигнала. Поскольку сеть передачи сигналов является возбудимой, ее активация требует пересечения порогового значения, и ожидается, что любое возмущение, повышающее порог, ограничит усиление.Присущая вариация в базальном состоянии активации отдельных клеток также, вероятно, объясняет вариацию в ответе, наблюдаемую на фиг. 1 F и G .

Активация сигнальной трансдукции и цитоскелетных сетей в ответ на стимул острого напряжения сдвига не просто следствие миграции клеток в непрерывном потоке, но, вероятно, является предпосылкой для этого способа направленной миграции. Когда клетки стимулируют сдвиговым потоком в течение 10 с, пик реакции наблюдается до окончания стимула, после чего следует временная пауза в миграции.Кроме того, непрерывное воздействие потока сначала вызывает кратковременный всплеск активации передачи сигнала и цитоскелетных сетей, за которым следует направленный ответ и миграция. Эта серия событий аналогична реакции клетки при первом воздействии градиента хемоаттрактанта. Он также показывает однородный отклик, за которым позже следует поляризованный отклик в направлении градиента.

Серия событий, описанных выше, может объяснить миграцию, вызванную сдвиговым потоком, против течения.Мы и другие наблюдаем миграцию клеток WT против потока при более низких уровнях напряжения сдвига, тогда как при более высоких уровнях напряжения сдвига клетки начинают мигрировать в направлении потока (4, 13). Миграция против потока может происходить, если сдвиговый поток стимулирует сеть передачи сигнала и полимеризацию актина, предпочтительно на переднем крае клетки. Соответственно, G-протеин-нулевые клетки, которые не реагировали на острую механическую стимуляцию в типичных условиях, были неспособны мигрировать против потока, но могли мигрировать с потоком.Это говорит о том, что миграция с потоком не зависит от острой реакции. Клетки, мигрирующие с потоком, обнаруживают маркеры переднего края, такие как PIP3, в передней части клетки (7), но это, вероятно, является следствием большего количества псевдопод в направлении миграции. Важно отметить, что значения напряжения сдвига, которые вызывали миграцию против или с потоком, были достаточными для индукции острой реакции. Фактически, даже несмотря на то, что на основе кривой дозы низкие значения напряжения сдвига, которые использовались для анализа миграции, не вызывают полного ответа, когда стимуляция является непрерывной, переходная реакция, вероятно, приближается к насыщению, как видно из рис.3 A (2- против 10-секундного отклика при 15 дин / см 2 ). Также стоит отметить, что дефекты в индуцированной сдвиговым потоком миграции клеток, лишенных Pkd2 или Mcln, которые не были дефектными в нашем анализе, были зарегистрированы в условиях относительно высокого сдвигового потока (15). В целом возможность того, что миграция против потока или вместе с ним включает в себя различные механизмы, интригует и требует дальнейшего изучения.

До сих пор очень мало исследований касалось того, как обрабатываются различные внешние стимулы и существует ли интеграция различных входных сигналов.Ли и др. исследовали миграцию Т-клеток в присутствии электрического поля и противоположного градиента хемоаттрактанта (29). В их исследовании клетки продолжали мигрировать с той же скоростью к катоду, хотя их направленность была значительно нарушена противоположным градиентом хемоаттрактанта. Этот вывод согласуется с нашей моделью, в которой различные стимулы объединяются вместе на уровне сети передачи сигнала, и, таким образом, общий ответ зависит от относительной силы двух стимулов.Хотя это технически сложно, будущие исследования должны оценить поведение клеток, которые одновременно подвергаются сдвиговому потоку и градиенту хемоаттрактанта.

Ответ на острую механическую стимуляцию, по-видимому, является консервативным явлением, по крайней мере, среди клеток, претерпевающих амебоидную миграцию. Подобно Dictyostelium , нейтрофилы и Т-лимфоциты также ранее сообщалось о направленной миграции в ответ на сдвигающий поток (30, 31). Однако вопрос о том, является ли острый ответ, наблюдаемый в нейтрофилах человека в этом исследовании, предпосылкой для миграции, вызванной сдвиговым потоком, как это имеет место в случае Dictyostelium , еще предстоит изучить.Мы предполагаем, что реакция на острую механическую стимуляцию, наблюдаемую в этом исследовании, не является специфической для сдвигового потока, но, вероятно, представляет собой реакцию на любое механическое возмущение. И Dictyostelium , и мигрирующие клетки млекопитающих постоянно подвергаются физическим сигналам, когда они перемещаются через трехмерные матрицы в почве или интерстициальном пространстве, соответственно, и эти сигналы, вероятно, интегрируются с другими направленными сигналами, чтобы направлять миграцию клеток.

Наше исследование демонстрирует, что острый механический стимул непосредственно активирует огромное количество молекул в цепи передачи хемотаксического сигнала и в сетях актинового цитоскелета.Большинство исследований направленной миграции сдвигового потока изучали клетки в стационарных условиях, и такой ответ на начальное применение сдвигового потока не наблюдалось. Мы предполагаем, что общая сеть передачи сигналов лежит в основе ответов не только на химические и механические стимулы, но и на другие внешние воздействия, например, изменения в электрических полях, хотя это еще предстоит проверить.

SI Материалы и методы

Культура клеток.

Клетки Dictyostelium discoideum поддерживали в стандартных условиях либо в планшетах для культивирования тканей, либо в суспензии в среде HL-5 с антибиотиками.Для анализа вегетативных клеток клетки выращивали в присутствии Klebsiella aerogenes на пластинах SM. Клетки K. aerogenes выращивали в суспензии на среде HL-5 без антибиотиков при комнатной температуре в течение 16–18 часов. Небольшое количество клеток D. discoideum (∼1 × 10 5 для большинства штаммов) в среде HL-5 без антибиотиков распределяли вместе с 260 мкл суспензии K. aerogenes на планшете SM и выращивали в течение 36–36 дней. 48 ч. Как только клетки начали очищать бактериальный газон, их собирали и трижды промывали развивающим буфером (DB): фосфатным буфером (PB) с добавлением 2 мМ MgSO 4 и 0.2 мМ CaCl 2 , пока все бактерии не будут смыты. Конечный осадок клеток ресуспендировали в буфере DB, если не указано иное, до плотности ~ 5 × 10 6 клеток / мл. Для анализа развитых клеток клеток D. discoideum собирали во время экспоненциального роста, голодали и обрабатывали 50 нМ цАМФ каждые 6 минут, как описано ранее (32). Анализ проводился на клетках, которые голодали около 4 часов.

В данном исследовании использовался штамм WT Ax2, щедро предоставленный R.Кей, Лаборатория молекулярной биологии Совета медицинских исследований, Кембридж, Великобритания). Штаммы cAR1 / 3 , aca и gpbA были описаны ранее (25, 33, 34). gpgA клеток любезно предоставлены Y. Kamimura и M. Ueda, Университет Осаки, Осака. IplA , mcln и pkd2 клеток были сгенерированы на фоне Dh2–10 WT, и были щедро предоставлены P.Коссон, Женевский университет, Женева (15). sGC , sGC / pla2 и sGC / pla2 / pia клеток были щедро предоставлены A. Kortholt, University of Haasteringt и PJ van Gasteringt Гронинген, Нидерланды. myoII клеток любезно предоставлены Д. Н. Робинсоном, Университет Джона Хопкинса, Балтимор (35).

В данном исследовании использовались следующие конструкции: LimE Δcoil -RFP, GpgA, PH CRAC -GFP, PTEN-GFP, CynA-GFP (36), RalGDS-GFP (37) и RBD Raf . -GFP (любезно предоставлено А.Kortholt и P. J. van Haastert). Клетки, несущие плазмиды, отбирали либо с 20 мкг / мл G418, либо с 50 мкг / мл гигромицина B по мере необходимости в течение по крайней мере 1 недели перед анализом.

Генерация пьезоэлементов.

piezo клеток были получены путем замены первых 3015 из 3080 нуклеотидов в кодирующей последовательности гена, кодирующего белок, содержащий повтор инволюкрина (DDB_G0282801), гомолог Piezo (16), на BSR кассету путем гомологичной рекомбинации (38).Нокаут-конструкцией трансформировали клеток D. discoideum Ax2. Трансформанты отбирали с использованием 10 мкг / мл сульфата бластицидина S, клонально высевали на лужайку K. aerogenes , и отдельные клоны проверяли на успешное разрушение гена с помощью ПЦР и саузерн-блоттинга.

Механическая стимуляция.

Для оценки изменений фосфорилирования белка в ответ на острый сдвигающий поток 2 × 10 6 развитых клеток помещали в чашки диаметром 35 мм с 2 мл DB.Клеткам давали возможность прикрепиться в течение 10 мин, а затем дважды промывали 1 мл DB. Для экспериментов по оценке роли Ca 2+ PB вместо DB использовался для промывок и для всех последующих стадий. После последней промывки клетки инкубировали в DB с 2,5 мМ кофеина без какого-либо нарушения планшетов. Там, где указано, клетки инкубировали с 0,1–5,0 мкМ LatA (Enzo Life Sciences, номер по каталогу BML-T119-0100), 5–50 мкМ беномилом (Sigma-Aldrich, номер по каталогу 45339) или 0,1% носителем ДМСО. во время базализации кофеином.Для применения сдвигового потока планшет помещали на орбитальный шейкер (New Brunswick Scientific G-33), который немедленно включали при 150 об / мин (если не указано иное) на 5 с. Буфер аспирировали в указанные моменты времени после начала стимуляции. Клетки немедленно лизировали на льду с использованием 100 мкл буфера для образцов с ингибиторами протеаз и фосфатаз [62,5 мМ Tris⋅HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 42 мМ DTT, 0,01% бромфенолового синего, 50 мМ NaF, 2 мМ Na 3 VO 4 , 25 мМ, NaPP i , 1 × полная смесь ингибиторов протеазы без ЭДТА (Roche)], собирали и кипятили в течение 10 мин.В течение «времени 0» клетки лизировали без встряхивания. Белки разделяли с помощью 4–15% полиакриламидного геля Tris⋅HCl (Criterion, Bio-Rad), переносили на поливинилиденфторидную мембрану, блокировали и подвергали иммуноблоттингу фосфо-PKCζ Thr410 (для обнаружения фосфо-PKBR1 и фосфо-PKBA; Cell Signaling Technology) или фосфо-Mst1 Thr183 (для обнаружения фосфо-KrsB; Cell Signaling Technology). Сигнал обнаруживали путем инкубации с конъюгированным с пероксидазой хрена вторичным антителом против кролика (GE Healthcare) с последующей хемилюминесценцией с использованием субстрата Clarity Western ECL (Bio-Rad).Затем блот очищали буфером для удаления вестерн-блоттинга Restore Plus (Pierce) и повторно зондировали первичным антителом против фосфо-p42 / 44 MAPK Thr302 / 304 (для обнаружения фосфо-ERK2; Cell Signaling Technology) или KrsB (38). Равную загрузку белка подтверждали окрашиванием мембраны из поливинилиденфторида CBB.

Для анализа поведения отдельных клеток после острой механической стимуляции вегетативные или развитые клетки высевали при ∼1 × 10 6 клеток / мл в µ-Slide III 3in1 (Ibidi) и оставляли для прикрепления в течение 10 мин. .Если не указано иное, клетки находились в БД. Для экспериментов по оценке роли Ca 2+ анализ проводили в трициновом буфере (ТВ) (5 мМ трицин, pH 7,0 с 5 мМ KCl). Слайд соединяли с системой Ibidi Pump System, и клетки на короткое время промывали буфером. Изображения получали при освещении RFP или GFP на инвертированном микроскопе Zeiss Observer.Z1, оборудованном масляным объективом 40 × / 1,3 с интервалами 3 с. Для биосенсоров PTEN, CynA и RalGDS изображения получали с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском UltraView (DM 16000; Perkin-Elmer), оснащенного 40 × / 1.25–0,75 масляный объектив. После пяти кадров поток был включен при определенном давлении, чтобы получить указанные значения напряжения сдвига. Подача прекращалась через 2, 5 или 10 с. Стимуляцию повторяли, как указано. Обратите внимание на напряжение сдвига, которое было создано с помощью этой установки, варьировалось от ~ 5 дин / см 2 (0,5 Па, 0,5 пН / мкм 2 ) с использованием только силы тяжести до ~ 60 дин / см 2 (6 Па, 6 пН / мкм 2 ) при максимальной настройке давления. Где указано, клетки сначала подвергали воздействию потока при ~ 5 дин / см 2 в течение нескольких минут с последующей стимуляцией при ~ 60 дин / см 2 в течение 5 с.При тестировании эффектов различных обработок на реакцию клеток на механическую стимуляцию слайд соединяли с двумя линиями: одна была заполнена соответствующим носителем, а другая — 5 мкМ LatA, 50 мкМ беномила, 50 мкМ LY294002 (Cell Signaling Technology, cat. № 9901), 1 или 10 мМ CaCl 2 (в ТБ) или 10 мМ ЭГТА (в ТБ). После выполнения стимуляции носителем линии меняли местами, клетки промывали буфером, содержащим указанное лечение, и инкубировали в течение 30 минут, позволяя буферу течь через каждые ~ 10 минут.На всех показанных изображениях поток применяется слева направо, за исключением Рис. 1 D и E и Фиг. S1 C , где поток применяется сверху вниз. Для стимуляции gpbA при более высоких значениях стресса (фиг. 4 E , нижний ряд ) клетки анализировали с использованием µ-Slide I 0,2 (Ibidi).

Для альтернативного подхода к стимуляции клеток с помощью сдвигового потока, 25 мкл капель ∼7,5 × 10 5 клеток / мл высевали в однолуночную камеру (Lab-Tek, Thermo Scientific, Nunc), позволяя прилипать в течение по крайней мере 10 мин, покрытые DB и экспонированные микропипеткой, заполненной DB.Компенсационное давление поддерживали на уровне 1500 фунтов на квадратный дюйм. Клетки были изображены, как указано выше. В указанное время была применена функция очистки, которая высвобождает болюс жидкости из микропипетки, с последующим возвратом в поток только после компенсации давления.

Для экспериментов, в которых мы оценивали взаимодействие между механической и химической стимуляцией, капли 20 мкл ∼1 × 10 6 клеток / мл в DB высевали в восьмилуночную камеру (Lab-Tek, Thermo Scientific, Nunc ) и оставлен на 10 мин.Для применения механической стимуляции в лунку быстро добавляли 430 мкл DB. Через 12 или 45 с после механической стимуляции в ту же лунку добавляли 50 мкл фолиевой кислоты (конечная концентрация 20 нМ) или носителя (DB), не вызывая механического ответа. Изображения были получены, как указано выше.

Анализ изображений.

После получения изображения фон вычитался, и средняя интенсивность в прямоугольнике, нарисованном в цитоплазме данной клетки, регистрировалась для каждого кадра с использованием ImageJ 1.50g программное обеспечение (NIH) (39). Значения были нормализованы для времени 0 и инвертированы, чтобы отразить накопление сигнала в коре головного мозга. Для Фиг.2 B площадь ячейки была рассчитана с использованием двоичного изображения как количество пикселей, умноженное на 0,1024 мкм 2 / пиксель. Чтобы вычислить новую покрытую площадь, мы вычли двоичное изображение ячейки в кадре ( n -1) из кадра n . Поскольку изображение является двоичным, только новые пиксели, занимаемые ячейкой, которые соответствуют выступам, вычисляются и преобразуются в площадь, как указано выше.Ретракции клеток в анализ не включались.

Для построения кимографов отдельных клеток изображения были автоматически настроены по яркости и контрастности с помощью ImageJ. Для конфокальных изображений также вычитался фон. Чтобы сегментировать изображение, мы проделали следующие манипуляции в ImageJ: отрегулировали порог заполнения ячейки, сделали изображение двоичным, заполнили дыры, расширили. Сегментированные изображения были проанализированы с использованием специальной функции Matlab (MathWorks), как описано ранее (40).

Тепловые карты были сгенерированы с использованием специальной функции Matlab (MathWorks) путем нанесения значений, нормированных на время 0, для отдельных ячеек в рамках эксперимента.Для сравнения тепловых карт были установлены границы 0,5 и 2,0, которые включали большую часть данных. Если ответ одной ячейки выходит за эту границу, это отображается как насыщенный сигнал на тепловой карте.

Анализ подвижности.

Для анализа случайной подвижности ~ 1 × 10 5 вегетативных клеток помещали в восьмилуночную камеру (Lab-Tek, Thermo Scientific, Nunc) в DB, ​​давали возможность прикрепиться в течение 10 минут, с добавлением LY294002 до конечной точки. концентрации 50 мкМ или 0,1% ДМСО, и инкубируют в течение 50 мин.Изображения получали с фазовой подсветкой на инвертированном микроскопе Zeiss Observer.Z1 с 20-кратным объективом с интервалом 20 с.

Сдвиговый поток, а также случайная миграция gpbA , gpgA + GpgA и клеток WT оценивали с использованием насосной системы Ibidi, как описано для механической стимуляции. После посева клетки сначала визуализировали без потока (случайная миграция) в течение 15 мин. Затем подавали поток со скоростью ~ 10 дин / см 2 в течение 15 минут, а затем переключили на 25 дин / см 2 еще на 15 минут, как указано.Изображения были получены с фазовой подсветкой с интервалом 15 с, как указано выше. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения Tracking Tool PRO (v2.0).

Иммунофлуоресценция.

Приблизительно 1 × 10 5 клеток были засеяны в восьмилуночную камеру (Lab-Tek, Thermo Scientific, Nunc) в БД, позволили прикрепиться в течение 10 мин, переключили на БД с 50 мкМ беномила или 0,2% ДМСО, и инкубировали 30 мин. Клетки фиксировали фиксирующим раствором (2% параформальдегид, 0,8% глутарового альдегида, 0,05% Triton X-100 в среде HL-5) в течение 10 мин, гасили 20 мМ глицином в PBS, дважды промывали промывочным раствором (0.05% Triton X-100, 0,5% BSA в 1 × PBS), блокировали PBS / 3% BSA и инкубировали с первичным антителом против α-тубулина (YL1 / 2, ThermoFisher Scientific, каталожный номер MA1-80017) в блокирующем растворе в течение ночи при 4 ° C. Лунки дважды промывали промывным раствором и инкубировали с конъюгированными с Alexa Fluor 488 козьими вторичными антителами против крыс в блокирующем растворе при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки промывали промывочным раствором трижды, ополаскивали и хранили в 1 × PBS при 4 ° C. Изображения были получены с использованием освещения GFP на Zeiss Observer.Инвертированный микроскоп Z1 с масляным объективом 40x / 1.3.

Механическая стимуляция и анализ клеток HL-60.

Клетки HL-60 культивировали и дифференцировали, как описано ранее (40). Дифференцированные клетки промывали модифицированным HBSS (mHBSS), ресуспендировали в mHBSS с добавлением 0,2% BSA, высевали в µ-Slide III 3in1 (Ibidi) и позволяли прикрепиться в течение 10 минут при 37 ° C. Клетки механически стимулировали, как описано выше для клеток Dictyostelium , с использованием mHBSS / 0.2% BSA. Фазовые изображения получали с помощью инвертированного микроскопа Zeiss Observer.Z1, оснащенного 20-кратным объективом, с интервалом 15 с. Площадь клетки измеряли, вручную очерчивая периметр клетки в каждый момент времени с помощью программного обеспечения ImageJ 1,50 g.

Статистический анализ.

Непарный двусторонний тест t использовался для оценки различий между двумя образцами. Для сравнения множественных выборок использовали дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями и посттест Стьюдента – Ньюмана – Кеулса. П <0.05 считалось значительным.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Pierre Cosson, Peter J. van Haastert, Yoichiro Kamimura, Robert R. Kay, Arjan Kortholt, Douglas N. Robinson и Masahiro Ueda, а также dictyBase для предоставления экспрессионных конструкций и штаммов, используемых в этом исследовании, и члены P.N.D. Лаборатория для полезных предложений и обсуждения. Эта работа была поддержана грантом NIH R35 GM118177 (P.N.D.).

Сноски

  • Автор: Y.А. и П.Н.Д. спланированное исследование; Y.A., L.A. и J.B. проводили исследования; P.A.I. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Ю.А. и Лос-Анджелес проанализировали данные; и Ю.А. и П.Н.Д. написал газету.

  • Рецензенты: П.К., Университет Калгари, медицинский факультет; и C.A.P., Национальный институт рака, NIH.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073 / pnas.1608767113 / — / DCSupplemental.

Механические системы и обработка сигналов — Журнал

Механические системы и обработка сигналов (MSSP) — междисциплинарный журнал в области машиностроения, авиакосмической промышленности и гражданского строительства, целью которого является освещение научных достижений высочайшего качества, связанных с новыми технологиями в области машиностроения. зондирование, приборы, обработка сигналов, моделирование и управление динамическими системами. Ожидается, что документы MSSP внесут очевидный оригинальный вклад в инженерные знания, который должен быть значительным с точки зрения продвижения по сравнению с установленными методами.Особенно востребованы статьи, которые включают как теоретические, так и экспериментальные аспекты или содержат теоретический материал, имеющий большое значение для практических приложений. MSSP является лидером в своей области и охватывает следующие области исследований:

  • Обработка сигналов при мониторинге состояния оборудования
  • Нестационарные и случайные колебания
  • Методы временных рядов
  • Динамика ротора
  • Обработка сигналов при производстве / обработке
  • Силовые агрегаты и трансмиссии
  • Акустика, волны и SEA
  • Контроль вибраций и шума
  • Контроль состояния конструкций
  • Идентификация конструкции
  • Нелинейные колебания (включая сбор энергии)
  • Количественная оценка неопределенности в инженерной динамике

Рассмотрены следующие области исследований быть за рамками MSSP:

  • Многотельная динамика и робототехника, включая управление роботами
  • Управление транспортными средствами
  • Теоретический контроль — статьи, лучше подходящие для специализированного журнала управления
  • Теоретическая нелинейная d динамика без экспериментальной проверки
  • Количественная оценка неопределенности без четко определенной значимости для инженерной динамики

Документы, представленные в MSSP, должны включать в сопроводительное письмо четкое изложение первоначального научного вклада работы.Об этом также следует кратко заявить в аннотации и расширить во введении. Также во Введении важно четко определить конкретную проблему, рассматриваемую с учетом всех сделанных условий и допущений, и сопоставить ее вклад как с исторической литературой (обычно в хронологическом порядке), так и с состоянием искусства. Состояние дел следует, насколько это возможно, резюмировать и классифицировать, но не просто перечислять документы. Конкретная причина (ы) для внедрения нового метода или подхода должна стать ясной на основе представленного состояния техники.Любые преимущества предлагаемых методов по сравнению с общепринятыми методами должны быть четко и подробно объяснены, включая сравнительные испытания и экспериментальные данные, где это возможно.

MSSP стремится поддерживать высокий уровень письменного английского языка, и ответственность за то, чтобы язык был понятным, лежит на авторах. Невыполнение этого требования может привести к отклонению вашей статьи.

Авторам статей, посвященных машинному обучению или обработке сигналов, следует ознакомиться с руководящими принципами MSSP по этим темам: https: // media.journals.elsevier.com/content/files/machine-learning-04180327.pdf
https://www.elsevier.com/__data/promis_misc/SignalProcessing.pdf

Механические сигналы

как неинвазивное средство воздействия на мезенхимальные стволовые клетки Судьба, развитие костей и подавление жирового фенотипа

Bonekey Osteovision. Авторская рукопись; доступно в PMC 2012 11 января.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC3255555

NIHMSID: NIHMS228511

Yen K.Luu

1 Диабетический исследовательский центр, Медицинский факультет, Отдел эндокринологии, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Бронкс, Нью-Йорк, США

Джеффри Э. Пессин

1 Диабетический исследовательский центр, Медицинское отделение, Отделение Эндокринология, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Бронкс, Нью-Йорк, США

Стефан Джудекс

2 Департамент биомедицинской инженерии, Университет Стони Брук, Стоуни-Брук, Нью-Йорк, США

Джанет Рубин

3 Департамент медицины, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США

Клинтон Т.Рубин

2 Департамент биомедицинской инженерии, Университет Стоуни-Брук, Стони-Брук, штат Нью-Йорк, США

1 Центр исследований диабета, Департамент медицины, Отдел эндокринологии, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Бронкс, Нью-Йорк, США

2 Департамент биомедицинской инженерии, Университет Стоуни-Брук, Стоуни-Брук, штат Нью-Йорк, США

3 Департамент медицины, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, штат Северная Каролина, США

См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья .

Abstract

Плюрипотентные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) считаются идеальными терапевтическими мишенями в регенеративной медицине, поскольку они обладают способностью дифференцироваться в соединительные ткани более высокого порядка. Возможность использования МСК для лечения заболеваний и ускорения восстановления будет в конечном итоге зависеть от лучшего понимания того, как физические и / или химические сигналы регулируют их активность, и способности экзогенных стимулов усиливать пролиферацию МСК и определять судьбу МСК.Недавнее понимание того, что остеопрогениторы костного мозга обратно пропорциональны предшественникам адипоцитов, предполагает, что их общий предшественник, MSC, будет связываться с одним клоном за счет другого. Эта взаимосвязь может способствовать фенотипу людей, ведущих сидячий образ жизни, у которых больше жира и меньше костей, и наоборот, в результате упражнений будет меньше жира и больше костей. Механическое смещение отбора клонов МСК предполагает, что физические сигналы могут влиять на количество как жира, так и костей через пути развития, а также метаболические или адаптивные пути.Принимая во внимание недавнее открытие, что механические сигналы малой величины (LMMS) подавляют развитие подкожного и висцерального жира без увеличения расхода энергии, это указывает на то, что МСК идеально позиционируются как механочувствительные элементы, имеющие центральное значение для скелетно-мышечной адаптации, но что сигналы не должны быть сильными. быть влиятельным. Смещение дифференцировки МСК механическими сигналами представляет собой уникальное средство подавления ожирения, одновременно способствуя улучшению скелета, и может обеспечить основу для безопасной, неинвазивной, нефармакологической стратегии предотвращения как ожирения, так и остеопороза, но все же однозначно — без воздействия на резидентные жировые или костные клетки.

Введение

Остеопороз и ожирение, две из самых страшных болезней в США, затрагивают более 30% населения Америки и приводят к ежегодным расходам на здравоохранение почти в 200 миллиардов долларов. (1) Остеопороз, заболевание, характеризующееся пониженной плотностью костей, является одним из наиболее распространенных возрастных заболеваний, при котором атравматические переломы серьезно ухудшают качество жизни человека. По оценкам Главного хирурга США, 50% женщин старше 65 подвержены риску перелома костей, и в течение 50 лет затраты на профилактику и лечение только этого заболевания могут превысить 250 миллиардов долларов.(1) Переходя от пожилых к молодым, консервативные оценки показывают, что 25% американских детей имеют избыточный вес, а 11% страдают ожирением; (2) оба процента значительно выше, чем всего 10 лет назад. Эта тучная популяция предрасположена к диабету 2 типа (3) и повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний и рака в течение жизни (4).

До 1994 года сахарный диабет 2 типа был необычным для детей; однако в настоящее время некоторые клиники сообщают, что до одной трети детей-подростков с диабетом страдают заболеванием типа 2 (5–7).Висцеральное ожирение и повышенный уровень свободных жирных кислот сильно коррелируют с инсулинорезистентностью (8), проблемой, которая становится еще более серьезной по мере того, как дети с избыточным весом превращаются во взрослых с ожирением (9). Факторы образа жизни, в частности отсутствие физической активности и плохое питание, являются важными целями для первичной профилактики ожирения и диабета. Исследования на взрослых показывают, что изменение образа жизни и потеря веса могут снизить инсулинорезистентность, улучшить показатели гликемического контроля и уменьшить липемию (10; 11).К сожалению, контролируемые клинические испытания, направленные на определение того, могут ли изменения образа жизни предотвратить диабет 2 типа у взрослых (12; 13), редко бывают успешными или устойчивыми среди населения США в целом, поскольку прибавка в весе и сопутствующие ему осложнения быстро возвращаются. У детей даже самые исчерпывающие интервенционные исследования, финансируемые из федерального бюджета, не дали убедительных положительных результатов (14; 15). Роль упражнений в предотвращении ожирения сосредоточена на расходе калорий, но игнорируется любая «неметаболическая» роль.В недавнем комментарии в статье Obesity (16) говорится об относительном успехе интенсивных вмешательств, связанных с физической активностью, но предполагается, что положительные результаты на самом деле частично связаны с механическая стимуляция тканей, а не метаболизм калорий.

В то время как остеопороз и ожирение привлекли большое внимание общественности, эффективные и безопасные фармакологические вмешательства в любом масштабе для любого заболевания оказались труднодостижимыми.Даже контрольный из либо остеопороз, либо ожирение оказались трудными: возможно, наиболее распространенным этиологическим фактором является «малоподвижный образ жизни», а наиболее частым вмешательством являются упражнения (17), что указывает на решающую роль механических сигналов в определении состояния костей и костей. масса жира. Но является ли эта болезненная реакция на механические сигналы совпадением или существует биологическая связь? Здесь исследуется способность механических сигналов влиять на жировой и костный фенотип, не столько с точки зрения прямого механического воздействия на резидентную популяцию жировых или костных клеток, сколько с точки зрения принятия решений их общего предшественника, мезенхимального ствола. ячейка (MSC) ().

Схематическое изображение клонального потенциала мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в костном мозге. Развитие зрелых клеток, таких как адипоциты и остеобласты, происходит через промежуточные клетки-предшественники, преостеобласты и преадипоциты. Хотя это не было полностью охарактеризовано, несколько комбинаций поверхностных маркеров были использованы для обогащения МСК, а также коммитированных, но еще не полностью дифференцированных клеток-предшественников. Процессы коммитирования и дифференцировки сложны и также недостаточно хорошо изучены, но было показано, что определенные факторы транскрипции, такие как Runx2 (кость) и PPARγ (жир), способствуют дифференцировке одного типа клеток и подавляют дифференцировку другого.

Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Количество исследований, изучающих терапевтический потенциал MSCs, быстро увеличилось в последние годы (18–20), но понимание того, что движет принятием решений в отношении этих предшественников, остается на начальной стадии. Эту трудность усугубляет конкретная идентификация in situ и ex vivo того, что на самом деле составляет популяцию МСК, является источником жарких споров, поскольку выделение стволовых клеток от их соседей оказалось разочаровывающим на основе современных гистологических и цитометрических методов.Чтобы проиллюстрировать эту точку зрения, комбинация маркеров, которые отличают как МСК, так и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) от 99,9% других клеток, находящихся в костном мозге, дает популяцию, оцениваемую в лучшем случае с чистотой 3% (21).

Для MSCs, экспрессия специфических эксклюзивных поверхностных маркеров еще не была хорошо охарактеризована, и особенности, которые категорически определяют MSCs, не описаны. Хотя клеточные популяции, полученные с помощью современных методов выделения, представляют собой по существу гетерогенные смеси нескольких типов клеток, они, безусловно, обогащены МСК (22).Неудивительно, что вопрос о том, какие факторы определяют, дифференцируется ли МСК в адипоцит, остеобласт или другой тип клеток, остается неизвестным и является предметом интенсивных исследований. Из различных сигналов, способных вызывать дифференцировку, сообщалось о различных биохимических факторах, которые обычно приводят к дифференцировке в направлении одного типа клеток с параллельным подавлением другого пути. Недавняя работа по дифференцировке остеобластов от МСК выдвигает на первый план открытие, что на решения клеточной судьбы может заметно влиять активация очень небольшого подмножества конкретной сигнальной сети, вместо того, чтобы требовать больших сдвигов экспрессии генов (23).Таким образом, даже незначительные изменения в среде MSC могут иметь драматические эффекты на фенотип.

Механическая стимуляция для индукции дифференцировки клеток

Помимо биохимических факторов, способных изменять судьбу стволовых клеток, механические сигналы становятся все более важными и взаимодействующими в определении пути дифференцировки. Механотрансдукция — это процесс, с помощью которого клетки преобразуют сигналы, вызванные физической силой, в биохимические реакции, что приводит к изменению экспрессии генов, функции и морфологии клеток и продукции внеклеточного матрикса.Этот адаптивный процесс имеет решающее значение для обеспечения соответствующих реакций на акклиматизацию и приспособление к функциональной нагрузке во многих тканях (24). Основа механотрансдукции заключается в том, что клетки образуют сети, которые связаны комплексами межклеточной адгезии, такими как адгезивные соединения, щелевые соединения или локальные паракринные сигналы (25). Эти сети способны действовать как интегрированные единицы для преобразования различных стимулов, таких как механическая нагрузка, в скоординированные реакции тканей. Неудивительно, что для передачи механического сигнала требуется взаимодействие многих сигнальных путей (25), и из-за сложности это все еще недостаточно охарактеризовано.Различные пути, такие как взаимодействия клетки с внеклеточным матриксом, цитокины, передача вторичных мессенджеров через щелевые соединения и межклеточные адгезивные соединения, позволяют клеткам передавать механические сигналы другим клеткам (26).

В качестве примера клеточной механотрансдукции в определении клонов роль механических сил в контроле адипогенеза была связана с изменениями белков внеклеточного матрикса (ЕСМ) и матриксных металлопротеиназ (27). Компоненты ECM играют важную роль в регуляции ремоделирования жировой ткани во время дифференцировки адипоцитов, путем трансляции клеточных сигналов, которые могут изменять транскрипцию гена адипоцитов во время адипогенеза (28).Примеры важности механических сигналов для костей и костного мозга освещены в следующем разделе.

Механотрансдукция в костном и костном мозге

В основе сути механотрансдукции лежит необходимость того, чтобы определенные клетки в биологической среде могли действовать как рецепторы, которые, в свою очередь, могут генерировать вторичные цитогенные сигналы, нацеленные на клетки-мишени. То, как механические факторы ощущаются в кости, составляет большой объем активных исследований с множеством различных гипотез относительно механосенсорного элемента (29; 30).Преобладает мнение, что остеоциты отвечают за обнаружение механических сигналов и реагируют, передавая сигналы эффекторным клеткам, остеобластам и остеокластам, которые модулируют фактическое формирование и резорбцию кости (31; 32). Однако механической нагрузке подвергаются не «просто» костный матрикс и клетки, заключенные в материале. Столь же сложным является множество сил, возникающих в полости костного мозга в ответ на механическую нагрузку, и включает в себя деформацию, давление, поток жидкости, электрические потенциалы и ускорение (32).Несмотря на то, что механотрансдукция клетками опорно-двигательного аппарата долгое время была в центре внимания исследований и развития технологий, способность механических сигналов влиять и изменять паттерны дифференцировки МСК была отмечена только недавно (33; 34).

Внутри взаимодействия кость / костный мозг заключена концепция «ниши» стволовых клеток, специализированного места, где располагаются и регулируются плюрипотентные клетки. Мысль о том, что полость костного мозга представляет собой такую ​​нишу, стала популярной в последние годы, поскольку эндостальная поверхность кости является основным местом регенерации костного мозга (35; 36).Несколько моделей с использованием трансгенных мышей показали, что увеличение гематопоэза происходит в сочетании с увеличением как остеобластов, так и трабекулярной кости, поскольку увеличение размера ниши необходимо для поддержки увеличения HSC (37). Было высказано предположение, что внутри этой ниши остеобласты могут играть прямую роль в функции стволовых клеток, обеспечивая поддержку HSC (38). Таким образом, способность механических сил вызывать изменения в кости и костном мозге взаимосвязаны, и, возможно, способность кости реагировать на механические сигналы может дать представление о способности клеток костного мозга реагировать.

Отсутствие механических сигналов способствует появлению жирового фенотипа

Локальное истощение костной ткани, которое происходит при старении, постельном режиме и другом сидячем образе жизни, сопровождается уменьшением механических сигналов, отражающих динамику сократимости мышц (39). Конечно, возможно, что отсутствие механического сигнала, приводящего МСК к формированию кости и / или мышц (40), позволяет дифференцировать МСК, чтобы они преимущественно передавались или по умолчанию передавались в другой клон, такой как адипоциты.Магнитно-резонансная томография (МРТ) предоставляет доказательства этой ассоциации, показывающей, что у женщин в постменопаузе в костном мозге вдвое больше жира, чем у женщин в пременопаузе, и что у женщин с низкой плотностью костного мозга больше жира в костном мозге, чем у женщин с нормальной плотностью костей ( 41). Процесс старения обычно связан с перераспределением жира из периферических депо в органы (, т.е. . Костный мозг, печень и мышцы). Причинно-следственная связь обратной связи между костью и костным мозгом не ясна, и, безусловно, другие факторы, такие как возраст, уровень активности и гормональный статус, также влияют на реакцию.Важно отметить, что применение механических сигналов к МСК в культуре может эффективно подавлять их дифференцировку в сторону адипогенеза, даже в условиях культивирования, которые явно предпочитают «жировой» путь (42). Таким образом, хотя механические сигналы обеспечивают ключевые анаболические сигналы к формированию кости, также оказывается, что отсутствие этих сигналов способствует адипогенезу. В самом деле, именно так обстоит дело с некоторыми изолированными стволовыми клетками in vitro , где в отсутствие экзогенно применяемого сигнала дифференцировки ( i.е. , химические или биофизические стимулы), по умолчанию образуются адипоциты, нагруженные липидами. (43)

Механические сигналы, управляющие костным фенотипом

Существующие модели привели к гипотезе о том, что опосредованные амплитудой параметры упражнения, такие как величина деформации (44) или плотность энергии деформации (45), имеют решающее значение для определения реакции кости и полученная морфология скелета (46). Существуют убедительные доказательства того, что резидентные костные клетки распознают и реагируют на механически генерируемые сигналы, которые стимулируют сеть остеобластов / остеоцитов (47) и ингибируют остеокластогенез (48), процесс, опосредованный деформацией тканей (49), усиленным потоком жидкости (50), интрамедуллярное давление (51) и / или потенциалы течения (52).Важно отметить, что каждый из этих физических параметров сильнее коррелирует с динамикой среды нагрузки (удар (53), скорость деформации (54) и градиенты деформации (55)), чем фактическая величина деформации, создаваемая нагрузкой.

Было продемонстрировано, что механически опосредованное ремоделирование кости демонстрирует сильную взаимозависимость величины деформации и количества циклов, так что костная масса может быть увеличена либо с помощью нескольких событий большой деформации (56), либо 100000 случаев деформации крайне низкой величины. сигналов (57), что приводит к парадигме, согласно которой структура кости в такой же степени зависит от постоянных, невысоких напряжений, возникающих во время преобладающих видов деятельности ( i.е. , стоя), как и при более редких событиях напряжения, возникающих во время напряженной деятельности (58). Хотя способность сильных деформаций приводить к образованию кости была признана в течение некоторого времени, более поздние исследования показали, что очень небольшие механические сигналы, индуцируемые с относительно высокой частотой (циклов в секунду), также могут способствовать образованию кости (59).

Взрослая самка овцы при условии кратковременного пребывания в течение 1 года (20 мин · d −1 ), низкой магнитуды (0,3 г, где 1 г — гравитационное поле Земли), высокой частоты (30 Гц, где 3 Гц — частота шага для элиты. бегун), механические сигналы реализованы 34.Увеличение плотности трабекул в проксимальном отделе бедра на 2% по сравнению с контролем (CON) (p <0,01) (59). Значительное увеличение было отмечено как в объеме трабекул (+ 32%; p <0,04), так и в количестве (+ 45%; p <0,01), параллельно с уменьшением расстояния между ними (-36%; p = 0,02) (60). Реконструкции µCT дистального мыщелка бедренной кости (61) показали на 10,6% большее содержание минералов в костях (BMC) у экспериментальных животных (p <0,05) из-за увеличения трабекул на 8,3% (p <0,01). Прочность до отказа была на 26,7% больше (p <0.05), что указывает на улучшение качества кости по сравнению с контролем. Эти результаты предполагают общую адаптацию, которая увеличивает жесткость кости и обеспечивает более равномерное распределение напряжения (62), обеспечивая доказательство того, что, как и наши результаты с кортикальной костью (63; 64), градиенты напряжения могут иметь решающее значение для адаптации кости к механическим сигналам. . Благодаря этому стремлению к образованию кости и привлечению остеобластов из пула предшественников стало понятно, что при наличии конечного числа мезенхимальных предшественников может происходить параллельное ингибирование образования жировой ткани.

Механические сигналы подавляют фенотип жира

Принимая во внимание важность физических упражнений в борьбе с остеопорозом и ожирением, а также анаболический ответ скелетной системы на механические сигналы малой величины (LMMS), мы предположили, что механические сигналы, анаболические для костей, будут в параллельно ограничить производство жира у растущего животного. Сорок 7-недельных мышей-самцов C57BL / 6J (B6) на нормальной диете были рандомизированы в группы LMMS или CON. В течение 15 недель мышей LMMS подвергали 15 мин -1 при 90 Гц, 0.4g p-p сигнал. В 12 недель (возраст 19 недель) in vivo CT показал, что объем торсального жира у мышей LMMS был на 27,4% ниже, чем у CON (p = 0,008;). Напротив, общий безжировой объем туловища (общий объем за вычетом жира и костей) был одинаковым для LMMS и CON (p = 0,7), в то время как безжировой объем по отношению к массе тела был на 5,0% больше при LMMS, чем CON (p = 0,01). .

Продольная (вверху) и поперечная (внизу) µКТ-реконструкция содержания абдоминального жира через туловище контрольной (слева) и LMMS (справа) мыши B6, выполненная in vivo через 12 недель с использованием параметров КТ-сигнала, специфически чувствительных к толстый.После 12 недель ежедневной 15-минутной LMMS жир в туловище был на 27% ниже, чем в контрольной группе. Воспроизведено из Proc Natl Acad Sci U S A . 2007 6 ноября; 104 (45): 17879-84.

Данные об объеме жира, полученные из in vivo CT, рассчитанный объем жира был подтвержден относительно веса рассеченных жировых подушечек, собранных после умерщвления через 15 недель (возраст 22 недели), в которых у мышей LMMS было на 26,2% меньше эпидидимальной функции (p = 0,01) и на 20,8% меньше подкожного жира (p = 0,02), чем у мышей CON. Еженедельный прием пищи LMMS (26.4g · w -1 ± 2,1) и CON (27,0 г · w -1 ± 2,1) были по существу идентичными. Отсутствие корреляции между потреблением пищи и общей массой тела (r 2 = 0,15; p = 0,7) или объемом жира (r 2 = 0,008; p = 0,6) указывает на то, что более низкое ожирение при LMMS не может быть объяснено различия в потреблении пищи.

Хотя наблюдалось небольшое снижение уровней глюкозы и инсулина натощак в группе LMMS (p = 0,07), этот результат не был значимым, что позволяет предположить, что применяемый LMMS не повлиял на функцию печени или бета-клеток.При умерщвлении триглицериды (TG, общее количество мг в ткани) в жировой ткани мышей LMMS были на 21,1% (p = 0,3) ниже, чем CON, и на 39,1% ниже в печени (p = 0,02). Общее количество неэтерифицированных свободных жирных кислот (NEFA, общее количество ммоль в ткани) в жировой ткани было на 37,2% ниже у мышей LMMS по сравнению с CON (p = 0,01), в то время как NEFA в печени мышей LMMS было на 42,6% ниже (p = 0,02). Многочисленные исследования показали, что дислипидемия может оказывать серьезное негативное влияние на метаболизм, рост и развитие — в частности, накопление внутриклеточных липидов и внутримышечных липидов тесно связаны с инсулинорезистентностью — и считается лучшим предиктором будущего развития инсулина. сопротивление (65).Способность подавлять расширение жировой ткани с помощью механических сигналов, а также ограничивать выработку NEFA и триглицеридов предполагает, что механический подход к ограничению ожирения также может улучшить дислипидемию.

LMMS подавляет ожирение, влияя на пути дифференцировки МСК

Исследования трансплантатов костного мозга, в которых GFP-меченный костный мозг вводили мышам-реципиентам дикого типа, были использованы для определения того, было ли достигнуто подавление ожирения у растущих животных с помощью LMMS путем перенаправления кости МСК костного мозга лишены адипоцитарной судьбы (66).Для этого использовали в качестве доноров костного мозга мышей с гетерозиготным зеленым флуоресцентным белком B6 (GFP + ) (67). После имплантации мышам дикого типа (16 самцов мышей B6 дикого типа, возраст 8 недель) судьбу стволовых клеток костного мозга можно отслеживать по продукции GFP. Через одну неделю после трансплантации половину мышей-реципиентов GFP + подвергали LMMS (как указано выше), а половину использовали в качестве ложно нагруженного CON. Унесенные через 6 недель, жировые подушечки придатка яичка и костный мозг большеберцовой кости были взяты для исследования.FACS-анализ проводили на эпидидимальной жировой подушке и костном мозге, выделенных от реципиентов GFP + , с использованием сигнала флуоресценции GFP. Чтобы помочь идентифицировать МСК в общей популяции клеток костного мозга, клетки метили антигеном стволовых клеток-1 (Sca-1), антигеном, обычно связанным с гемопоэтическими клетками, но недавно было показано, что он экспрессируется на клетках с адипогенными, хондрогенными и остеогенными свойствами. потенциал (68).

Было показано, что соотношение адипоцитов GFP + в жировой подушке придатка к МСК GFP + было на 19% ниже (p <0.02) у животных, подвергнутых LMMS, относительно контроля (CON: 101,2% ± 16,1%; LMMS 82,0% ± 11,1%). Данные, указывающие на снижение приверженности адипоцитам, были подтверждены весом эпидидимальной жировой подушечки после 6 недель LMMS, который был на 12,2% меньше, чем CON (p <0,03).

Краткость сигнала и то, что нагрузка, присущая LMMS, низкая по сравнению даже с нормальной нагрузкой на вес, предполагает, что ингибирование адипогенеза было достигнуто другими путями, а не повышением метаболической активности, опосредованным физической нагрузкой.Принимая во внимание данные, полученные от этих мышей-реципиентов GFP + , эти результаты показывают, что снижение ожирения в результате LMMS достигается за счет влияния на дифференцировку предшественников адипоцитов, МСК, удерживая их от адипоцитарного клона, и, если параллельно, за счет увеличения в безжировой массе (см. ниже), что привело их к скелетно-мышечной судьбе. Несмотря на подобную диету, LMMS сдерживала набор жира, «просто» избегая образования адипоцитов.

Если процессы образования жира и костей обратно связаны, это должно быть очевидно при одновременной оценке обеих систем; Улучшение качества опорно-двигательного аппарата также может непосредственно служить эффективной мерой для предотвращения ожирения (65; 69).Чтобы оценить эффективность сигнала LMMS в ответ на модель ожирения (вызванного диетой), молодых взрослых (7-недельных C57 / BL6) мышей-самцов кормили диетой с высоким содержанием жиров (45 ккал% жира) и рандомизировали в одну из групп CON или группы, обработанные LMMS. В 12 недель (возраст 19 недель) ни прирост массы тела, ни среднее еженедельное потребление пищи существенно не различались между группами LMMS или CON (CON весил 32,9 ± 4,2 г, в то время как мыши LMMS были на 6,8% легче при 30,7 ± 2,1 г. ; p = 0,15). TG и NEFA, измеренные в плазме, эпидидимальной жировой ткани и печени, были ниже при LMMS по сравнению с CON.Уровни ТГ в печени снизились на 25,6% (p = 0,19) у животных с LMMS, при этом одновременно произошло снижение уровней NEFA на 33,0% (p = 0,022). Отражая снижение жировой нагрузки, уровни адипокинов натощак были снижены при LMMS. По сравнению с CON, уровни циркулирующего лептина были снижены на 35,3% (p = 0,05), адипонектина на 21,8% (p = 0,009) и резистина на 15,8% (p = 0,26). На уровни циркулирующего сывороточного остеопонтина (-7,5%, p = 0,41) и остеокальцина (-14,6%, p = 0,22) механические сигналы существенно не влияли.Таким образом, поскольку сигнал предотвращает образование адипоцитов, общее метаболическое состояние животного кажется улучшенным в результате стимуляции LMMS.

На основе недавно разработанной методологии, позволяющей пространственно разделить жировую ткань на подкожные и висцеральные жировые отложения у мелких животных с помощью микрокомпьютерной томографии с низким разрешением () (70; 71), далее было замечено, что висцеральное ожирение было более чувствительным, чем подкожное ожирение до механического сигнала. (72) Полное абдоминальное ожирение было разделено на подкожную или висцеральную жировую ткань (SAT или VAT).Животные с LMMS имели на 28,5% (p = 0,021) меньше НДС по объему и на 19,0% (p = 0,016) меньше SAT по расчетному объему. Поскольку исследователи ожирения давно отметили, что метаболический риск, как правило, выше и корреляция с висцеральным ожирением выше, чем с подкожным ожирением (73; 74), специфическое сокращение висцерального жира у этих животных обнадеживает.

(а) . Реконструированное сканирование µCT мыши, в котором можно легко идентифицировать скелет для определения интересующей области. (б) . Большая часть жировой ткани у мышей локализована в брюшной области, поскольку в грудной полости и ногах наблюдается меньшее преобладание (жировой) ткани низкой плотности. (с) . Чтобы количественно определить объем жира в этих различных отделах тела, ткани разной плотности были разделены и классифицированы как жир (желтый), мышечная масса (красный) или кости (белый). г. . Репрезентативные изображения трех разных животных с низким, средним или высоким ожирением, с примененным порогом, специфичным для жира.Подкожный жир показан серым цветом, висцеральный жир — красным. Воспроизведено из Med Eng Phys . 2009 г., 31 (1): 34–41 с разрешения Elsevier Limited.

В этих исследованиях важно отметить, что реальная мощность этого механического сигнала, особенно в отношении смещения дифференцировки МСК, будет иметь место, когда существует наибольшая популяция клеток, «доступная» для воздействия. Таким образом, можно легко утверждать, что наиболее важным моментом для стратегий механической нагрузки является молодость субъекта, и поэтому наиболее актуальной целью должно быть предотвращение, а не лечение потери костной массы и предотвращение ожирения, а не лечение. ожирения.

Как свидетельствует подавленное влияние физических упражнений на большие изменения МПК у пожилых людей, мы подозреваем, что реальная сила метода воздействия на дифференцировку МСК проявляется в периоды, когда имеется готовый запас недифференцированных клеток в «нейтральных» окружающая среда, на которую нужно воздействовать. Пожилые люди со значительным количеством жира в костном мозге попадают в своего рода петлю положительной обратной связи, когда присутствующий жир выделяет в местную среду факторы, которые препятствуют развитию костей, одновременно способствуя выработке дополнительного жира.Тем не менее, также возможно, что «все» вмешательства, основанные на физическом или химическом воздействии, имеют большее влияние на молодых, чем на старых, именно по этой причине: в первые годы существует больше клеток, на которые можно воздействовать, чем в последние годы. Конечно, если механическое (или другое) вмешательство в конечном итоге замедлит прогрессирование костного мозга в сторону жира, возможно, фармакологические вмешательства также будут более успешными, поскольку потенциальные популяции клеток, доступные для ответа, будут намного больше.

Механические сигналы на клеточном уровне

Хотя известно, что деформации матрикса на два порядка ниже пиковых функциональных деформаций в кости являются анаболическими (75; 76), средства, с помощью которых такие LMMS вызывают образование кости, неясны.Матричные деформации менее 0,001% возмущают клетки менее чем на один ангстрем, деформация, per se , но та, которая вряд ли распознается клетками (77; 78). Скорее, побочные продукты деформации матрикса ( т.е. ., Напряжения сдвига, вызванные потоком жидкости, потенциалы потока, сопротивление жидкости перицеллюлярным процессам) или, возможно, усиленный транспорт питательных веществ, могут способствовать реакции клетки на механические сигналы (32; 79).

Вместо зависимого от деформации матрикса пути механотрансдукции частотная чувствительность адаптивной системы кости указывает на более фундаментальный путь, посредством которого физические сигналы взаимодействуют с клетками в ткани.Физическое ускорение клетки может представлять собой общий сигнал, который может передавать физические проблемы, изменяя внутриклеточные цитоскелетные отношения (80–82). Таким образом, возможно, что механизм, с помощью которого МСК воспринимают механические сигналы, основан на ускорении и замедлении клетки, а не на искажении субстрата. Следовательно, клетки могут реагировать на LMMS, несмотря на фактическое отсутствие деформации матрикса (83–85) через ускорения / замедления клетки, вызывающие противофазное движение по отношению к привязанному ядру, достаточное для активации биологической реакции (85).

Кроме того, другие физические сигналы, такие как импульсные электромагнитные поля или импульсный ультразвук низкой интенсивности (LIPUS), могут оказывать аналогичные эффекты на костную и жировую ткань, основанную на аналогичных путях механотрансдукции. Существует множество доклинических и клинических доказательств того, что ультразвук в целом и сигнал, используемый в устройстве звукового ускоренного сигнала заживления перелома (SAFHS), в частности, ускоряют заживление перелома, катализируя ряд гипотез относительно каскада событий и эффекторные клетки.Потенциально популяция МСК, которая рекрутируется в место перелома, может быть дополнительно стимулирована к пролиферации и дифференцировке с помощью LIPUS.

Преобразование механического сигнала в биологический ответ

Доказательства того, что химические и физические сигналы влияют на дифференцировку МСК в направлении остеобластов по адипоцитарному клону, растут. Например, проникновение МСК в клон адипоцитов продвигается за счет экспрессии и действия PPARγ, который, когда он отсутствует или присутствует в единственной копии, обеспечивает усиленный остеогенез (86).Стимуляция PPARγ МСК в направлении отбора адипогенного клона достигается, по крайней мере частично, за счет ингибирования канонической передачи сигналов Wnt (87), пути, критически важного для входа МСК в остеогенный клон и расширения пула остеопрогениторов (88). Также был продемонстрирован реципрокный эффект передачи сигналов β-катенина на выбор клонов остеобластов / адипоцитов с помощью МСК, где фенотип с высокой костной массой, обусловленный конститутивно активированным сигналом Lrp5 / Wnt, сопровождается снижением содержания жира в костном мозге (89).Если рассматривать в контексте чувствительности кости к механическим сигналам, известно, что такие факторы, как деформация и сдвиг, усиливают функцию костных клеток, ускоряя дифференцировку по остеогенному пути (90), способствуя активности остеобластов (91), а также подавляя резорбцию кости ( 49). Действительно, активация и ядерная транслокация β-катенина (92; 93) происходит в течение нескольких минут после введения механических сигналов. Активация β-катенина зависит от способности штамма инактивировать GSK3β, что позволяет увеличить пул β-катенина, который может быть активирован (94), что приводит к усилению дифференцировки остеобластов и большей приверженности костно-мышечной системе.

Критическая роль β-catenin в раннем выборе линии остеопрогенитора и способность механических сигналов активировать клеточный β-catenin, вызывает вопрос о том, могут ли механические сигналы влиять на дифференцировку остеобластов на очень ранних стадиях. Первичные стволовые клетки костного мозга, подвергнутые ежедневной механической нагрузке, экспрессируют маркеры костей в два раза чаще, чем клетки, лишенные деформации (42). Постепенное снижение как активного, так и общего β-катенина сопровождало адипогенную трансформацию МСК, но механические сигналы полностью предотвращали такое снижение β-катенина и тем самым ограничивали экспрессию как PPARγ, так и адипонектина (95).В соответствии с эффектами деформации на дифференцированные костные клетки (94), механическое сохранение клеточных уровней β-катенина зависит, по крайней мере частично, от способности штамма инактивировать GSK3β. Было высказано предположение, что в состоянии «неиспользования» — или в отсутствии напряжения — активный GSK3β допускает адипогенез, нацеливая β-катенин на деградацию, и что механические факторы, через различные проксимальные эффекторы, в первую очередь нацелены на β-катенин, чтобы регулировать выбор клонов МСК. склонны к остеобластогенезу, а не к адипогенезу.

Помимо воздействия механических сигналов на клеточную дифференцировку, мы показали, что сигнал LMMS также увеличивает количество предшественников стволовых клеток in vivo . Проточно-цитометрические измерения общего костного мозга в наших исследованиях на животных (как для животных с нормальной пищей, так и с животными с высоким содержанием жиров) дали неожиданный результат: 6 недель лечения LMMS значительно увеличили общую популяцию стволовых клеток (включая HSC и MSC) по сравнению с контролем. LMMS-стимулированные животные демонстрировали 37.2% (p = 0,024) увеличение количества стволовых клеток по сравнению с фиктивными животными с CON на основании экспрессии Sca-1. МСК, представленные клетками, положительными как по Sca-1, так и по фактору предипоцитов-1 (Pref-1), составляли гораздо меньший процент от общего числа клеток. Выявленные таким образом животные, получавшие LMMS, имели увеличение специфических МСК на 46,1% (p = 0,022) по сравнению с CON (). Хотя механизм все еще изучается, эта механическая модуляция популяций стволовых клеток и потенциально их пролиферативной способности представляет собой уникальную терапевтическую мишень для регенеративной терапии тканей.

Точечные графики репрезентативной плотности из экспериментов проточной цитометрии показывают способность LMMS увеличивать количество стволовых клеток в целом (одиночный положительный Sca-1, верхний квадрант) и МСК в частности (положительный результат Sca-1 и Pref-1, верхний квадрант). правый квадрант). Красный, высокая плотность клеток; синий, низкая плотность клеток. По сравнению с контрольными животными (A) LMMS увеличивает количество стволовых клеток в костном мозге животных LMMS (B). Фактическое увеличение общего количества стволовых клеток костного мозга (С) и количества МСК (D) рассчитывали как процент положительных клеток / общее количество клеток для фракции клеток, показывающей наиболее интенсивное окрашивание.Воспроизведено из J Bone Miner Res 2009; 24; 50–61 с разрешения Американского общества исследований костей и минералов.

Резюме

Очевидно, что взаимодействие между костью и жиром является сложным и сильно зависит от множества факторов, включая генетические, биохимические и механические факторы, которые координируют общее взаимодействие и результирующий фенотип. Фенотипический ответ, измеряемый количеством жировой и костной ткани, а также биохимические изменения, измеряемые в различных органах, включая печень, несомненно, являются результатом более сложных взаимодействий, чем те, которые исследуются в настоящее время.В частности, необходимо дополнительно оценить роль сигналов, исходящих из других клеточных источников со специфичностью в отношении МСК, адипоцитов и / или остеобластов, как в качестве факторов, способствующих ответу LMMS, так и в качестве результатов стимуляции. Однако ясно то, что растущая распространенность остеопороза и ожирения и связанные с ними расходы представляют собой серьезную проблему для здоровья. Кроме того, для людей с ожирением избыточное ожирение фактически подвергает их риску развития множества дополнительных заболеваний, таких как диабет, сердечно-сосудистые заболевания и рак.Фармакологические методы лечения обоих видов имеют ограниченный успех и сопряжены с рядом рисков. Вместо того, чтобы просто исследовать методы лечения скомпрометированного состояния после развития болезни, общепризнано, что особое внимание следует уделять первичной профилактике. Таким образом, фундаментальное понимание некоторых взаимодействующих факторов, которые управляют дифференцированным развитием стволовых клеток в костей или жировой ткани, дает надежду на открытие новых стратегий профилактики и лечения (2).Способность механических сигналов влиять на дифференцировку МСК и разрушать формирование адипоцитов МСК в сторону формирования более здоровых тканей (, то есть , кости или мышцы), обещает ограничить общий прирост жировой ткани за счет развития, а не метаболических путей.

Способность LMMS увеличивать костную ткань при уменьшении жира связана с обычными стволовыми клетками-предшественниками, из которых дифференцируются остеобласты и адипоциты. Хотя ранее наблюдалась обратная взаимосвязь между костной и жировой тканями, теперь мы показываем, что LMMS увеличивает дифференциацию костей за счет уменьшения дифференциации жира, создавая обратную связь между ожирением и остеопорозом в процессе развития.Показано на реконструированных изображениях µCT, полученное LMMS животное (справа) показано в сравнении с имитацией CON (слева) соответствующего возраста. Светло-серый цвет представляет собой кость, прозрачный серый — подкожный жир, красный — висцеральный жир. Увеличение количества жира у животного имеет тенденцию накапливаться во внутреннем (а не подкожном) отделе и увеличивает окружность животного без значительного влияния на длину скелета.

Сноски

Конфликт интересов: Dr.Луу, доктор Пессин, доктор Джудекс и доктор Клинтон Рубин сообщают, что они подали предварительные патенты в USPTO на способность механических сигналов контролировать судьбу стволовых клеток и модулировать метаболические нарушения; Доктор Клинтон Рубин также является основателем Juvent Medical, Inc. Доктор Джанет Рубин: сообщений не поступало.

Ссылки

1. Carmona RH. Генеральный хирург сообщает о здоровье костей. J Calif Dent Assoc. 2005 Янв; 33 (1): 9–11. [PubMed] [Google Scholar] 3. Кара Дж.Ф., Чайкен Р.Л. Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром у детей и подростков.Curr Diab Rep., Июнь 2006; 6 (3): 241–250. [PubMed] [Google Scholar] 4. Freedman DS, Mei Z, Srinivasan SR, Berenson GS, Dietz WH. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний и избыточное ожирение среди детей и подростков с избыточным весом: исследование сердца Богалуса. J Pediatr. 2007, январь; 150 (1): 12–17. [PubMed] [Google Scholar] 5. Пинхас-Хамиэль О., Долан Л.М., Дэниэлс С.Р., Стэндифорд Д., Хури П.Р., Зейтлер П. Повышенная заболеваемость инсулинозависимым сахарным диабетом среди подростков. J Pediatr. 1996 Май; 128 (5 Pt 1): 608–615.[PubMed] [Google Scholar] 6. Розенблум А.Л., Джо-младший, Янг Р.С., Уинтер МЫ. Возникающая эпидемия диабета 2 типа среди молодежи. Уход за диабетом. 1999 Февраль; 22 (2): 345–354. [PubMed] [Google Scholar] 7. Скотт CR, Смит JM, Cradock MM, Pihoker C. Характеристики инсулиннезависимого сахарного диабета в молодости и инсулинозависимого сахарного диабета при постановке диагноза. Педиатрия. 1997 июл; 100 (1): 84–91. [PubMed] [Google Scholar] 8. Nijpels G. Детерминанты перехода от нарушенной толерантности к глюкозе к инсулиннезависимому сахарному диабету.Eur J Clin Invest. 1998 сен; 28 Дополнение 2: 8–13. [PubMed] [Google Scholar] 9. Харлан WR. Эпидемиология детского ожирения. Национальная перспектива. Ann N Y Acad Sci. 1993 29 октября; 699: 1–5. [PubMed] [Google Scholar] 10. Hughes TA, Gwynne JT, Switzer BR, Herbst C, White G. Влияние ограничения калорийности и потери веса на гликемический контроль, высвобождение инсулина и резистентность, а также риск атеросклероза у пациентов с ожирением и сахарным диабетом II типа. Am J Med. Июль 1984, 77 (1): 7–17. [PubMed] [Google Scholar] 11. Генри Р. Р., Уоллес П., Олефски Дж. М..Влияние потери веса на механизмы гипергликемии при инсулиннезависимом сахарном диабете с ожирением. Диабет. 1986 сентябрь; 35 (9): 990–998. [PubMed] [Google Scholar] 12. Tuomilehto J, Lindström J, Eriksson JG, Valle TT, Hämäläinen H, Ilanne-Parikka P, Keinänen-Kiukaanniemi S, Laakso M, Louheranta A, Rastas M, Salminen V, Uusitupa Mnish Diabetes Study Group. Профилактика сахарного диабета 2 типа путем изменения образа жизни среди лиц с нарушенной толерантностью к глюкозе. N Engl J Med. 2001 3 мая; 344 (18): 1343–1350.[PubMed] [Google Scholar] 13. Исследовательская группа Программы профилактики диабета (DPP). Программа профилактики диабета (DPP): описание изменения образа жизни. Уход за диабетом. 2002 декабрь; 25 (12): 2165–2171. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Люпкер Р.В., Перри С.Л., МакКинлей С.М., Надер П.Р., Парсель Г.С., Стоун Э.Дж., Уэббер Л.С., Элдер Дж. П., Фельдман Н.А., Джонсон С.К. и др. Коллективная группа CATCH. Результаты полевых испытаний по улучшению моделей питания и физической активности детей. Исследование здоровья сердечно-сосудистой системы у детей и подростков.ДЖАМА. 1996 13 марта; 275 (10): 768–776. [PubMed] [Google Scholar] 15. Уильямсон Д.А., Коупленд А.Л., Антон С.Д., Шампанское К., Хан Х., Льюис Л., Мартин С., Ньютон Р.Л., младший, Сотерн М., Стюарт Т., Райан Д. Проект Wise Mind: школьный экологический подход для предотвращения увеличения веса в дети. Ожирение (Серебряная весна) 2007 апр; 15 (4): 906–917. [PubMed] [Google Scholar] 16. Гутин Б. Детское ожирение можно уменьшить с помощью больших физических нагрузок, а не ограничения потребления энергии. Ожирение (Серебряная весна), октябрь 2008 г .; 16 (10): 2193–2196.[PubMed] [Google Scholar] 17. Лакка Т.А., Бушар С. Физическая активность, ожирение и сердечно-сосудистые заболевания. Handb Exp Pharmacol. 2005; (170): 137–163. [PubMed] [Google Scholar] 18. Porada CD, Zanjani ED, Almeida-Porad G. Взрослые мезенхимальные стволовые клетки: плюрипотентная популяция с множеством применений. Curr Stem Cell Res Ther. 2006 сентябрь; 1 (3): 365–369. [PubMed] [Google Scholar] 19. Лю М., Хань З.С. Мезенхимальные стволовые клетки: биология и клинический потенциал в терапии диабета 1 типа. J Cell Mol Med. 2008 Авг; 12 (4): 1155–1168.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Giordano A, Galderisi U, Marino IR. От лабораторного стола до постели пациента: обновленная информация о клинических испытаниях мезенхимальных стволовых клеток. J. Cell Physiol. 2007 Апрель; 211 (1): 27–35. [PubMed] [Google Scholar] 21. Моррисон SJ, Spradling AC. Стволовые клетки и ниши: механизмы, которые способствуют сохранению стволовых клеток на протяжении всей жизни. Клетка. 22 февраля 2008 г.; 132 (4): 598–611. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 22. Кассем М. Стволовые клетки: потенциальная терапия возрастных заболеваний.Ann N Y Acad Sci. 2006 Май; 1067: 436–442. [PubMed] [Google Scholar] 23. Кратчмарова И., Благоев Б., Хаак-Соренсен М., Кассем М., Манн М. Механизм дивергентных эффектов факторов роста в дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток. Наука. 3 июня 2005 г .; 308 (5727): 1472–1477. [PubMed] [Google Scholar] 24. Орр А.В., Хельмке Б.П., Блэкман Б.Р., Шварц М.А. Механизмы механотрансдукции. Dev Cell. 2006 Янв; 10 (1): 11–20. [PubMed] [Google Scholar] 25. Ko KS, McCulloch CA. Межклеточная механотрансдукция: клеточные цепи, координирующие реакцию тканей на механическую нагрузку.Biochem Biophys Res Commun. 2001, 3 августа; 285 (5): 1077–1083. [PubMed] [Google Scholar] 26. Ingber DE. Клеточная механотрансдукция: снова собираем все вместе. FASEB J. Май 2006 г .; 20 (7): 811–827. [PubMed] [Google Scholar] 27. Аврам М.М., Аврам А.С., Джеймс В.Д. Подкожно-жировая клетчатка в нормальном и патологическом состоянии 3. Адипогенез: от стволовых клеток к жировым клеткам. J Am Acad Dermatol. Март 2007 г.; 56 (3): 472–492. [PubMed] [Google Scholar] 28. Кубо Ю., Кайдзу С., Накадзима И., Такенучи К., Накамура Ф. Организация компонентов внеклеточного матрикса во время дифференциации адипоцитов в долгосрочной культуре.In vitro Cell Dev Biol Anim. 2000 Янв; 36 (1): 38–44. [PubMed] [Google Scholar] 30. Сяо З., Чжан С., Малиос Дж., Чжоу Дж., Магенхеймер Б.С., Го Д., Даллас С.Л., Мазер Р., Кальвет Дж. П., Боневальд Л., Куорлз Л. Д.. Ресничноподобные структуры и полицистин-1 в остеобластах / остеоцитах и ​​связанные с ними нарушения в скелетогенезе и экспрессии Runx2. J Biol Chem. 2006 г. 13 октября; 281 (41): 30884–30895. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 31. Ю Л., Темиясатит С., Ли П., Ким СН, Туммала П., Яо В., Кингери В., Мэлоун А. М., Квон Р. Ю., Джейкобс С. Р..Остеоциты как механосенсоры в подавлении резорбции костной ткани из-за механической нагрузки. Кость. 2008 Янв; 42 (1): 172–179. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32. Qin YX, Kaplan T, Saldanha A, Rubin C. Градиенты давления жидкости, возникающие из-за колебаний внутримедуллярного давления, коррелируют с образованием кости и подавлением внутрикортикальной пористости. J Biomech. 2003 Октябрь; 36 (10): 1427–1437. [PubMed] [Google Scholar] 33. Song G, Ju Y, Shen X, Luo Q, Shi Y, Qin J. Механическое растяжение способствует пролиферации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крыс.Коллоиды Surf B Биоинтерфейсы. 2007, 1 августа; 58 (2): 271–277. [PubMed] [Google Scholar] 34. Terraciano V, Hwang N, Moroni L, Park HB, Zhang Z, Mizrahi J, Seliktar D, Elisseeff J. Дифференциальный ответ взрослых и эмбриональных мезенхимальных клеток-предшественников на механическое сжатие в гидрогелях. Стволовые клетки. 2007 ноябрь; 25 (11): 2730–2738. [PubMed] [Google Scholar] 35. Хейлок Д. Н., Нильссон СК. Остеопонтин: мост между костью и кровью. Br J Haematol. 2006 сентябрь; 134 (5): 467–474. [PubMed] [Google Scholar] 37. Кальви Л.М., Адамс Г.Б., Вайбрехт К.В., Вебер Дж. М., Олсон Д.П., Найт М.С., Мартин Р.П., Шипани Э., Дивиети П., Брингхерст Ф.Р., Милнер Л.А., Кроненберг Х.М., Скадден Д.Т.Остеобластические клетки регулируют нишу гемопоэтических стволовых клеток. Природа. 23 октября 2003 г .; 425 (6960): 841–846. [PubMed] [Google Scholar] 38. Тайчман Р.С., Рейли М.Дж., Эмерсон С.Г. Остеобласты человека поддерживают кроветворные клетки-предшественники человека в культурах костного мозга in vitro. Кровь. 1996, 15 января; 87 (2): 518–524. [PubMed] [Google Scholar] 39. Хуанг Р.П., Рубин СТ, МакЛеод К.Дж. Изменения в динамике постуральных мышц в зависимости от возраста. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 1999, август; 54 (8): B352 – B357. [PubMed] [Google Scholar] 40. Мао JJ, Нет HD.Рост и развитие: наследственные и механические модуляции. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2004 июнь; 125 (6): 676–689. [PubMed] [Google Scholar] 41. Юнг Д.К., Гриффит Дж. Ф., Антонио Г. Э., Ли Ф. К., Ву Дж., Люн ПК. Остеопороз связан с повышенным содержанием жира в костном мозге и снижением ненасыщенности жира в костном мозге: исследование протонной МР-спектроскопии. J. Магнитно-резонансная томография. 2005 августа; 22 (2): 279–285. [PubMed] [Google Scholar] 42. Дэвид В., Мартин А., Лафаж-Пруст М. Х., Малавал Л., Пейроше С., Джонс Д. Б., Вико Л., Гиньяндон А.Механическая нагрузка подавляет гамма-рецептор, активируемый пролифераторами пероксисом, в стромальных клетках костного мозга и способствует остеобластогенезу за счет адипогенеза. Эндокринология. 2007 Май; 148 (5): 2553–2562. [PubMed] [Google Scholar] 43. Беннетт CN, Ходж CL, Макдугальд О.А., Шварц Дж. Роль Wnt10b и C / EBPalpha в спонтанном адипогенезе 243 клеток. Biochem Biophys Res Commun. 2003 28 февраля; 302 (1): 12–16. [PubMed] [Google Scholar] 44. Рубин CT, Lanyon LE. Регулирование костной массы по величине механической деформации.Calcif Tissue Int. Июль 1985 г .; 37 (4): 411–417. [PubMed] [Google Scholar] 45. Файри Д.П., Картер ДР. Объединяющий принцип, связывающий стресс с морфологией губчатой ​​кости. J Orthop Res. 1986. 4 (3): 304–317. [PubMed] [Google Scholar] 46. ван дер Меулен М.С., Хёйскес Р. Почему механобиология? Обзорная статья. J Biomech. 2002 Апрель; 35 (4): 401–414. [PubMed] [Google Scholar] 47. Burger EH, Klein-Nulen J. Ответы костных клеток на биомеханические силы in vitro. Adv Dent Res. 1999 июн; 13: 93–98. [PubMed] [Google Scholar] 48.Рубин Дж., Фан Х, Бискобинг Д.М., Тейлор В.Р., Рубин СТ. Остеокластогенез подавляется механической деформацией в модели in vitro. J Orthop Res. 1999 Сен; 17 (5): 639–645. [PubMed] [Google Scholar] 49. Рубин Дж., Мерфи Т.С., Ранерт Дж., Сонг Х., Нанес М.С., Гринфилд Е.М., Джо Х., Фан Х. Механическое ингибирование экспрессии RANKL регулируется H-Ras-GTPase. J Biol Chem. 20 января 2006 г.; 281 (3): 1412–1418. [PubMed] [Google Scholar] 50. Knothe Tate ML, Knothe U. Модель ex vivo для изучения транспортных процессов и потока жидкости в нагруженной кости.J Biomech. 2000 Февраль; 33 (2): 247–254. [PubMed] [Google Scholar] 51. Qin YX, Lin W, Rubin C. Путь потока костной жидкости, определяемый измерениями внутримедуллярного давления и потенциала течения in vivo. Энн Биомед Eng. 2002 Май; 30 (5): 693–702. [PubMed] [Google Scholar] 52. Мак А.Ф., Чжан Дж.Д. Численное моделирование потенциалов течения из-за иерархических потоков, вызванных деформацией, в кортикальном слое кости. J Biomech Eng. 2001 февраль; 123 (1): 66–70. [PubMed] [Google Scholar] 53. Хейнонен А., Каннус П., Сиеванен Х., Оя П., Пасанен М., Ринне М., Ууси-Раси К., Вуори И.Рандомизированное контролируемое исследование влияния упражнений с высокой нагрузкой на отдельные факторы риска остеопоротических переломов. Ланцет. 1996, 16 ноября; 348 (9038): 1343–1347. [PubMed] [Google Scholar] 54. О’Коннор Дж. А., Ланьон Л. Е., МакФи Х. Влияние скорости деформации на адаптивное ремоделирование кости. J Biomech. 1982; 15 (10): 767–781. [PubMed] [Google Scholar] 55. Гросс Т.С., Эдвардс Дж.Л., МакЛеод К.Дж., Рубин Коннектикут. Градиенты деформации коррелируют с участками образования надкостницы. J Bone Miner Res. 1997 июн; 12 (6): 982–988. [PubMed] [Google Scholar] 56.Рубин CT, Lanyon LE. Документ о премии «Дельта Каппы». Остеорегуляторная природа механических стимулов: функция как детерминант адаптивного ремоделирования в кости. J Orthop Res. 1987. 5 (2): 300–310. [PubMed] [Google Scholar] 57. Цинь YX, Rubin CT, McLeod KJ. Нелинейная зависимость интенсивности нагрузки и количества циклов в сохранении костной массы и морфологии. J Orthop Res. Июль 1998 г .; 16 (4): 482–489. [PubMed] [Google Scholar] 58. Adams DJ, Spirt AA, Brown TD, Fritton SP, Rubin CT, Brand RA. Проверка теории адаптации костей к ежедневному стрессовому стимулу с использованием естественных и экспериментально контролируемых историй деформации.J Biomech. 1997 Июль; 30 (7): 671–678. [PubMed] [Google Scholar] 59. Рубин С., Тернер А.С., Бейн С., Маллинкродт С., МакЛеод К. Анаболизм. Низкие механические сигналы укрепляют длинные кости. Природа. 2001, 9 августа; 412 (6847): 603–604. [PubMed] [Google Scholar] 60. Rubin C, Turner A, Mallinckrodt C, Jerome C, McLeod K, Bain S. Механическое напряжение, индуцированное неинвазивно в высокочастотной области, является анаболическим для губчатой ​​кости, но не для кортикальной кости. Кость. 2002 Март; 30 (3): 445–452. [PubMed] [Google Scholar] 61. Рубин С., Тернер А., Мюллер Р., Миттра Е., МакЛеод К., Лин В., Цинь YX.Количество и качество губчатой ​​кости бедренной кости улучшаются за счет сильного анаболического неинвазивного механического вмешательства. J Bone Miner Res. 2002 Февраль; 17 (2): 349–357. [PubMed] [Google Scholar] 62. Judex S, Boyd S, Qin YX, Turner S, Ye K, Müller R, Rubin C. Адаптация губчатой ​​кости к вибрациям малой величины приводит к более равномерному напряжению и деформации под нагрузкой. Энн Биомед Eng. 2003 Янв; 31 (1): 12–20. [PubMed] [Google Scholar] 63. Гросс Т.С., Эдвардс Дж.Л., МакЛеод К.Дж., Рубин Коннектикут. Градиенты деформации коррелируют с участками образования надкостницы.J Bone Miner Res. 1997 июн; 12 (6): 982–988. [PubMed] [Google Scholar] 64. Judex S, Gross TS, Zernicke RF. Градиенты деформации коррелируют с участками костеобразующих поверхностей в скелете взрослого человека. J Bone Miner Res. 1997 Октябрь; 12 (10): 1737–1745. [PubMed] [Google Scholar] 65. Унгер Р. Мини-обзор: Оружие разрушения мышечной массы: роль эктопических липидов в метаболическом синдроме. Эндокринология. 2003 декабрь; 144 (12): 5159–5165. [PubMed] [Google Scholar] 66. Rubin CT, Capilla E, Luu YK, Busa B, Crawford H, Nolan DJ, Mittal V, Rosen CJ, Pessin JE, Judex S.Адипогенез подавляется кратковременным ежедневным воздействием высокочастотных механических сигналов крайне малой величины. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007, 6 ноября; 104 (45): 17879–17884. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 67. Nolan DJ, Ciarrocchi A, Mellick AS, Jaggi JS, Bambino K, Gupta S, Heikamp E, McDevitt MR, Scheinberg DA, Benezra R, Mittal V. Клетки-предшественники эндотелия, полученные из костного мозга, являются основным фактором, определяющим неоваскуляризацию зарождающейся опухоли. Genes Dev. 2007, 15 июня; 21 (12): 1546–1558. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 68.Hachisuka H, ​​Mochizuki Y, Yasunaga Y, Natsu K, Sharman P, Shinomiya R, Ochi M. Проточная цитометрическая дискриминация мезенхимальных клеток-предшественников из популяций прикрепленных к костному мозгу клеток с использованием CD34 / 44/45 (-) и Sca-1 (+ ) маркеры. J Orthop Sci. 2007 Март; 12 (2): 161–169. [PubMed] [Google Scholar] 70. Люблинский С., Луу Ю.К., Рубин С.Т., Джудекс С. Автоматическое разделение висцерального и подкожного ожирения на микрокомпьютерных томографиях мышей in vivo. J Digit Imaging. 3 сентября 2008 г .; [Epub перед печатью] [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 71.Луу Ю.К., Люблинский С., Озчивичи Е., Капилла Е., Пессин Дж. Э., Рубин С. Т., Джудекс С. Количественная оценка подкожного и висцерального ожирения in vivo с помощью микрокомпьютерной томографии на модели небольших животных. Med Eng Phys. 2009 Янв; 31 (1): 34–41. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 72. Луу Ю.К., Капилла Е., Розен С.Дж., Гильсанц В., Пессин Ю.Е., Джудекс С., Рубин СТ. Механическая стимуляция пролиферации и дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток способствует остеогенезу, предотвращая ожирение, вызванное диетой. J Bone Miner Res.2009 Янв; 24 (1): 50–61. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 73. Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante AW., Jr Ожирение связано с накоплением макрофагов в жировой ткани. J Clin Invest. 2003 декабрь; 112 (12): 1796–1808. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 74. Fox CS, Massaro JM, Hoffmann U, Pou KM, Maurovich-Horvat P, Liu CY, Vasan RS, Murabito JM, Meigs JB, Cupples LA, D’Agostino RB, Sr, O’Donnell CJ. Компартменты висцеральной и подкожной жировой ткани брюшной полости: связь с метаболическими факторами риска в исследовании Framingham Heart Study.Тираж. 3 июля 2007 г.; 116 (1): 39–48. [PubMed] [Google Scholar] 75. Rubin C, Recker R, Cullen D, Ryaby J, McCabe J, McLeod K. Предотвращение потери костной массы в постменопаузе с помощью низкоуровневых высокочастотных механических стимулов: клиническое испытание, оценивающее соблюдение, эффективность и безопасность. J Bone Miner Res. 2004 Март; 19 (3): 343–351. [PubMed] [Google Scholar] 76. Xie L, Jacobson JM, Choi ES, Busa B, Donahue LR, Miller LM, Rubin CT, Judex S. Механические колебания низкого уровня могут влиять на резорбцию кости и формирование кости в растущем скелете.Кость. 2006 ноябрь; 39 (5): 1059–1066. [PubMed] [Google Scholar] 77. Han Y, Cowin SC, Schaffler MB, Weinbaum S. Механотрансдукция и усиление деформации в клеточных процессах остеоцитов. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004, 23 ноября; 101 (47): 16689–16694. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 78. Ю Дж, Йеллоули К.Э., Донахью Х.Д., Чжан Й., Чен К., Джейкобс К.Р. Уровни деформации субстрата, связанные с повседневной физической активностью, в меньшей степени стимулируют костные клетки по сравнению с индуцированным нагрузкой колебательным потоком жидкости.J Biomech Eng. 2000 августа; 122 (4): 387–393. [PubMed] [Google Scholar] 79. Мэлоун А.М., Батра Н.Н., Шиварам Г., Квон Р.Й., Ю Л., Ким СН, Родригес Дж., Джейр К., Джейкобс К.Р. Роль актинового цитоскелета в индуцированной колебательным потоком жидкости передаче сигналов в остеобластах MC3T3-E1. Am J Physiol Cell Physiol. 2007 Май; 292 (5): C1830 – C1836. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 80. Гарман Р., Годетт Дж., Донахью Л. Р., Рубин С., Джудекс С. Ускорения низкого уровня, применяемые при отсутствии нагрузки, могут улучшить формирование трабекулярной кости.J Orthop Res. 2007 июн; 25 (6): 732–740. [PubMed] [Google Scholar] 81. Гарман Р., Рубин С., Джудекс С. Небольшие колебательные ускорения, не зависящие от деформаций матрикса, увеличивают активность остеобластов и улучшают морфологию костей. PLoS ONE. 2007 25 июля; 2 (7): e653. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 82. Озчивичи Э., Гарман Р., Джудекс С. Высокочастотные колебательные движения улучшают смоделированные механические свойства ненагруженной губчатой ​​кости. J Biomech. 2007. 40 (15): 3404–3411. [PubMed] [Google Scholar] 83.Танака С.М., Ли Дж., Дункан Р.Л., Йокота Х., Берр Д.Б., Тернер Ч. Влияние широкополосной вибрации на культивируемые остеобласты. J Biomech. 2003, январь; 36 (1): 73–80. [PubMed] [Google Scholar] 84. Tjandrawinata RR, Vincent VL, Hughes-Fulford M. Колебательная сила изменяет экспрессию мРНК в остеобластах. FASEB J. 1997 May; 11 (6): 493–497. [PubMed] [Google Scholar] 85. Bacabac RG, Smit TH, Van Loon JJ, Doulabi BZ, Helder M, Klein-Nulend J. Реакции костных клеток на высокочастотный вибрационный стресс: колеблется ли ядро ​​в цитоплазме? FASEB J.2006 Май; 20 (7): 858–864. [PubMed] [Google Scholar] 86. Akune T, Ohba S, Kamekura S, Yamaguchi M, Chung UI, Kubota N, Terauchi Y, Harada Y, Azuma Y, Nakamura K, Kadowaki T., Kawaguchi H. Недостаточность PPAR-гаммы усиливает остеогенез за счет образования остеобластов из предшественников костного мозга. J Clin Invest. Март 2004 г., 113 (6): 846–855. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 87. Лю Дж, Ван Х, Цзо Й, фермер SR. Функциональное взаимодействие между гамма-рецептором, активируемым пролифератором пероксисом, и бета-катенином.Mol Cell Biol. 2006 август; 26 (15): 5827–5837. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 89. Qiu W., Andersen TE, Bollerslev J, Mandrup S, Abdallah BM, Kassem M. Пациенты с фенотипом с высокой костной массой демонстрируют усиленную дифференцировку остеобластов и ингибирование адипогенеза мезенхимальных стволовых клеток человека. J Bone Miner Res. 2007 ноя; 22 (11): 1720–1731. [PubMed] [Google Scholar] 90. Fan X, Rahnert JA, Murphy TC, Nanes MS, Greenfield EM, Rubin J. Ответ на механическое напряжение в иммортализованной преостеобластной клетке зависит от ERK1 / 2.J. Cell Physiol. 2006 Май; 207 (2): 454–460. [PubMed] [Google Scholar] 91. Ю Дж, Рейли Г.К., Чжэнь Х, Йеллоули К.Э., Чен К., Донахью Х.Д., Джейкобс С.Р. Регулирование гена остеопонтина колебательным потоком жидкости посредством мобилизации внутриклеточного кальция и активации митоген-активируемой протеинкиназы в остеобластах MC3T3-E1. J Biol Chem. 2001 20 апреля; 276 (16): 13365–13371. [PubMed] [Google Scholar] 92. Армстронг VJ, Muzylak M, Sunters A, Zaman G, Saxon LK, Price JS, Lanyon LE. Передача сигналов Wnt / бета-катенина является компонентом ранних реакций остеобластических костных клеток на нагрузку и требует рецептора эстрогена альфа.J Biol Chem. 13 июля 2007 г.; 282 (28): 20715–20727. [PubMed] [Google Scholar] 93. Робинсон Дж.А., Чаттерджи-Кишор М., Яворски П.Дж., Каллен Д.М., Чжао В., Ли С., Хароде Ю., Заутер Л., Бабидж П., Браун Э.Л., Хилл А.А., Ахтер М.П., ​​Джонсон М.Л., Рекер Р.Р., Комм Б.С., Бекс Ф.Дж. Передача сигналов Wnt / бета-катенина является нормальной физиологической реакцией на механическую нагрузку в кости. J Biol Chem. 20 октября 2006 г.; 281 (42): 31720–31728. [PubMed] [Google Scholar] 94. Случай N, Ма М., Сен Б., Се З., Гросс Т.С., Рубин Дж. Уровни бета-катенина влияют на быстрые механические реакции в остеобластах.J Biol Chem. 24 октября 2008 г.; 283 (43): 29196–29205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 95. Sen B, Xie Z, Case N, Ma M, Rubin C, Rubin J. Механическое напряжение подавляет адипогенез в мезенхимальных стволовых клетках, стимулируя устойчивый сигнал бета-катенина. Эндокринология. 2008 декабрь; 149 (12): 6065–6075. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Механический сигнал влияет на развитие каст социальной осы

U.S. Forest Service
Забота о земле и обслуживание людей

Министерство сельского хозяйства США


  1. Механический сигнал влияет на развитие каст социальной осы

    Автор (ы): Саинат Сурьянараянан; Джон К. Хермансон; Роберт Л. Жанна
    Дата: 2011
    Источник: Текущая биология. Vol. 21, нет. 3 (8 февраля 2011 г.): стр. 231-235.
    Серия публикаций: Научный журнал (JRNL)
    PDF: Скачать публикацию (184.16 KB)

    Описание Понимание ближайших механизмов развития каст в эусоциальных таксонах может показать, как социальные виды произошли от одиночных предков. У ос Polistes текущая парадигма утверждает, что различное количество пищи на личиночной стадии вызывает расхождение каст рабочих и гинек (потенциальных маток). Но сам по себе уровень питания не может объяснить, как быстро развиваются первые несколько самок, рожденных в колонии, но при этом имеют небольшие размеры тела и рабочие фенотипы.Здесь мы приводим доказательства того, что механический сигнал смещает касту в сторону рабочего фенотипа. У Polistes fuscatus сигнал принимает форму барабанного боя усиков (AD), при котором самка синхронно трепещет своими антеннами на краях ячеек гнезда, скармливая личинкам добываемую жидкость. Частота возникновения AD высока в начале цикла колонии, когда выращивают личинок, которым суждено стать рабочими, и низка в конце цикла, когда выращивают гинекологов. Подвергание предназначенного гинекологу выводка симулированным вибрациям с частотой AD привело к тому, что они превратились во взрослых особей с пониженными жировыми отложениями, что является рабочей чертой.Это говорит о том, что AD влияет на траекторию развития личинок, подавляя физиологический элемент, необходимый для запуска диапаузы, гинекологической особенности.

    Примечания к публикации
    • Мы рекомендуем вам также распечатать эту страницу и прикрепить ее к распечатке статьи, чтобы сохранить полную информацию о цитировании.
    • Эта статья была написана и подготовлена ​​служащими правительства США в официальное время и поэтому находится в открытом доступе.

    Цитата Сурьянараянан, Саинат; Хермансон, Джон С.; Жанна, Роберт Л. 2011. Механический сигнал влияет на развитие каст социальной осы. Современная биология. Vol. 21, нет. 3 (8 февраля 2011 г.): стр. 231-235.

    Процитировано

    Ключевые слова Осы, перепончатокрылые, Polistes fuscatus, сообщества насекомых, поведение насекомых, фенотип, генетика насекомых, поведение личинок, личинки насекомых, усики, барабанный язык, питание животных, биология развития, генетика развития, размер тела , диапауза, общение с животными, каста

    Связанный поиск
    XML: Просмотреть XML

Показать больше

Показать меньше

https: // www.

alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *