Каждая плата ввода-вывода имеет 2 канала.Каждый канал представляет собой полную систему 1553 со стороной A и стороной B. Каждый канал может быть настроен как BC, RT или MT. Вы также можете добавить MT к каналу BC или RT. MT не изменяет функциональность BC или RT. MT просто позволяет вам видеть, что находится на шине для любого указанного RT или всего автобусного трафика.

Видеоуроки MIL-STD-1553

В начало

Ресурсы для загрузки по MIL-STD-1553

0

В начало

UEI предлагает широкий спектр решений для ваших оборонных и аэрокосмических приложений. Пожалуйста, нажмите на ссылку ниже, чтобы узнать больше.

К началу

Источники

Кортикальная микросхема и терапевтические перспективы

(

1

H-MRS). Prog Neuro-Psychopharmacol Biol

Psychiatry 31: 403–411.

21. Габбай В., Мао Х, Кляйн Р.Г., Эли Б.А., Бабб Д.С., Панцер А.М. и др.

(2012): g-аминомасляная кислота передней поясной коры головного мозга у подростков с депрессией

: связь с ангедонией.Arch Gen Psychiatry

69: 139–149.

22. Northoff G, Walter M, Schulte R F, Beck J, Dydak U, Henning A,

et al. (2007): Концентрация ГАМК в коре головного мозга человека передней поясной извилины

предсказывает отрицательные BOLD-ответы на фМРТ. Nat Neurosci

10: 1515–1517.

23. Hu Y, Chen X, Gu H, Yang Y (2013): Концентрации глутамата в состоянии покоя и

GABA предсказывают дезактивацию, вызванную задачей, в сети режима

по умолчанию. J Neurosci 33: 18566–18573.

24. Капогианнис Д., Рейтер Д.А., Виллетт А.А., Маттсон М.П. (2013): Плакат-

глутамат коры головного мозга и ГАМК прогнозируют внутреннюю функциональную связность

сети режима по умолчанию. NeuroImage 64: 112–119.

25. Вибкинг К., Дункан Н. В., Тирет Б., Хейс Д. Д., Марджа

нска М., Дойон Дж.,

и др. (2014): ГАМК в островке — предиктор нейронного ответа

на интероцептивную осведомленность. NeuroImage 86: 10–18.

26. Санакора Г., Мейсон Г.Ф., Ротман Д.Л., Бехар К.Л., Хайдер Ф.,

Петров ОАК и др.(1999): Пониженные уровни кортикальной g-аминомасляной кислоты

у пациентов с депрессией, определенные с помощью протонной магнитно-резонансной спектроскопии

. Arch Gen Psychiatry 56: 1043–1047.

27. Левинсон А.Дж., Фицджеральд П.Б., Фавалли Г., Блумбергер Д.М., Дейгл М.,

Даскалакис З.Дж. (2010): данные о кортикальных тормозных недостаточностях при большом депрессивном расстройстве

. Biol Psychiatry 67: 458–464.

28. Bajbouj M, Lisanby SH, Lang UE, Danker-Hopfe H, Heuser I, Neu P

(2006): доказательства нарушения коркового торможения у пациентов с большой полярной депрессией

.Биол Психиатрия 59: 395–400.

29. Льюис Д.А., Sweet RA (2009): Шизофрения с точки зрения нейронной схемы

: Продвижение к рациональной фармакологической терапии.

Дж. Клин Инвест 119: 706–716.

30. Хаслер Г., ван дер Вин Дж. В., Герачи М., Шен Дж., Пайн Д., Древец В. К.

(2009): Уровни префронтальной кортикальной гамма-аминомасляной кислоты при паническом расстройстве

, определенном с помощью протонной магнитно-резонансной спектроскопии.

Биологическая психиатрия 65: 273–275.

31. Голд Б.И., Бауэрс М.Б., Рот Р.Х., Суини Д.В. (1980): уровни ГАМК

в спинномозговой жидкости пациентов с психическими расстройствами. Am J Psychiatry

137: 362–364.

32. Гернер Р., Фэрбенкс Л., Андерсон Г. М., Янг Дж. Г., Шейнин М.,

Линнойла М. и др. (1984): нейрохимия спинномозговой жидкости у

больных маниакальной болезнью и пациентов с шизофренией по сравнению с таковой у здоровых людей.

Am J Psychiatry 141: 1533–1540.

33. Каса К., Оцуки С., Ямамото М., Сато М., Курода Н., Огава Н. (1982):

Гамма-аминомасляная кислота в спинномозговой жидкости и гомованилловая кислота

при депрессивных расстройствах.Биологическая психиатрия 17: 877–883.

34. Berrettini WH, Nurnberger JIJ, Hare TA, Simmons-Alling S,

Gershon ES, Post RM (1983): Пониженная плазма и гамма CSF —

аминомасляная кислота при аффективном заболевании: Эффект карбоната лития.

Biol Psychiatry 18: 185–194.

35. Петти Ф., Крамер Г.Л., Гуллион С.М., Джон Раш A (1992): Низкие уровни аминомасляной кислоты в плазме g-

у пациентов мужского пола с депрессией. Biol Psy-

chiatry 32: 354–363.

36.Bjork JM, Moeller FG, Kramer GL, Kram M, Suris A, Rush AJ, Petty F

(2001): Уровни ГАМК в плазме коррелируют с агрессивностью у родственников

пациентов с униполярным депрессивным расстройством. Psychiatry Res

101: 131–136.

37. Sanacora G, Gueorguieva R, Epperson CN, Wu Y-T, Appel M,

Rothman DL, et al. (2004): Специфические подтипные изменения гамма-

аминомасляной кислоты и глутамата у пациентов с большой депрессией.

Arch Gen Psychiatry 61: 705–713.

38. Hasler G, Neumeister A, Van Der Veen JW, Tumonis T., Bain EE,

Shen J, et al. (2005): Нормальные уровни префронтальной гамма-аминомасляной кислоты

у пациентов с ремиссией и депрессией, определенные с помощью протонной магнитной резонансной спектроскопии

. Биол Психиатрия 58: 969–973.

39. Sanacora G, Mason GF, Rothman DL, Krystal JH (2002): Повышение концентрации ГАМК на

затылочной коры головного мозга у пациентов с депрессией после терапии

селективными ингибиторами обратного захвата серотонина.Am J Psychiatry

159: 663–665.

40. Бхагвагар З., Вилезинска М., Тейлор М., Джеззард П., Мэтьюз П.М.,

Коуэн П.Дж. (2004): Повышение концентрации ГАМК в мозге после

острого введения селективного ингибитора обратного захвата серотонина. Am J

Психиатрия 161: 368–370.

41. Dubin M, Mao X, Gordon R, Kang G, Liston C, Shungu D (2014): TMS

над левой дорсолатеральной префронтальной корой увеличивает концентрацию ГАМК в вентромедиальной префронтальной коре при большой депрессии.

Compr Psychiatry 55: e46 – e47.

42. Дубин MJ, Мао X, Banerjee S, Goodman Z, Lapidus KAB, Kang G,

et al. (2016): Повышенная ГАМК префронтальной коры у пациентов с

большим депрессивным расстройством после лечения ТМС, измеренная с помощью спектроскопии протонного магнитного резонанса

. J Psychiatry Neurosci

41: E37 – E45.

43. Санакора Г., Мейсон Г.Ф., Ротман Д.Л., Хайдер Ф., Сиарсия Дж.Дж.,

Острофф РБ и др. (2003): Повышенная концентрация кортикальной ГАМК у

пациентов с депрессией, получающих ЭСТ.Am J Psychiatry 160: 577–579.

44. Sanacora G, Fenton LR, Fasula MK, Rothman DL, Levin Y,

Krystal JH, Mason GF (2006): Концентрация кортикальной g-аминомасляной кислоты —

тераций у пациентов с депрессией, получающих когнитивно-поведенческую терапию.

Биологическая психиатрия 59: 284–286.

45. Карпентер Л.Л., Яничак П.Г., Ааронсон С.Т., Бояджис Т., Брок Д.Г.,

Кук И.А. и др. (2012): Транскраниальная магнитная стимуляция (ТМС) для

большой депрессии: многоплановое, натуралистическое, наблюдательное исследование

исходов острого лечения в клинической практике.Подавить тревогу

29: 587–596.

46. Маккормик Д.А. (1989): ГАМК как тормозящий нейромедиатор в коре головного мозга человека

. J Neurophysiol 62: 1018–1027.

47. Сангер Т.Д., Гарг Р.Р., Чен Р. (2001): Взаимодействие между двумя

различными тормозными системами в моторной коре головного мозга человека. J. Physiol

530: 307–317.

48. Di Lazzaro V, Pilato F, Dileone M, Tonali PA, Ziemann U (2005):

Диссоциированные эффекты диазепама и лоразепама на короткое время ожидания

афферентного торможения.J Physiol 569: 315–323.

49. Кирали Дж., Премоли И., Ципсер С., Белардинелли П., Циманн У., Мюллер-

Дальхаус Ф. (2016): характеристика нейротрансмиссии

в коре головного мозга человека, опосредованной ГАМК-рецептором, с помощью парно-импульсной ТМС-ЭЭГ.

Clin Neurophysiol 127: e45.

50. Roick H, von Giesen HJ, Benecke R (1993): О происхождении

пост-возбуждающего торможения, наблюдаемого после транскраниальной магнитной стимуляции мозга

у бодрствующих людей.Exp Brain Res 94: 489–498.

51. Siebner HR, Dressnandt J, Auer C, Conrad B (1998): Непрерывные

вызвали заметное увеличение транскраниально вызванного периода молчания на

у пациента с генерализованной дистонией

. Мышечный нерв 21: 1209–1212.

52. Premoli I, Rivolta D, Espenhahn S, Castellanos N, Belardinelli P,

Ziemann U, Müller-Dahlhaus F (2014): Характеристика рецептора GABAB-

, в коре головного мозга человека парными

импульсная ТМС – ЭЭГ.NeuroImage 103: 152–162.

53. Стил Д.Д., Глабус М.Ф., Шаджахан П.М., Эбмайер К.П. (2000): усиление кортикального торможения

при депрессии: длительный период молчания с транскраниальной магнитной стимуляцией (ТМС)

. Psychol Med 30: 565–570.

54. Радху Н., де Хесус Д.Р., Равиндран Л.Н., Занджани А., Фицджеральд П.Б.,

Даскалакис З.Дж. (2013): метаанализ коркового торможения и возбудимости

с использованием транскраниальной магнитной стимуляции при психиатрических

расстройствах.Clin Neurophysiol 124: 1309–1320.

55. Chen R-S, Classen J, Gerloff C, Celnik P, Wassermann EM,

Hallett M, Cohen LG (1997): Снижение возбудимости моторной коры

с помощью низкочастотной транскраниальной магнитной стимуляции. Неврология

48: 1398–1403.

56. Daskalakis ZJ, Möller B, Christensen BK, Fitzgerald PB, Gunraj C,

Chen R (2006): Эффекты повторяющегося транскраниального магнитного стимулирования

на корковое торможение у здоровых людей.Exp Brain Res

174: 403–412.

57. Bajbouj M, Lang UE, Niehaus L, Hellen FE, Heuser I, Neu P (2006):

Влияние правой односторонней электросудорожной терапии на моторную кортикальную возбудимость

у депрессивных пациентов. J Psychiatr Res 40: 322–327.

58. Робол Э., Фиаски А., Манганотти П. (2004): Влияние циталопрама на возбудимость

моторной коры головного мозга человека: исследование парной магнитной стимуляции

. J Neurol Sci 221: 41–46.

Соматостатин-положительный дефицит ГАМК при депрессии

556 Биологическая психиатрия 15 октября 2017 г .; 82: 549–559 www.sobp.org/journal

Биологический

Психиатрия

Вызванное активностью ремоделирование микросхем обонятельной луковицы, выявленное с помощью моносинаптического отслеживания

Цитата: Arenkiel BR, Hasegawa H, Yi JD, Larsen al. (2011) индуцированное активностью ремоделирование микросхем обонятельной луковицы, выявленное с помощью моносинаптического отслеживания. PLoS ONE 6 (12): e29423. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423

Редактор: Брайан Д.McCabe, Колумбийский университет, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 22 июня 2011 г .; Одобрена: 28 ноября 2011 г .; Опубликован: 28 декабря 2011 г.

Авторские права: © 2011 Arenkiel et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Национального института неврологических расстройств и инсульта R00NS064171 и фондом Макнейра (BRA), грантом Национального института глаз R01EY018323 (BDP), грантами Национального института здравоохранения MH086339, NS04756474 и MH0478. (MDE) и Медицинский институт Говарда Хьюза (MDE).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: MDE является сотрудником Pfizer, Inc. Это не меняет приверженности авторов всем политикам PLoS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Мозг млекопитающих обеспечивает адаптивное поведение посредством большая емкость по сотовой и схемной пластике. Разнообразные масштабы нейральной пластичности варьируются от модификации одиночного синапса [1] — [3] до ремоделирования сети, которое сопровождает текущий нейрогенез [4] — [7].Механизмы пластичности приспосабливаются к изменяющимся стимулам окружающей среды, которые непрерывно передаются в мозг через множество сенсорных модальностей. Среди сенсорных систем обонятельная система обладает большой способностью к пластичности цепей за счет непрерывной генерации новых нейронов во взрослой жизни. Такое постоянное включение новых нейронов подразумевает стойкое крупномасштабное ремоделирование синаптических связей, природа которого не очень хорошо известна.

Внутри обонятельной системы аксоны обонятельных сенсорных нейронов (OSN), экспрессирующие один и тот же пахучий рецептор [8], сходятся на дискретных клубочках в главной обонятельной луковице (MOB) [9], [10].Организованные вокруг клубочков группы митральных / пучковых клеток, а также различные интернейроны образуют связанные сети, которые распространяются на все слои обонятельной луковицы [11]. Эти сети, вероятно, представляют собой унитарные модули для обработки информации об запахах [11] — [14] и могут быть функционально аналогичны барабанам в соматосенсорной коре или столбцам глазного доминирования в зрительной системе.

Функциональная организация внутри и между клубочковыми единицами MOB была предметом интенсивных исследований.Боковые взаимодействия между клубочками опосредуются в основном дендродендритными синапсами между митральными клетками и гранулированными клетками [15] — [20], и электрофизиологические свойства этих синапсов хорошо изучены [13], [21], [22]. Хотя эти эксперименты в основном изучались как одиночно зарегистрированные нейроны или синаптически связанные пары, эти эксперименты подтверждают мнение о том, что популяции нейронов, связанных с несколькими клубочками, сильно взаимосвязаны. Среди наиболее изученных форм внутрибульбарной схемы гранулярные клетки обеспечивают тормозящую обратную связь с пространственно удаленными клубочками, образуя синапсы с боковыми дендритами митральных клеток [13], [15].Кроме того, синаптические входы как от локальных коротких аксонных клеток (SACs), так и от отдаленных кортикальных нейронов обеспечивают прямую регуляцию синапсов гранулярно-митральных клеток [23] — [26]. Несмотря на центральную роль в обонятельной обработке, относительная связь отдельных гранулярных клеток с разными типами клеток, пространственная организация синаптических партнеров гранулярных клеток и регуляция связности гранулярных клеток с помощью сенсорной стимуляции остаются неясными.

Новые ГАМКергические гранулы и перигломерулярные клетки в MOB постоянно генерируются на протяжении всей взрослой жизни [27] — [29].В то время как многие нейроны, рожденные взрослыми, не способны создавать и поддерживать дендродендритные синапсы и в конечном итоге подвергаются апоптозу [30] — [32], гранулярные клетки, рожденные на ранних стадиях постнатального развития, имеют тенденцию быть долгоживущими и образуют стабильные синаптические связи [33]. Таким образом, мы стремились определить паттерны клеточной связи, сформированной постнатально рожденными гранулированными клетками в MOB, и определить, как новые микросхемы гранулярных клеток находятся под влиянием сенсорного ввода. В настоящем исследовании мы использовали отслеживание моносинаптических цепей с использованием псевдотипированного вируса бешенства вместе с условным репортерным штаммом мышей с красной флуоресценцией для маркировки интернейронов новорожденных обонятельных луковиц и их пресинаптических партнеров in vivo [34].Мы показываем, что постнатальные гранулярные клетки образуют синаптические связи с корковыми входами и несколькими типами клеток обонятельных луковиц. Паттерн моносинаптической связи показывает кластерную организацию, которая характеризуется обширными пресинаптическими входами от анатомически различных коротких аксонных клеток. Более того, усиление сенсорного восприятия за счет обогащения запаха усиливает связь SAC с нейронами гранул, рожденных в постнатальном периоде. Эти результаты определяют пресинаптический репертуар новых входов в новорожденные гранулярные клетки и поддерживают модель, согласно которой кластерные паттерны организации в обонятельной луковице простираются от локальных коротких аксонных клеток до когорт глубоких гранулярных клеток, которые охватывают пластинки обонятельной луковицы.Идентификация многочисленных коротких аксонных клеток, пресинаптических по отношению к новым гранулярным клеткам, выявляет непредвиденные клеточные взаимодействия, которые происходят во время развития синапсов гранулярных клеток (GC). Управляемые опытом изменения в связности SAC-GC обеспечивают основу схемы для уточнения или ремоделирования синаптических входов при воздействии сложной сенсорной среды посредством непрерывного нейрогенеза.

Результаты

Моносинаптическое отслеживание выявляет синаптическую связь с постнатальными гранулированными клетками

Функциональная проводка в обонятельной луковице начинается во время эмбриогенеза и продолжается на протяжении всей постнатальной жизни.В то время как эмбрионально происходящие интернейроны MOB происходят из латерального ганглиозного возвышения и дорсального телэнцефалона [35] — [38], те, которые рождаются постнатально, генерируются исключительно из субвентрикулярной зоны (SVZ) бокового желудочка [39] — [42]. Хотя многое известно о клеточных паттернах развития интернейронов MOB [35], [43], [44], паттерны синаптических соединений с новыми гранулированными клетками изучены плохо. Чтобы определить постнатальные паттерны синаптических связей на новорожденных гранулярных клетках, мы выполнили in vivo моносинаптических цепей трассировки [34].Для этого мы создали условную репортерную мышь, несущую Cre / loxP-зависимый аллель (рис.1a, S1a и S1b), способную управлять высокими уровнями цитозольной экспрессии tdTomato при введении плазмиды G-IRES-TVA-IRES-Cre ( Рис. 1b), который кодирует компоненты для целевой инфекции вируса бешенства (RV), распространения моносинаптического вируса и Cre-опосредованной условной активации репортера. В этой конструкции нейроны генетически нацелены на инфекцию посредством экспрессии рецептора TVA, который селективно связывается с частицами RV, псевдотипированными белками оболочки EnvA [45].Поскольку сконструированный мутант RV лишен белка оболочки G, плазмидная экспрессия белка оболочки бешенства G дикого типа делает возможным ровно один раунд «живой» упаковки вируса и транс-синаптической инфекции пресинаптических клеток [34], [46] — [50] . Ретроградное распространение вируса является строго моносинаптическим, поскольку только клетки, которые получают G-IRES-TVA-IRES-Cre, способны синтезировать живой вирус, тогда как пресинаптические мишени не содержат G-белок и, следовательно, неспособны продуцировать инфекционные частицы RV. Замена вирусного гена, кодирующего белок капсида G, репортером EGFP делает пресинаптические партнеры клеток-мишеней RV ярко помеченными [34], [51].

Рис. 1. Разработанный вирус бешенства позволяет отслеживать моносинаптические цепи в обонятельной луковице.

(a) Иллюстрация условного детонационного аллеля ROSA26-stop ^flox -tdTomato . (b) Иллюстрация трицистронной экспрессионной конструкции G-IRES-TVA-IRES-Cre, используемой для электропорации в субвентрикулярную зону (SVZ) мышей ROSA26-stop ^flox -tdTomato . (c) Иллюстрация процедуры электропорации in vivo . Слева плазмидную ДНК, кодирующую G-IRES-TVA-IRES-Cre, инъецировали в боковой желудочек новорожденных мышей.В центре на голову подавали прямоугольное импульсное напряжение для введения экспрессионной конструкции в предшественники SVZ. Справа, через 30 дней после электропорации, псевдотипированный SADΔG-EGFP RV вводили в обонятельную луковицу для направленной инфекции электропорированных гранулярных клеток. (d) Диаграмма, показывающая, как пре- и постсинаптические нейроны могут быть идентифицированы с помощью двухцветного моносинаптического вирусного отслеживания на условном фоне ROSA26-stop ^flox -tdTomato . Красные клетки представляют собой условную экспрессию репортера tdTomato после электропорации G-IRES-TVA-IRES-Cre.Желтые клетки представляют собой электропорированные клетки, которые также инфицированы SADΔG-EGFP RV. Зеленые клетки представляют собой пресинаптические мишени инфицированных гранулярных клеток. GL — гломерулярный слой; ЭПЛ, внешний плексиформный слой; ML, слой митральных клеток; IPL, внутренний плексиформный слой; GCL, гранулированный клеточный слой. (e) Схема, иллюстрирующая предполагаемый домен инфекции SADΔG-EGFP RV по отношению ко всей луковице. В среднем инфицированные гранулярные клетки выявлялись в пределах 302 мкм от места инъекции (зеленый кружок) ± 214 мкм (желтый внешний кружок).Масштабная линейка 300 мкм. (f) Общий вид мозга мыши ROSA26-stop ^flox -tdTomato через 30 дней после односторонней электропорации G-IRES-TVA-IRES-Cre. Пунктирная линия представляет корональный разрез, изображенный на (g) — (i). OB, обонятельная луковица. Шкала шкалы 1 мм. (g) Корональный срез через электропорированную и инфицированную обонятельную луковицу, показывающий экспрессию tdTomato и SADΔG-EGFP. Масштабная линейка 300 мкм. (h) Корональный срез обонятельной луковицы электропорированных мышей, показывающий гранулярные клетки, экспрессирующие tdTomato, при большем увеличении.(i) Раздел, показанный в (h), отображен для SADΔG-EGFP после инфицирования RV. (j) Объединенный вид (h) и (i). MC, митральная клетка; GC — гранулярно-клеточное происхождение; пунктирная стрелка — дендрит гранулярных клеток. Масштабная линейка 25 мкм. (k) — (m) Двойная экспрессия репортера tdTomato плюс SADΔG-EGFP, идентифицирующая микросхему локальной гранулярной клетки. (k) экспрессия tdTomato в отдельной гранулярной клетке. (l) экспрессия SADΔG-EGFP в той же «исходной» гранулярной клетке, показанной на (k), и локальных пресинаптических партнерах. (m) Объединенная репортерная экспрессия, очерчивающая исходную клетку (желтый) и локальных пресинаптических партнеров (зеленый).Короткие стрелки в (k – m) указывают на исходную гранулярную ячейку. Масштабная линейка 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.g001

Чтобы проверить функциональность нашей системы отслеживания, мы ввели трицистронную конструкцию G-IRES-TVA-IRES-Cre в боковые желудочки эмбрионального день 14.5 (E14.5) ROSA26-stop ^flox -tdTomato , электропорировали нейрональные предшественники в зоне желудочка и сделали ex vivo культур кортикальных срезов [52] (рис.S1c – i). Через два дня EnvA-псевдотипированные частицы SADΔG-EGFP RV [34] наносили на культивированные срезы мозга для заражения нейронов, экспрессирующих G-IRES-TVA-IRES-Cre. Три дня спустя мы наблюдали широко распространенную экспрессию tdTomato во всех слоях 4 и 5 и в стенках желудочков (рис. S1c, S1f и S1i), что указывает на нейроны, экспрессирующие рекомбиназу Cre через кассету G-IRES-TVA-IRES-Cre. Кроме того, мы наблюдали экспрессию EGFP в небольшом количестве tdTomato-позитивных нейронов, непосредственно инфицированных SADΔG-EGFP RV, которые выглядели желтыми (рис.S1h и S1i). Наконец, мы наблюдали большую когорту EGFP-экспрессирующих нейронов, лишенных экспрессии tdTomato, показывая транс-синаптическое распространение SADΔG-EGFP RV к пресинаптическим партнерам RV-инфицированных клеток (Figs. S1g-i).

Убедившись, что наша трицистронная конструкция против бешенства G-IRES-TVA-IRES-Cre (рис. 1b) функционирует вместе с линией мышей ROSA26-stop ^flox -tdTomato (рис. 1a), мы реализовали эту модельную систему. изучить синаптические связи, сформированные на постнатальных гранулярных клетках в обонятельной луковице.Чтобы нацелить новорожденные гранулярные клетки на инфекцию ПЖ и последующее моносинаптическое отслеживание, мы ввели конструкцию G-IRES-TVA-IRES-Cre в SVZ мышей постнатального дня 2 (P2) и приложили внешнее напряжение к мозгу для электропорации предшественников нейронов ( Рис. 1в, слева) [53]. Через 30 дней, когда многие из электропорированных клеток мигрировали в MOB и образовали функциональные синаптические связи [44], [54], EnvA-псевдотипированный SADΔG-EGFP вирус бешенства был введен в слой гранулированных клеток обонятельной луковицы для инфицировать новообразованные нейроны, экспрессирующие G-IRES-TVA-IRES-Cre (рис.1в, справа). Эта экспериментальная парадигма позволила нам исследовать моносинаптическую связь на постнатальных гранулярных клетках путем прямой визуализации жизненной флуоресценции нейронов, восприимчивых к псевдотипированной инфекции RV (красный), тех, которые стали инфицированными (красный и зеленый, следовательно, желтый), и пресинаптических нейронов-мишеней ( зеленый) (рис. 1г). Чтобы нацелить электропорированные гранулярные клетки для инфекции и моносинаптического отслеживания, мы вводили 250 мкл вируса бешенства SADΔG-EGFP на 750 мкм ниже поверхности обонятельной луковицы, на полпути от передней и задней границ.Хотя методы электропорации in vivo и вирусной инфекции варьируются, путем подсчета количества инфицированных исходных клеток и определения среднего бульбарного объема, охватываемого этими клетками, мы оценили распространение вируса и инфекцию, чтобы охватить сферический домен размером 300 ± 200 мкм в диаметр (рис. 1д, n = 10 меченых луковиц от 10 мышей). Для подсчета меченых исходных клеток мы сделали 100 мкм срезы через всю луковицу и идентифицировали все GC, которые экспрессировали как EGFP, так и tdTomato (n = 20-25 срезов каждый, при этом средние 3-5 срезов содержат большую часть меченых клеток).Иногда мы инфицировали перигломерулярные клетки, которые также постоянно генерируются из электропорированных SVZ [43]. В этих случаях мы наблюдали маркировку типов клеток, которые вносят вклад в сферические структуры клубочков (данные не показаны). Чтобы избежать заражения новорожденных перигломерулярных клеток, мы добавили небольшой объем (~ 20 нл) минерального масла в кончик инъекционной пипетки, чтобы предотвратить воздействие вируса при прохождении через поверхностные слои луковиц на пути к слою гранулярных клеток.

Через неделю после инфицирования RV мы обработали обонятельную луковицу и визуализировали фиксированные срезы для экспрессии репортера.Подобно тому, что мы наблюдали в эксплантатах кортикальных срезов (Fig. S1c – i), in vivo, условная активация репортера и транс-синаптическое вирусное мечение были устойчивыми и демонстрировали различные паттерны пресинаптического мечения (Figs. 1f-m). Хотя мы начали наблюдать вирус-опосредованный EGFP в пресинаптических клетках-мишенях через 3 дня после инфицирования, высокие и стабильные уровни мечения обычно достигаются через 7 дней. К 14 дню после инфицирования многочисленные пресинаптические нейроны показали аномальную морфологию, вероятно, из-за чрезвычайно высоких уровней репортерной экспрессии, управляемых геномом RV.Таким образом, для всех последующих экспериментов мы выбрали 7 дней после заражения, чтобы исследовать нашу пресинаптическую маркировку. Поскольку электропорация основана на генерации напряжения в пространстве желудочков, введенная ДНК воспроизводимо показывала односторонние паттерны экспрессии репортера в головном мозге (рис. 1f). Этот феномен был наиболее очевиден при визуализации условной экспрессии tdTomato после временного введения Cre в SVZ, которое запускало экспрессию tdTomato в нейрональных предшественниках, которые оставались активными во всех дочерних клетках, рожденных от электропорированного клона (рис.1г и 1ч). Хотя этот подход привел к клональному мечению многих новорожденных гранулярных клеток tdTomato, мы смогли выявить небольшое количество постнатальных гранулярных клеток для SADΔG-EGFP RV-инфекции (рис. 1i и 1j). Этот подход позволил нам разделить отдельные кластеры пресинаптических мишеней на электропорированные гранулярные клетки (Fig. 1k – m). На основании редкой инфекции SADΔG-EGFP RV, отсутствия точек заражения в непосредственной близости друг от друга и отсутствия клональных секторов (в отличие от тех, которые наблюдаются в кортикальных срезах, рис.S1), мы пришли к выводу, что только очень небольшое количество электропорированных клеток продемонстрировало стабильную интеграцию электропорированной плазмиды G-IRES-TVA-IRES-Cre. Чтобы дополнительно проверить это, мы выполнили моносинаптическое мечение постнатально рожденных сетей гранулярных клеток, маркируя нейрональные клоны, рожденные после электропорации с бромдезоксиуридином (BrdU) (рис. S2a). Через 14 дней после электропорации мышам добавляли BrdU в питьевую воду в течение 2 недель для маркировки всех нейронов, родившихся после этого времени, с последующей инфекцией RV и последующей обработкой тканей.Сравнивая количество зеленых пресинаптических входов с количеством зеленых клеток, меченных BrdU, мы редко когда-либо наблюдали новорожденные нейроны, которые были дважды помечены (Fig. S2b-e). Эти данные показывают, что только очень небольшая часть клеток, меченных tdTomato, несут компоненты моносинаптического отслеживания, и предполагают, что стабильная интеграция нашей экспрессионной плазмиды является редкой и, вероятно, происходит в постмитотических нейрональных предшественниках. Путем отдельной маркировки первичных точек инфекции (желтые исходные клетки) и когорты нейронов, обеспечивающих пресинаптический вход (зеленый цвет) (рис.1d), эта модульная молекулярно-генетическая система на основе вирусов, таким образом, позволила нам напрямую визуализировать синаптические микросхемы, связанные с постнатальными гранулированными клетками.

Когорты митральных клеток и синапсов коротких аксонных клеток на новые гранулярные клетки

Полный набор нейронов, которые контактируют с недавно интегрированными гранулярными клетками, неизвестен. В дополнение к дендродендритным синапсам, образованным между митральными / пучковыми клетками и гранулярными клетками, недавно было показано, что гранулярные клетки образуют функциональные связи с множественными типами локальных интернейронных клеток [24], [26].После генетического воздействия на постнатальные гранулярные клетки для инфекции SADΔG-EGFP RV, мы наблюдали обширное мечение во всей гранулярной клетке, митральной клетке и внешних плексиформных слоях (EPL) в нейронах, пресинаптических к электропорированным гранулярным клеткам. Интересно, что мы отметили сгруппированные модели связи (рис. 2а). Эти сгруппированные сети содержали митральные клетки [55] (рис. 2b) и другие клетки инфрамитрального слоя, которые морфологически соответствовали поверхностным и глубоким коротким аксонным клеткам (SAC) (рис.2в и 2г). Ограничивая экспрессию G, TVA и Cre бешенства постнатально рожденными интернейронами посредством рассчитанной по времени in vivo электропорации, мы никогда не наблюдали условную экспрессию репортера tdTomato в типах клеток, кроме перигломерулярных и гранулярных клеток. Кроме того, мы никогда не наблюдали транс-синаптического мечения между гранулированными клетками, рожденными после электропорации (рис. S2 и данные не показаны), что является аргументом против неспецифического поглощения RV посредством побочного эффекта близости.

Рисунок 2. SADΔG-EGFP RV ретроградно транспортируется от гранулярных клеток к пресинаптическим мишеням в обонятельной луковице.

(a) Коронковый срез обонятельной луковицы после моносинаптического отслеживания вируса, демонстрирующий кластерный паттерн пресинаптического мечения. Пунктирная линия показывает среднюю линию коронарного сечения MOB. Масштабная линейка, 100 мкм. (б) Экспрессия SADΔG-EGFP в пресинаптических митральных клетках. Масштабная линейка 25 мкм. (c) — (d) Экспрессия SADΔG-EGFP в коротких аксонных клетках во внешних слоях плексиформных и гранулярных клеток (заштрихованные желтые прямоугольники). Масштабные линейки, 20 мкм. (e) — (g) Частичное мечение кальретинина в клетках, экспрессирующих SADΔG-EGFP.Масштабная линейка, 20 мкм. (h) — (j) Частичное мечение парвальбумина в клетках, экспрессирующих SADΔG-EGFP. Масштабная линейка, 20 мкм. (k) — (m) Перекрывающаяся экспрессия GABA _A R α1 в коротких аксонных клетках, меченных SADΔG-EGFP. Масштабная линейка 15 мкм. (n) — (p) клетки, экспрессирующие SADΔG-EGFP, не экспрессируют тирозингидроксилазу и, следовательно, не являются перигломерулярными. Пунктирные стрелки указывают на положительную по тирозингидроксилазе клетку, не меченную SADΔG-EGFP RV. Масштабная линейка, 20 мкм. (q) — (s) Экспрессия GFAP в случайных глиальных клетках, меченных SADΔG-EGFP.Масштабная линейка 10 мкм. Стрелки указывают на перекрывающуюся экспрессию маркеров в клетках, меченных SADΔG-EGFP. Для всех панелей GL, гломерулярный слой; ЭПЛ, внешний плексиформный слой; ML, слой митральных клеток; GCL, гранулированный клеточный слой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.g002

Варьирование количества псевдотипированного RV, введенного в MOB, позволило нам контролировать количество инфицированных вирусами исходных клеток. Уровни вирусной инфекции варьировались от очень низкого (100 нл) (рис. 1к – м) до высокого (500 нл) (рис.2а) и, таким образом, может быть настроен для оптимального анализа микросхем. Для наших экспериментов мы использовали условия (250 нл), которые достигли умеренного уровня мечения (см. Рис. 1e и экспериментальные процедуры), чтобы облегчить идентификацию исходных клеток и пресинаптических партнеров. Чтобы подтвердить ретроградный транс-синаптический транспорт SADΔG-EGFP RV, мы исследовали экспрессию EGFP в областях коры головного мозга, которые, как известно, посылают центробежные сигналы дальнего действия в MOB и создают синапсы на гранулярных клетках [13], [56]. В соответствии с известным пресинаптическим транспортом RV, мы наблюдали сильную экспрессию SADΔG-EGFP в нейронах переднего обонятельного ядра (AON), горизонтальной конечности ядра диагональной полосы (HDB) и грушевидной коры (рис.S3). Более того, полное отсутствие метки EGFP в обонятельных сенсорных нейронах (OSN), которые сильно иннервируют MOB и синапс на митральные клетки, подтвердило, что мечение вируса прекращается после одного пресинаптического соединения (данные не показаны). Вместе эти данные показывают, что постнатальные гранулярные клетки могут быть точно нацелены на инфекцию RV, демонстрируют как короткие, так и дальние синаптические связи с постнатальными гранулярными клетками и выявляют кластерные паттерны организации, присущие микросхемам гранулярных клеток.

Для дальнейшего изучения репертуара клеток, пресинаптических по отношению к постнатальным гранулярным клеткам, мы выполнили иммуногистохимический анализ тонких срезов MOB и подсчитали количество EGFP-положительных, инфицированных RV нейронов, которые были отрицательными для tdTomato (следовательно, пресинаптических к Cre-экспрессирующим гранулярные клетки) с использованием молекулярных маркеров, экспрессируемых типами клеток обонятельной луковицы [57]. Чтобы начать выяснение молекулярной идентичности клеток, пресинаптических по отношению к новорожденным гранулярным клеткам, мы сделали 50 мкм срезы через меченый домен MOB (в среднем 6 срезов на луковицу), провели иммуногистохимию и подсчитали клетки, меченные EGFP, чтобы определить процент клеток это показало перекрывающуюся экспрессию различных маркеров интернейронов.В то время как только часть EGFP-положительных клеток экспрессировала маркеры интернейронов кальретинин (46 ± 5% EGFP-положительных клеток, n = 100 клеток в 18 срезах от 4 мышей; рис. 2e – g) и парвальбумин (55 ± 7%; рис. 2h – j), мы обычно наблюдали коэкспрессию субъединицы α1 рецептора GABA _A (84 ± 4%; рис. 2k – m), которая высоко и избирательно экспрессируется в SAC, находящихся в инфрамитральных слоях клеток [57]. . Таким образом, посредством иммуногистохимического анализа маркеров интернейронов в обонятельной луковице, ~ 50% клеток, меченных SADΔG-EGFP, экспрессировали парвальбумин и / или кальретинин, тогда как> 80% локальных пресинаптических входов экспрессировали субъединицу рецептора GABA _A α1.Мы никогда не обнаружили экспрессию SADΔG-EGFP в типах клеток, которые экспрессируют тирозингидроксилазу в верхнем EPL или слое клубочковых клеток (Figs. 2n-p). Интересно, что время от времени мы наблюдали экспрессию SADΔG-EGFP в ближайших глиальных клетках, которые напрямую контактировали с дендритами исходных гранулярных клеток (GC), как показано совместной локализацией с глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) (рис. 2q – s), что указывает на потенциальную роль для глиальный контакт при ремоделировании синапсов новорожденных гранулярных клеток [58] — [60]. Вместе эти данные показывают, что помимо формирования хорошо описанных контактов с центробежными входами и дендродендритными синапсами с митральными и тафтинговыми клетками, постнатальные гранулярные клетки получают обширный вход от локальных SAC в MOB.

Чтобы более внимательно изучить связь между гранулированными клетками и их пресинаптическими партнерами, мы воспользовались схемой двухцветной маркировки нашей экспериментальной системы, чтобы подсчитать количество и типы нейронов, которые были помечены SADΔG-EGFP RV путем моносинаптического переноса. Учитывая, что все гранулярные клетки, нацеленные на электропорацию G-IRES-TVA-IRES-Cre, экспрессируют tdTomato (красный), и только часть этих клеток заразилась введенным SADΔG-EGFP RV (красный и зеленый, следовательно, желтый), пресинаптические мишени могут четко идентифицироваться по наличию только EGFP (зеленый) (рис.1г). Из наших иммуногистохимических данных, идентифицирующих большинство пресинаптических нейронов немитральных клеток как SACs (рис. 2c и 2d), мы стремились определить относительную связь SAC с новыми гранулированными клетками. Мы подсчитали дважды помеченные (желтые) гранулы-источники клеток и все их зеленые пресинаптические нейрональные партнеры в серийных срезах целых обонятельных луковиц толщиной 100 мкм. В среднем мы идентифицировали 33 ± 8,1 дважды меченых исходных клеток на луковицу. Интересно, что мы обнаружили, что соотношение пресинаптически меченных коротких аксонных клеток к RV-инфицированным гранулярным клеткам было довольно высоким (4.6 ± 0,8, SEM, n = 7 обонятельных луковиц), что свидетельствует о недооцененном ранее уровне локального поступления САК в гранулярные клетки новорожденного.

Затем мы исследовали кластерную архитектуру пресинаптических SAC для недавно интегрированных GC. Для этого мы выбрали ткань обонятельной луковицы, которая имела относительно редкую инфекцию SADΔG-EGFP RV и пресинаптическую метку, чтобы облегчить визуализацию меченых SAC в микросхемах GC с клеточным разрешением (рис. 3a-c). Чтобы определить относительное количество, расположение и типы пресинаптических нейронов, которые вносят вклад в кластеризованную сеть, мы подготовили полутолстые срезы мозга (150–200 мкм), которые были оптически очищены в глицерине для конфокальной визуализации z-стека и трехмерного объема. рендеринг [61].Чтобы количественно оценить входы в исходные клетки гранул, мы взяли последовательные плоскости изображения через срезы с интервалом 2 мкм, подсчитав все нейроны с двойной меткой и только зеленые нейроны, чтобы определить отношение пресинаптических входов к исходным клеткам гранул. В дополнение к четко идентифицируемым митральным клеткам (Fig. 2a-d), реконструированные стопки изображений выявили две основные популяции SAC, которые ранее были охарактеризованы как глубокие SAC и поверхностные SAC [24], [57], [62]. Количественный анализ выявил 5,6 ± 1,5 SAC на разрешаемую кластерную сеть (рис.3d), а средняя ширина сети (включая тела клеток SAC и проксимальные дендриты) составляет 148,5 ± 40,6 мкм (n = 10 сетей SAC / GC из 4 луковиц, из 4 мышей ± SEM). Пресинаптические нейроны к отдельным GC были классифицированы как SAC по морфологии, анализу молекулярных маркеров и электрофизиологическим свойствам (рис. 2 и рис. 3d-f), тогда как ширина сетей GC-SAC была определена путем измерения длины четко разрешимых SAC. дендриты. В соответствии с предыдущими сообщениями [24], [63], пресинаптические глубокие SAC показали низкочастотные последовательности потенциалов действия с инъекциями деполяризующего тока, тогда как поверхностные SAC отвечали высокочастотными паттернами возбуждения (рис.3д – е). Маловероятно, что наша вирусная маркировка идентифицирует полный набор функциональных синапсов на постнатальных гранулярных клетках из-за неизвестной эффективности переноса частиц. Кроме того, вполне вероятно, что мы недооценили ширину функционального кластера MOB, не включив дистальные ветви аксонов SAC в нашу характеристику из-за отсутствия изображений с высоким разрешением в толстых срезах мозга. В целом эти данные обнаруживают неожиданную и обширную локальную связь между SACs и недавно интегрированными гранулированными клетками в обонятельной луковице.

Рис. 3. Гранулярные клетки новорожденного получают обширный вход от коротких аксонных клеток.

(a) — (c) Микросхема обонятельной луковицы, меченная SADΔG-EGFP, в которой пре- и постсинаптические типы клеток могут быть идентифицированы с помощью дифференциальной репортерной экспрессии. Электропорированные клетки выглядят красными из-за активации Cre экспрессии tdTomato. Клетки-источники, инфицированные SADΔG-EGFP, выглядят желтыми из-за совместной экспрессии tdTomato и EGFP. Пресинаптические партнеры становятся транссинаптически инфицированными SADΔG-EGFP, но лишены Cre и, таким образом, выглядят зелеными.Пунктирная стрелка указывает на митральную клетку MC. Стрелки указывают на короткие аксонные клетки, мешки. Стрелки указывают на исходную гранулярную ячейку, GC. Для (a) — (d): EPL, внешний плексиформный слой; ML, слой митральных клеток; GCL, гранулированный клеточный слой. (а) Экспрессия tdTomato (красный) в рекомбинированных Cre-экспрессирующих гранулярных клетках. (b) Экспрессия SADΔG-EGFP в клетке-источнике гранулы (стрелка) и ее пресинаптических мишенях (стрелки). (c) Объединение пунктов (a) и (b). Масштабная линейка, 20 мкм. (d) Примеры реконструкций с объемной визуализацией, показывающие локальные микросхемы коротких аксонных клеток с синаптическими контактами с гранулярными клетками новорожденного.Клетки постсинаптических гранул показаны красным цветом, а клетки пресинаптического короткого аксона показаны зеленым. Масштабная линейка 15 мкм. (e) — (f) Примеры реакций потенциала действия на инъекцию деполяризующего тока и изображения типов коротких аксонных клеток, которые, как наблюдали, устанавливают синаптические контакты с новорожденными гранулярными клетками. Показаны ответные реакции (слева) и клеточная морфология (справа) типичной клетки с глубоким коротким аксоном (e) и клетки с поверхностным коротким аксоном (f) с контактами с новорожденной гранулярной клеткой. Масштабные линейки 15 и 10 мкм соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.g003

Обогащение запаха увеличивает возможность подключения SAC-GC в обонятельной лампе

Чтобы изучить, как сенсорный опыт влияет на микросхемы гранулярных клеток, мы проанализировали паттерны связи между гранулированными клетками и их пресинаптическими целями после обонятельной стимуляции. Мы сконцентрировались на синаптическом входе от SAC, поскольку эти клетки были надежно помечены с использованием моносинаптического отслеживания RV (рис. 2, 3).Чтобы обеспечить широкую палитру запахов для долгосрочного сенсорного обогащения, мы разработали роботизированную систему для непрерывной циклической доставки нескольких одорантов свободно исследующим мышам (см. Рис. S4 и методы). Для обогащения запаха мышей ROSA26-stop ^flox -tdTomato подвергали in vivo SVZ электропорации с G-IRES-TVA-IRES-Cre и выращивали со своими матерями в течение 30 дней в клетках, портированных для доставки запаха (рис. . S4). После 30-дневного периода стимуляции запаха SADΔG-EGFP RV вводили в слой гранулярных клеток обонятельной луковицы, а через 7 дней обонятельную луковицу рассекали и делали срезы для подсчета двухкомпонентных (желтых) гранулярных клеток и их однокомпонентных клеток. (зеленый) пресинаптические партнеры (рис.4а). Воздействие запаха вызывало резкое увеличение количества SAC, пресинаптически связанных с новыми гранулированными клетками, по сравнению с контрольной группой, не обогащенной запахом (фиг. 4b и 4c). В частности, стимуляция запаха утроила коэффициент связи SAC с исходными GC (контроль, 4,6 ± 0,8; обогащенный запахом, 13,8 ± 1,0; n = 3 луковицы от 3 мышей, ± SEM) (рис. 4d). В среднем мы насчитали 48 ± 14 клеток-источников с двойной меткой на одну луковицу у мышей, подвергнутых обогащению запахом. Увеличение количества меченых пресинаптических партнеров не было просто отражением увеличения абсолютного количества новых гранулярных клеток, поскольку количественная оценка нормализуется к количеству меченых гранулярных клеток.Таким образом, обогащение запаха усиливает связь SAC с новыми гранулированными клетками.

Рис. 4. Обогащение запаха увеличивает связь SAC с гранулированными ячейками.

(а) Схема экспериментальной парадигмы для отслеживания изменений в связности гранулярных клеток после обогащения запаха. (b) Область контрольной обонятельной луковицы с двойной меткой, показывающая экспрессию SADΔG-EGFP в пресинаптических мишенях. Масштабная линейка 10 мкм. (c) Обонятельная луковица с двойной меткой от мыши, подвергнутой обогащению запахом, показывающая усиление пресинаптической метки (зеленый).Стрелки указывают на исходные гранулярные клетки (GC), которые выглядят желтыми из-за совместной экспрессии tdTomato и EGFP. Пресинаптические партнеры отображаются зеленым цветом. Масштабная линейка 10 мкм. ЭПЛ, внешний плексиформный слой; ML, слой митральных клеток; GCL, гранулированный клеточный слой. (d) Коэффициент связности между постсинаптическими гранулярными клетками и пресинаптическими клетками короткого аксона (SAC∶GC) в контрольных условиях или после обогащения запаха. ^* p <0,01, t-критерий Стьюдента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.g004

Одно из возможных объяснений увеличения мечения пресинаптических клеток при стимуляции запаха состоит в том, что повышенная активность нейронов усиливает перенос ПЖ в существующих синапсах. Чтобы решить эту проблему, мы приготовили эксплантаты обонятельной луковицы от мышей, которым была подвергнута электропорация плазмидой, кодирующей компоненты моносинаптического отслеживания, инфицированных SADΔG-EGFP RV и культивированных в присутствии фармакологических агентов для блокирования синаптической передачи. Мы обнаружили, что блокирование SNARE-зависимого высвобождения нейротрансмиттера, потенциалов действия или быстрой глутаматергической нейротрансмиссии не оказало значительного влияния на количество моносинаптически меченых клеток по сравнению с необработанными контролями (рис.S5). Таким образом, транс-синаптический перенос RV нечувствителен к манипуляциям с активностью в течение нескольких дней in vitro , и мы заключаем, что вызванное запахом расширение в цепи гранулярных клеток, маркирующих in vivo (рис. 4c и 4d), связано с изменениями. в количестве синаптических входов на гранулярную клетку, а не в изменении эффективности передачи правого желудочка между нейронами после обонятельной стимуляции. В соответствии с этим представлением мы наблюдали морфологические различия самих гранулярных клеток.Дважды меченые гранулярные клетки-источники в луковицах мышей, выращенных в среде с обогащенным запахом, показали значительное увеличение количества дендритных выступов (контроль, 8,4 ± 0,7 на дендрит 25 мкм, n = 17 нейронов с двойной меткой от 3 мышей; запах, 12,7 ± 0,9; n = 18 нейронов с двойной меткой от 4 мышей; p <0,01; рис. 5а и 5б). Мы также отметили значительное увеличение количества тормозных синапсов на дендритах исходных гранулярных клеток при окрашивании на ингибиторный маркер синапсов гефирин (контроль, 7.8 ± 0,9 кластеров гефирина на дендрит 35 мкм; запах 11,9 ± 1,3; n = 12 нейронов из 3 луковиц каждый; р <0,02; Рис. 5c и 5d). Чтобы ограничить наш анализ синаптическими изменениями в постнатальных нейронах, гефирин-положительные точки были подсчитаны только в том случае, если они могли быть четко колокализованы в дважды меченых клетках-источниках гранул. В соответствии с усилением входа SAC в гранулярные клетки после обогащения запаха, мы также отметили увеличение входа митральных клеток (данные не показаны). Принимая во внимание эти данные, мы не можем исключить, что часть гефирин-положительных точек действительно может соответствовать повышенному центробежному входу от других ингибирующих типов клеток.Тем не менее, эти данные подтверждают усиление пресинаптического воздействия на новорожденные нейроны после обогащения запаха и показывают индуцированное активностью расширение цепей SAC.

Рис. 5. Стимуляция запаха увеличивает синаптические входы в гранулярные клетки новорожденного.

(a) Дендриты гранулярных клеток у контрольных мышей или мышей, подвергшихся воздействию запаха, демонстрируют увеличенное количество шипов после обогащения запаха. Желтые стрелки указывают на отдельные шипы. Масштабная линейка 3 мкм. (b) Данные представляют собой средние значения ± SEM числа шипов на дендрит 25 мкм на гранулярных клетках у мышей, подвергшихся циклическому воздействию одорантов (запаха), по сравнению с контрольными животными, не подвергавшимися воздействию запаха. ^* p <0,001, t-критерий Стьюдента. (c) Мечение гефирином для выявления ингибирующих ГАМКергических синапсов на дендритах контрольных гранулярных клеток. Вставки в (c) и (d) показывают экспрессию tdTomato в дважды меченых дендритах. Масштабные линейки, 2 мкм. (d) Увеличение количества меченных гефирином ингибирующих синапсов, контактирующих с дендритами гранулярных клеток мышей, подвергшихся обогащению запахом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.g005

SACs обеспечивают ГАМКергический ингибирующий вход в гранулярные клетки MOB [24], [26], [64].Затем мы проверили, соответствует ли индуцированное запахом увеличение как пресинаптических по отношению к GC SAC, меченных RV, так и ингибирующих синапсов, меченных гефирином, с изменениями в функциональной синаптической связности. С этой целью мы выполнили регистрацию патч-кламп целых клеток в острых срезах мозга из меченых гранулярных клеток MOB после постнатальной электропорации in vivo и и измерили миниатюрные тормозные постсинаптические токи (mIPSCs). В соответствии с наблюдаемым увеличением количества гефириновых точек (рис.5c, d), стимуляция запаха значительно увеличивала частоту mIPSC в постнатальных гранулярных клетках (рис. 6). В то время как амплитуды mIPSC были одинаковыми между экспериментальными группами (контроль, 15,2 ± 1,4 пА; запах, 14,4 ± 1,3 пА; рис. 6b), частота mIPSC была увеличена у животных, подвергшихся воздействию запаха (контроль, 0,55 ± 0,06 Гц, n = 9 клеток из 3 мыши; запах 0,89 Гц ± 0,07, n = 10 клеток от 4 мышей, p <0,01, непарный t-критерий; рис. 6a). Взятые вместе, эти данные показывают, что сенсорный опыт расширяет связь между короткими аксонными клетками и новыми гранулярными клетками, определяя новый тип клеток реорганизации обонятельных цепей в ответ на активность, индуцированную запахом.

Рис. 6. Обогащение запаха увеличивает ингибирующее действие на гранулярные клетки новорожденного.

(a) — (b) Количественный анализ (a) средней частоты и (b) амплитуды mIPSC, записанных из меченых гранулярных клеток у контрольных мышей и мышей с обогащенным запахом. Обогащение запаха увеличивало частоту, но не амплитуду миПСК гранулярных клеток (контроль, n = 9; запах, n = 10, ^* p <0,01, непарный t-критерий). (c) Репрезентативные записи с фиксацией напряжения mIPSC из гранулярных клеток в срезах острой MOB от контрольных мышей и мышей с обогащенным запахом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.g006

Обсуждение

В настоящем исследовании мы объединили отслеживание генетических цепей и технологии мечения in vivo для картирования моносинаптических связей между постнатальными гранулярными клетками и их пресинаптическими входными нейронами в обонятельной луковице мыши. Мы обнаружили, что в дополнение к ранее известным связям с митральными / тафтинговыми клетками, постнатальные гранулярные клетки обнаруживают обширную связь с короткими аксонными клетками, и эти входы коротких аксонных клеток вносят вклад в кластерную архитектуру в обонятельной луковице.Кроме того, мы обнаружили, что усиление сенсорного восприятия в форме стимуляции запаха расширяет возможности связи цепей с гранулярными клетками новорожденного. Это увеличение синаптической связности проявляется как трехкратное расширение пресинаптически связанных коротких аксонных клеток и сопровождается соответствующим увеличением ингибирующих синапсов гранулярных клеток и mIPSCs, а также изменениями в морфологии дендритов.

Ввод коротких аксонных клеток в клетки-гранулы

Реализуя высокоселективную стратегию генетического нацеливания in vivo на , мы исследовали синаптические паттерны связи, которые создаются между постнатальными гранулярными клетками и их пресинаптическими мишенями, используя сконструированный вирус бешенства для отслеживания моносинаптических цепей.Наш экспериментальный план позволил нам выборочно нацелить гранулярные клетки на инфекцию и распространение бешенства с помощью электропорации in vivo [53], что позволяет напрямую определять типы клеток, пресинаптических для нацеленных на гранулярные клетки. Используя этот подход, мы наблюдали дискретные синаптические сети, связанные с микросхемами гранулярных клеток. Удивительно, но большинство нейронов, осуществляющих локальные пресинаптические входы в постнатальные гранулярные клетки, были идентифицированы как SAC в гранулярных клетках и внешних плексиформных слоях обонятельной луковицы.

Недавние морфологические и электрофизиологические исследования показали, что SACs продуцируют ветвления аксонов во всех слоях обонятельной луковицы, являются пресинаптическими по отношению к резидентным гранулярным клеткам и обеспечивают GABAergic вход, который модулирует запуск гранулярных клеток [24], [26], [57]. Интересно, что поверхностные SAC, которые мы идентифицировали в этом исследовании, обладают морфологическими и электрофизиологическими характеристиками, аналогичными нейронам Ван-Гехухтена, которые экспрессируют многие из тех же молекулярных маркеров, что и глубокие SAC, но, как полагают, устанавливают контакты как с GC, так и с митральными клетками и являются аксонами. без [62] — [66].Эти свойства предполагают, что SAC обеспечивают пространственное уточнение локальных тормозных цепей, которые формируют активирующие свойства митральных клеток. В других областях мозга ГАМКергический ввод во время развития нейронов способствует дифференцировке клеток, выживанию и созреванию контуров [67] — [71]. Учитывая продолжающийся взрослый нейрогенез, резидентные клетки короткого аксона в зрелой обонятельной луковице могут сходным образом вносить вклад в динамическое ремоделирование, дифференцировку или выживание вновь включенных гранулярных клеток [43], [72].Таким образом, помимо обеспечения ингибирующего контроля над дендродендритными синапсами в зрелом контуре, SAC могут регулировать синаптическую интеграцию новорожденных гранулярных клеток посредством сигнальных механизмов развития. В таком сценарии обогащение запаха не только изменит сетевую активность в лампочке, но и будет способствовать поступлению ГАМК-энергии в новые GC из выбранных когорт SAC. Эти сети запахов могут служить центрами активности, которые более благоприятны или привлекательны для формирования и выживания синапсов новорожденных нейронов.Более усовершенствованные способы манипуляции активностью контуров с использованием специфических для типов клеток химических, генетических или оптогенетических манипуляций потребуются для полного рассмотрения этого понятия [46].

Наш экспериментальный подход оказался эффективным в разграничении типов пресинаптических клеток, которые, как известно, создают функциональные связи с постнатально рожденными гранулированными клетками, включая центробежный ввод от обонятельной коры, митральных / пучковых клеток и SAC. Обширная связь, обеспечиваемая SAC с гранулированными клетками, поднимает вопрос об идентичности нейронов, которые являются пресинаптическими по отношению к SAC.Какие типы клеток управляют тормозящим влиянием, которое SAC, в свою очередь, передают на гранулярные клетки? Хотя было высказано предположение, что митральные клетки могут выполнять эту роль [24], прямые доказательства в поддержку этой модели отсутствуют. Будущее генетически ориентированное моносинаптическое отслеживание хорошо подходит для ответа на этот вопрос. Другим интригующим наблюдением стало вирусное мечение некоторых редких глиальных клеток, которые, как было установлено, находятся в прямом физическом контакте с гранулированными «исходными» клетками. Такое мечение могло быть связано с захватом вирусных частиц на контактах нейрон-глия.Действительно, новорожденные нейроны неокортекса, как известно, образуют временные щелевые контакты с радиальной глией [73], и были описаны функциональные нейронно-глиальные синапсы [74], [75]. Альтернативно, глиальное мечение может возникать за счет избирательного поглощения или поглощения клеточных остатков во время апоптоза или сокращения синапсов [76], [77]. В будущих исследованиях будет важно изучить электрофизиологическую и ультраструктурную природу этого взаимодействия нейронов с глией.

Распространение запаха расширяет схему обонятельной лампы

SACs рождаются во время эмбрионального развития и являются резидентными до сенсорного ввода или интеграции гранулярных клеток [35], [78].Таким образом, кластерная организация на гранулярных клетках может отражать события формирования паттерна развития, которые происходят во время созревания переднего мозга, или, альтернативно, может представлять локальную связность, которая вырабатывается или сокращается в ответ на паттерны сенсорного опыта или клубочковой активности. В нашей экспериментальной системе мы наблюдали кластерные входы SAC в гранулярные клетки как в нестимулированных контрольных группах, так и в группах, обогащенных запахом. Однако, помимо известного обогащения постнатальных нейронов, которые интегрируются в цепи обонятельной луковицы после стимуляции запахом [7], [31], мы обнаружили, что количество нейронов, формирующих функциональные пресинаптические входы в отдельные гранулярные клетки, также резко возрастает. усиливается после обогащения запаха.Этот повышенный уровень пресинаптического входа в исходные клетки постсинаптических гранул был обнаружен по большему количеству помеченных пресинаптических мишеней, морфологическим изменениям в постсинаптических структурах позвоночника и тормозных каркасов, а также по увеличению тормозящего влечения. Наличие большего количества пресинаптических входов в новорожденные GC не обязательно означает линейное увеличение межклеточной связи. То есть в ответ на стимуляцию запаха дополнительные типы пресинаптических клеток могут образовывать синаптические связи без общего изменения абсолютного числа синапсов на GC, при условии, что общий коэффициент связности для любой данной пресинаптической целевой клетки уменьшается.Хотя фокус нашего анализа был на увеличении количества входов в GC SAC, мы также наблюдали увеличение количества меченых пресинаптических митральных клеток (данные не показаны). Вероятно, что изменения, которые мы наблюдаем в клеточной морфологии и электрофизиологическом выходе в ответ на обогащение запаха, отражают совокупность расширенной связи не только со стороны SAC, но также митральных клеток и центробежных входов. В настоящем исследовании мы показали, что пресинаптические связи, создаваемые SAC на гранулярных клетках новорожденных, значительно увеличиваются в ответ на сенсорную стимуляцию, предполагая, что они играют ключевую роль в способности постнатальных нейронов интегрироваться в интактный мозг.Для будущих исследований будет важно детально определить, как весь репертуар пресинаптических входов настраивается сенсорным опытом. Таким образом, помимо увеличения количества вновь включенных гранулярных клеток [4], [7], [31], [79], сенсорный опыт привлекает дополнительные пресинаптические элементы, которые контактируют с каждой гранулярной клеткой. Такая усиленная интеграция может способствовать высокой степени клеточной пластичности в этой области мозга и улучшенному сенсорному различению, наблюдаемому при обогащении запаха [4].

Наши эксперименты с эксплантами на срезах предполагают, что синаптическая передача RV не зависит от потенциалов действия, VAMP-опосредованного синаптического высвобождения и быстрой глутаматергической нейротрансмиссии и, таким образом, отражает изменения в физических сетевых связях. В самом деле, стимуляция запаха увеличивает плотность шипов и тормозящие синапсы на новых гранулярных клетках, что согласуется с увеличением пресинаптического входа. Остается определить, приводят ли изменения контура, которые мы наблюдали в нашей экспериментальной парадигме, к долгосрочным структурным изменениям, которые сохраняются на протяжении всей жизни животного, или представляют собой временные связи, которые обрезаются или теряются в отсутствие постоянного ощущения запаха.Наш текущий метод маркировки пресинаптических входов необратим, и для будущих долгосрочных исследований по отслеживанию будет важно изучить временной ход пластичности цепи гранулярных клеток в ответ на обогащение запаха или депривацию. Такой анализ может потребовать новых технологий для повторной генетической маркировки пресинаптических партнеров на определенных популяциях клеток с течением времени.

Наше настоящее исследование продемонстрировало возможности новых генетических технологий для определения нейронных цепей in vivo .Обонятельная система — это необычно пластичная область мозга млекопитающих, способная непрерывно добавлять и удалять клеточные когорты с сопутствующим ремоделированием синапсов и цепей во взрослом возрасте. Наши результаты показывают, что сенсорный опыт способствует синаптической интеграции новых нейронов в обширные, пространственно организованные, специфичные для клеточного типа обонятельные цепи, обеспечивая управляемую модель in vivo , чтобы лучше понять, как активность влияет на формирование сложных нервных цепей. Более того, взрослые нейроны, обычно предназначенные для обонятельной луковицы, могут перенаправляться к участкам поражения в неокортексе и полосатом теле [80], [81], предполагая, что механизмы пластичности, врожденные для этого возобновляемого типа клеток, могут быть использованы для восстановления тканей.В более широком смысле, моносинаптическое отслеживание in vivo обеспечивает мощный подход к картированию глобальной связности недавно интегрированных нейронов во время развития, пластичности и регенерации.

Методы

Все экспериментальные процедуры и реагенты, использованные для этого исследования, были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию при Медицинском колледже Бейлора и Медицинском центре Университета Дьюка.

Конструкция плазмиды экспрессии

Для создания конструкции pCAG-Rabies G-IRES-TVA кДНК, кодирующая G бешенства, была вырезана из pHCMV-RabiesG [82] и клонирована в модифицированный остов pCIG [83].Для бицистронной экспрессии рецептора TVA кДНК TVA из pCMMP-TVA800 [84] амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали ниже элемента IRES2 (Clontech, Mountain View, CA) для вставки 3 ‘в бешенство G. экспрессия рекомбиназы Cre, IRES-Cre [85] вставляли ниже G-IRES-TVA от бешенства для генерации pCAG-rabies G-IRES-TVA-IRES-Cre.

Поколение

Фрагмент кДНК размером 1,6 т.п.н., кодирующий белок tdTomato (предоставленный Roger Tsien, UCSD), амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали перед сигнальной последовательностью polyA pCRII.Конструкция tdTomato-polyA была проверена секвенированием. Затем мы сконструировали челночный вектор, сначала клонировав кДНК tdTomato-polyA в вектор pBigT [86] и вставив промоторный элемент CAG с использованием PacI перед последовательностью loxP-stop-loxP. Затем мы переместили кассету CAG-loxP-stop-loxP-tdTomato-polyA в плазмиду, нацеленную на акцептор pROSA, как описано ранее [87], чтобы получить вектор нацеливания ROSA-CAG-loxP-stop-loxP-tdTomato. Эта нацеленная конструкция была линеаризована и электропорирована в клетки E14 ES [88].После отбора клоны отбирали и проверяли на рекомбинированный аллель с помощью саузерн-блоттинга. Для саузерн-блоттинга геномную ДНК ES-клеток расщепляли EcoRV, переносили и гибридизовали с внешним зондом в локус ROSA26. Аллель дикого типа давал фрагмент размером 11,5 т.п.н., тогда как полоса 5,7 т.п.н. выявляла мутантный аллель. Используя стандартные процедуры [89], положительные клоны ES-клеток использовали для создания мышей, нацеленных на ген. Полученное потомство генотипировали с помощью ПЦР. Для обнаружения как аллелей дикого типа, так и целевых аллелей были разработаны следующие праймеры для ПЦР для мультиплексирования: Rosa / 01 , 5′-CACTTGCTCTCCCAAAGTCG -3 ‘; Rosa / 02 , 5′-TAGTCTAACTCGCGACACTG -3 ‘; CAG / 02 , 5′- GTTATGTAACGCGGAACTCC -3 ‘.Аллель дикого типа продуцировал фрагмент размером ~ 560 п.н. с праймерами Rosa / 01 и Rosa / 02 , тогда как мутантный аллель был обнаружен по фрагменту размером ~ 300 п.н. с праймерами Rosa / 01 и CAG / 02 .

Электропорация in vivo и мечение RV постнатальных гранулярных клеток

Новорожденных мышей анестезировали кратковременным переохлаждением. Затем 500 нл 1 мкг / мкл плазмидной ДНК, свободной от эндотоксина, вводили в одностороннем порядке в правый боковой желудочек с помощью шприца Hamilton с иглой 33-го размера со специальным скосом (Hamilton Company, Reno, NV).Электропорацию проводили путем приложения нескольких импульсов напряжения по ширине головы новорожденного, сразу позади глаз, с использованием круглых 7-миллиметровых пинцетов и прямоугольного электропоратора BTX ECM 830 (Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс). Параметры электропорации включали 5 импульсов 150 В по 50 мс каждый с интервалом 950 мс. Сразу после процедуры электропорированных мышей возвращали в отапливаемую домашнюю клетку и наблюдали до выздоровления. Через 30 дней после процедуры электропорации 250 нл (6 × 10 ³ частиц / мкл) псевдотипированного SADΔG-EGFP RV вводили в слой гранулярных клеток обонятельной луковицы с помощью стеклянных инъекционных пипеток и Nanoject II (Drummund Scientific Company , Брумолл, Пенсильвания).Мы направили инъекцию в середину обонятельной луковицы на 750 мкм ниже поверхности мозга. Это привело к заражению объемом ~ 300 мкм в диаметре ± 200 мкм (см. Рис. 1e). Через 7 дней после заражения обонятельные луковицы препарировали и готовили для анализа изображений.

Электропорация и культуры органотипических срезов

Органотипических срезов мозга получали и культивировали, как описано ранее [52], с небольшими модификациями. Для срезов ex vivo дорсальные предшественники телэнцефала метили путем инъекции плазмидной ДНК pCAG-Rabies G-IRES-TVA-IRES-Cre (0.1 мг / мл), разведенных в 0,1% растворе Fast Green, в боковые желудочки обезглавленных голов мышей E14.5 ROSA26-stop ^flox -tdTomato . Раствор доставляли с помощью небольшой стеклянной капиллярной пипетки, присоединенной к Picospritzer II (General Valve Corp., Фэрфилд, Нью-Джерси), с использованием пяти импульсов 15 фунтов на кв. Дюйм длительностью 4 мс каждый. Электрические потенциалы генерировались на неповрежденных головках с использованием покрытых золотом электродов, прикрепленных к электропоратору ECM 830 со следующими параметрами: четыре импульса по 100 мс 45 В, разделенные интервалами 100 мс.Сразу после электропорации мозг препарировали, делали срезы вибратомом на 250 мкм и сохраняли в качестве интерфейсных органотипических культур до фиксации и иммуногистохимического мечения. Для срезов острых обонятельных луковиц новорожденных мышей дикого типа подвергали электропорации, как описано выше, с ДНК-плазмидой, кодирующей EF1α-tdTomato-P2A-Rabies G-IRES-TVA-WPRE-pA. Через 10 дней мозг препарировали, делали срезы вибратомом на 250 мкм, инфицировали вирусом и поддерживали в качестве интерфейсных органотипических культур. На следующий день фармакологические агенты, включая один или несколько из TTX (1 мкМ, Sigma), ботулинический токсин A (50 нМ, Sigma), столбнячный токсин (50 нМ, Sigma), APV (50 мкМ, Tocris) или CNQX (50 мкМ , Tocris) добавляли к питательной среде и вводили повторно каждые 24 часа в течение 5 дней.Затем срезы фиксировали, визуализировали и подсчитывали для флуоресцентно меченных клеток.

Конфокальная визуализация и иммуногистохимия

Экспериментальных мышей умерщвляли, перфузировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере, препарировали для удаления интактного мозга и постфиксировали в течение 1 часа при 4 ° C. Ткань мозга помещали в O.C.T и либо делали срезы до 12 мкм на вертикальном криостате Leica, либо срезы 50–100 мкм нарезали на охлаждаемом микротоме столика. Срезы тканей помещали на предметные стекла и отображали с помощью вертикального сканирующего конфокального микроскопа Zeiss 510 (Carl Zeiss Inc.). Для иммуногистохимии срезы инкубировали с блокирующим раствором (10% нормальная козья сыворотка, 2% BSA, 0,1% Triton X-100 в PBS pH 7,4) и инкубировали при 4 ° C в течение 2 часов. Мышиный моноклональный антикалретинин (1-1500; Millipore, Temecula, CA), кроличьи поликлональные анти-GABA _A α1 (1-1000; Covance), кроличьи поликлональные анти-GFAP (1-1500; Abcam, Cambridge, MA) , поликлональные антитела против парвальбумина морских свинок (1-500, Millipore, Temecula, CA), моноклональные антигефирины (1-2000; Synaptic Systems, Германия) или кроличьи поликлональные антитирозингидроксилазы (1-2000; Novus, Littleton, CO) антитела разводили в блокирующем растворе и наносили на ночь при 4 ° C.На следующий день срезы промывали 3 раза по 15 минут в PBS с 0,1% Triton X-100, а затем 2 раза по 15 минут в блокирующем растворе. Затем добавляли вторичные козьи антитела против кроличьего IgG к Alexa-633, ослиные антитела против мышиных антител Alexa-647 или козьи антитела против морских свинок Alexa-633 (Invitrogen, Carlsbad, CA) затем добавляли до конечного разведения 1-500 и инкубировали в течение 4 дней. ч при 4 ° C. Затем срезы промывали 4 × 15 мин каждый и наносили на DAPI-содержащую монтажную среду Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Иммунореактивные слайды отображались так же, как необработанные ткани.

Двойное иммунофлуоресцентное мечение BrdU и GFP.

Тонкие срезы 14–16 мкм были вырезаны на вертикальном криостате Leica и собраны на предметных стеклах Superfrost Plus. Слайды сушили на воздухе в течение 1 часа, повторно гидратировали в PBS и погружали в блокирующий раствор (описанный выше) на 1 час при комнатной температуре. Затем кроличьи антитела против GFP (1-500, Molecular Probes, CA) наносили на предметные стекла в блокирующем растворе в течение ночи при 4 ° C. На следующий день слайды промывали 3 раза по 5 минут каждое в PBS, после чего наносили антикроличий Alexa 488 (1-500, Molecular Probes, CA) в течение 1 часа при комнатной температуре.Затем предметные стекла промывали 3 раза по 5 минут каждое, после фиксировали в 4% PFA в течение 15 минут, промывали в PBS 3 раза по 5 минут каждое, погружали в 0,5N HCl при 55 ° C на 6 минут, затем снова фиксировали в 4%. PFA в течение 10 мин, затем промывали 3 раза по 5 мин в PBS. Затем слайды переваривали в растворе протеиназы К (0,5 мг / мл) при 37 ° C в течение 4 минут, затем фиксировали в 4% PFA в течение 15 минут, затем промывали 3 × 5 минут каждое в PBS. После последней промывки предметные стекла погружали в блокирующий раствор на 1 час при комнатной температуре, заменяли свежим блокирующим раствором, содержащим мышиный анти-BrdU (1∶200, Chemicon), и реагировали в течение ночи при 4 ° C.На следующий день слайды промывали 3 раза по 5 минут каждое, промывали блокирующим раствором, затем заменяли блокирующим раствором, содержащим антимышиный Alexa 594 (1-500, Molecular Probes, CA) в течение 1 часа при комнатной температуре. Наконец, слайды промывали 3 раза по 5 мин каждое, закрывали покровным стеклом и отображали для подсчета клеток.

Реконструкция 3D флуоресцентного изображения.

Для создания трехмерных изображений микросхем, меченных RV в обонятельной луковице, файлы изображений LSM, содержащие 50–75 плоскостей изображения z-стека из очищенных срезов мозга 150 мкм [61], разнесены на 1.На расстоянии 5 мкм обрабатывали с использованием программного обеспечения Amira для сегментации и объемного рендеринга (Visage Imaging, Сан-Диего, Калифорния). Плоскости изображения были получены при 20-кратном увеличении полного поля. Были реконструированы изолированные пресинаптические сети, включающие идентифицируемые одиночные исходные гранулярные клетки и их пресинаптические SAC. После отслеживания всех типов клеток, экспрессирующих EGFP, и выполнения сегментации, митральные клетки, меченные EGFP, и случайные gial клетки были замаскированы из реконструкции изображения, чтобы обеспечить лучшее разрешение изображения и измерение сетей SAC.Из-за неопределенности происхождения всех тонких нейритов, выходящих из поля изображения, измерения сетей SAC были ограничены четко определяемыми дендритами.

Анализ дендритных выступов.

Для количественной оценки количества выпячиваний, которые мы наблюдали на дендритах постнатальных гранулярных клеток после обогащения запаха, мы умерщвляли мышей из стимулируемой запахом и контрольной групп, выполняли внутрикардиальную перфузию, а затем фиксировали в течение 1 часа в 4% параформальдегиде в PBS.Ткань мозга подвергали криозащите в 30% сахарозе / PBS и замораживали в O.C.T. Тонкие срезы (20 мкм) вырезали на криостате и помещали на предметные стекла Superfrost Plus. С помощью вертикального конфокального микроскопа Zeiss 510 сначала были идентифицированы дендриты с двойной меткой (исходные клетки-гранулы), отходящие от RV-инфицированных гранулярных клеток при 40-кратном увеличении. Визуализация и анализ количества протрузий проводились в случайно выбранных сегментах дендритов с двойной меткой длиной 25 мкм в пределах внутреннего EPL. Были идентифицированы верхняя и нижняя границы дважды помеченных дендритных сегментов, и несколько конфокальных плоскостей изображения были собраны на расстоянии 250 нм друг от друга для создания отдельных файлов изображений z-стека с 40 плоскостями и толщиной 10 мкм, чтобы охватить всю толщину дендрита.Все подсчеты дендритных выступов проводились без учета экспериментальных манипуляций. Морфологический критерий, установленный для анализа, заключался в том, что длина выступа (ось, перпендикулярная стержню дендрита) была ≥ ширине выступа. Это было определено в 3-х измерениях путем ручной визуализации каждой плоскости серийных z-стопок для каждого дендритного сегмента, включенного в анализ. Данные были представлены в виде ± SEM числа шипов на дендрит 25 мкм на гранулярных клетках у мышей, подвергшихся циклическому воздействию одорантов (запаха), по сравнению с контрольными животными, не подвергавшимися запаху.p <0,001, t-критерий Стьюдента. Для отображения репрезентативные изображения дендритных сегментов, используемые для подсчета выступов, были созданы как максимальные проекции Z-стека.

Анализ синаптических точек.

Все подсчеты точек, положительных по гефирину, проводились без учета условий эксперимента. Чтобы количественно оценить изменения в количестве синаптических точек после стимуляции запахом, мы подготовили меченую вирусом ткань обонятельной луковицы, как описано выше, для анализа позвоночника. Вкратце, срезы 20 мкм были вырезаны и помещены на предметные стекла.С помощью вертикального конфокального микроскопа Zeiss 510 были идентифицированы дважды меченые дендриты, отходящие от инфицированных RV гранулярных клеток при 40-кратном увеличении. Были идентифицированы верхняя и нижняя границы дважды помеченных дендритных сегментов, и несколько конфокальных плоскостей изображения были собраны на расстоянии 250 нм друг от друга для создания отдельных файлов изображений z-стека с 40 плоскостями и толщиной 10 мкм, чтобы охватить всю толщину дендрита. Гефирин-положительные точки были идентифицированы и включены в наш анализ только в том случае, если они были четко разделены внутри клеток-источников гранул с двойной меткой.Это было определено путем визуализации вручную каждой плоскости последовательных z-стеков для каждого сегмента дендрита. Пункты считались колокализованными и подсчитывались, если окрашивание гефирином наблюдалось в ≥2 независимых плоскостях изображения через дважды меченый дендрит. Положительные по гефирину каркасы исключались из анализа, если они были ≥3 мкм в любом измерении. Данные были представлены в виде ± SEM количества гефирин-положительных точек на дендрит 35 мкм на гранулярных клетках у мышей, подвергшихся циклическому воздействию одорантов (запаха), по сравнению с контрольными животными, не подвергавшимися запаху.p <0,02, t-критерий Стьюдента. Для отображения репрезентативные изображения дендритных сегментов, используемых для подсчета гефирина, были созданы в виде максимальных проекций Z-стека.

Обогащение запаха

Обогащение запаха проводили с использованием параметров, аналогичных описанным ранее [90]. Для контролируемой доставки запаха робот-дозатор жидкости (модель 7200; I&J Fisnar, Fair Lawn, NJ) был запрограммирован на непрерывный цикл через 42 флакона, содержащие различные смеси одорантов, в течение 4 недель после электропорации.Отдушки подавали в течение 5 с каждый с последующей выдержкой на чистом воздухе в течение 1 мин при скорости потока 0,2 л / мин. Одоранты разбавляли минеральным маслом в соответствии с их индивидуальным давлением паров, чтобы получить номинальную концентрацию в свободном пространстве 100 ppm. Дальнейший поток разбавил одоранты до номинальной конечной концентрации паровой фазы ~ 10 ppm. Для смешанных стимулов соединения разбавляли до той же конечной концентрации доставки.

Электрофизиология срезов

Подготовка ломтика обонятельной луковицы.

Мышей умерщвляли пентобарбиталом натрия (40 мг / кг, внутрибрюшинно) и декапитировали после исчезновения роговичных рефлексов. Мозг быстро удаляли в ледяной буфер для препарирования, содержащий (в мМ): 87 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO ₄ , 25 NaHCO ₃ , 75 сахарозы, 10 декстрозы, 1,3 аскорбиновой кислоты, 7 MgCl. ₂ и 0,5 CaCl ₂ , барботированный 95% O ₂ и 5% CO ₂ . В том же буфере для рассечения обонятельную луковицу изолировали и нарезали коронарно при 250 мкМ с помощью вибрирующего микротома (Leica VT1200S).Срезам давали возможность восстановиться в течение 20 минут при 35 ° C в ACSF, содержащем (в мМ): 124 NaCl, 3 KCl, 1,25 Na ₂ PO ₄ , 26 NaHCO ₃ , 1 MgCl ₂ , 2 CaCl ₂ и 20 D-глюкоза, насыщенная 95% O ₂ и 5% CO ₂ , ~ 310 мОсм, pH ~ 7,25, и хранили при комнатной температуре до использования. Запись проводилась в погружной камере при 30–32 ° C в ACSF.

Записи всей клетки.

Клетки с коротким аксоном или исходные гранулярные клетки новорожденного были визуально идентифицированы с помощью оптики IR-DIC, а затем нацелены для регистрации либо с помощью EGFP, либо с помощью двойной флуоресценции EGFP и tdTomato, соответственно.Пипетки-патчи были извлечены из толстостенного боросиликатного стекла с сопротивлением открытого конца 2-7 МОм и были заполнены (в мМ) 120 K-глюконатом, 5 KCl, 2 MgCl ₂ , 0,05 EGTA, 10 HEPES, 2 Mg- АТФ, 0,4 Mg-GTP, 10 креатининфосфат, pH 7,3, 280–290 мОсм, внутренний раствор для экспериментов с токовым зажимом для характеристики вызванного потенциала действия в коротких аксонных клетках. Для экспериментов с фиксацией напряжения для регистрации mIPSC в меченых новорожденных гранулярных клетках внутренний раствор был (в мМ) 89 CsMeS, 46 CsCl, 1 MgCl ₂ ,0.16 CaCl ₂ , 0,2 EGTA, 15 HEPES, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP, 15 TEA-Cl, 14 креатининфосфат, pH 7,3, 315 мОсм. Для регистрации mIPSC клетки зажимали при -80 мВ и перфузировали в ванне 50 мкМ APV, 50 мкМ CNQX и 1 мкМ TTX. Клетки регистрировали с использованием усилителя патч-зажима (Multiclamp 700A, Molecular Devices), а данные собирали и анализировали с использованием программного обеспечения pCLAMP 10 (Molecular Devices) и Minianalysis (Synaptosoft).

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Условный репортерный аллель в сочетании с отслеживанием моносинаптических цепей. (a) Схема вектора наведения ROSA26-stop ^flox -tdTomato . Расщепление EcoRV использовали для идентификации положительных клонов с помощью саузерн-блоттинга с использованием радиоактивно меченного зонда в указанной области. (b) Слева, Саузерн-блот-анализ, показывающий положительно нацеленный клон, обозначенный дополнительной полосой 5,7 т.п.н., полученной введением дополнительного сайта EcoRV в нацеливающий вектор; справа — данные генотипирования ПЦР с использованием прямого (For) и обратного (Rev) праймеров, как указано в (а), выявляющие присутствие целевого нокаутного аллеля у гетерозиготных и гомозиготных мышей ROSA26-stop ^flox -tdTomato .+, дикий тип; tgt, нокаутный аллель. (c) Эксплантат кортикального среза мыши ROSA26-stop ^flox -tdTomato после электропорации конструкции rabies-G-IRES-TVA-IRES-Cre в боковой желудочек. Обратите внимание на высокий уровень однородной экспрессии tdTomato после введения Cre. (d) Экспрессия SADΔG-EGFP в том же срезе, показанном на (c), через три дня после применения RV. (e) Объединенное флуоресцентное изображение условной экспрессии tdTomato и SADΔG-EGFP, показанное на (c) и (d).Шкала шкалы 1 мм. (f – h) Увеличенное изображение транссинаптически маркированной кортикальной микросхемы. Масштабная линейка 10 мкм. (f) Условная экспрессия tdTomato в нейронах коры, которые получили конструкцию экспрессии G-IRES-TVA-IRES-Cre. (g) Экспрессия SADΔG-EGFP в локальной сети кортикальных клеток, транссинаптически меченных RV. (h) Объединенное изображение, показывающее первоначально инфицированную исходную клетку (желтый) и местных пресинаптических партнеров (зеленый). (i) Объединенное изображение широко распространенной экспрессии репортера в корковых слоях рекомбинированного и инфицированного эксплантата среза.Обратите внимание на обширную пресинаптическую маркировку (зеленый) от ограниченного числа исходных клеток (желтый). Стрелки обозначают меченые исходные клетки; L5, слой 5. Масштабная линейка 10 мкм. Анализ меченых клеток проводили на n = 24 срезах от 12 эмбрионов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Электропорация нацелена на постнатальные нейроны для стабильной интеграции плазмиды, но не на их предшественников стволовых клеток. (a) Стратегия маркировки для определения того, содержат ли гранулярные клетки, рожденные после электропорации (EP), стабильно интегрированную экспрессирующую конструкцию.Новорожденных мышей подвергали электропорации с помощью конструкции G-IRES-TVA-IRES-Cre и 14 дней спустя обрабатывали BrdU в воде клетки в течение дополнительных 14 дней, чтобы пометить все нейроны, рожденные после этого. Через 28 дней после электропорации мышам инъецировали SAD Δ G EGFP RV в обонятельную луковицу, а затем через 1 неделю обрабатывали для получения двойных изображений BrdU и EGFP. (b) Венечный срез обонятельной луковицы, показывающий маркировку BrdU. (c) Экспрессия SAD Δ G EGFP в срезе, показанном на (a). (d) Объединенное изображение (a) и (b).GL — гломерулярный слой; ЭПЛ, внешний плексиформный слой; MCL, слой митральных клеток; GCL, гранулированный клеточный слой. Масштабная линейка, 50 мкм. (e) График, показывающий отсутствие нейронов, меченных BrdU, экспрессирующих SAD Δ G EGFP, что указывает на то, что стабильная экспрессия G-IRES-TVA-IRES-Cre не распространяется в предшественниках стволовых клеток. ^* p <0,01, n = 3 луковицы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Экспрессия SADΔG-EGFP в пресинаптических входах в гранулярные клетки. (a) — (e) Срезы мозга мышей после внутрижелудочковой инъекции и электропорации с использованием Rabies-G-IRES-TVA и последующей инфекции в слое гранулярных клеток обонятельной луковицы через 30 дней с помощью SADΔG-EGFP RV. Такой подход обеспечивает селективную SADΔG-EGFP RV-инфекцию гранулярных клеток новорожденных. (а) Экспрессия вирусного вектора SADΔG-EGFP в нейронах переднего обонятельного ядра (AON), указывающая на моносинаптический перенос от инфицированных гранулярных клеток OB. Экспрессию tdTomato можно наблюдать в обонятельной луковице (OB).Вставка в рамке соответствует виду с большим увеличением, показанному на (c). Масштабная линейка 300 мкм. (б) Экспрессия вирусного вектора SADΔG-EGFP в ядре горизонтальной конечности нейронов ядра диагональной полосы (HDB) и грушевидной коры (PCTX). Левая вставка соответствует виду с большим увеличением, показанному на (d), тогда как правая вставка соответствует (e). Масштабная линейка, 350 мкм. (c) Экспрессия SADΔG-EGFP в нейронах AON. (d) Экспрессия SADΔG-EGFP в нейронах HDB. (e) Экспрессия SADΔG-EGFP в нейронах грушевидной коры.Масштабные линейки (c) — (e), 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Роботизированная система доставки запахов. (a) Изображение роботизированной системы, предназначенной для циклической принудительной подачи одоранта воздухом. Робот был запрограммирован на непрерывный цикл через несколько флаконов, содержащих соединения с летучим запахом, в течение 30 дней после электропорации. (b) Список летучих соединений запаха, которые неоднократно доставлялись мышам, предназначенным для моносинаптического отслеживания микросхем обонятельной луковицы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.s004

(TIF)

Рисунок S5.

Блокада синаптической активности не влияет на передачу вируса бешенства. (a) — (e) Моносинаптическое мечение в культивируемых срезах обонятельных луковиц, полученных от мышей, подвергнутых электропорации in vivo с плазмидой, кодирующей tdTomato, Rabies G и TVA, с последующим инфицированием in vitro с SAD Δ G-EGFP и лечение фармакологическими блокаторами синаптической активности.Во всех условиях среза гранулярные клетки, восприимчивые к инфекции RV, помечены красным, исходные гранулярные клетки помечены красным и зеленым (желтый, стрелки), а пресинаптические входные клетки помечены зеленым. (а) Контрольный срез без фармакологической обработки. Срезы, обработанные ботулотоксином (BoTX, 50 нМ) (b), столбнячным токсином (TeTN, 50 нМ) (c), тетродотоксином (TTX, 1 мкМ) (d) или 50 мкМ CNQX плюс 50 мкМ APV (e). Масштабная линейка 150 мкм. (f) График, суммирующий среднее количество пресинаптических входных клеток, наблюдаемых на каждую меченую гранульную исходную клетку.Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего для всех меченых пресинаптических входных клеток, подсчитанных в 6 срезах для каждого условия. Существенных различий по сравнению с контролем не наблюдалось.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029423.s005

(TIF)

Просеивание зрительной информации в верхнем холмике

Сводка приемки:

В документе показаны явные изменения в свойствах кодирования между входным и глубоким слоями верхнего холмика.Они особенно интересны в связи с потребностью животного сохранять информацию о соответствующих аспектах входных стимулов, отбрасывая другие. Подобные изменения в кодировании происходят во многих сенсорных цепях, и работа, подобная описанной в статье, может помочь в исследовании других цепей.

Письмо с решением после экспертной оценки:

Благодарим вас за отправку вашей статьи «Просеивание визуальной информации в верхних холмиках» на рассмотрение eLife .Ваша статья была рецензирована тремя рецензентами, включая Фреда Рике в качестве редактора-рецензента и рецензента №1, а оценку контролировал Джошуа Голд в качестве старшего редактора.

Рецензенты обсудили рецензии друг с другом, и редактор-рецензент подготовил это решение, чтобы помочь вам подготовить исправленную заявку. Хотя рецензенты с энтузиазмом отнеслись к заданным вопросам, некоторые проблемы ограничили энтузиазм и помешали провести полную оценку работы:

1) Ряд ключевых выводов в статье подтверждается данными из очень небольшого числа, в некоторых случаях отдельных ячеек.Конкретные примеры можно найти в отдельных обзорах, прилагаемых ниже. Рецензенты считали, что они не могут оценить значимость работы без такого популяционного анализа. К этому моменту каждый рецензент пришел независимо и подчеркнул в ходе консультаций с рецензентами.

2) Представленные популяционные анализы показывают существенное перекрытие между популяциями sSC и dSC. Текст представляет собой более дискретное описание этих данных и, как результат, неточно передает перекрытие в свойствах ответа между sSC и dSC нейронами.Важно, чтобы текст точно отражал степень сходства / различия в ответах sSC и dSC (и перекрытие популяционных анализов, таких как гистограммы на рисунках 2 и 4).

Все три рецензента согласились, что адекватное рассмотрение этих вопросов будет иметь важное значение для успешного пересмотра.

Рецензент № 1:

В этой статье исследуется, как представление визуальных входов изменяется, когда сигналы проходят через верхний холмик (SC). Акцент в статье делается на том, как развиваются три аспекта реакции на поведенческие стимулы: избирательность, позиционная инвариантность и привыкание.Изменения в кодирующих свойствах, аналогичные описанным здесь, происходят в других сенсорных цепях, и, следовательно, исследование этих изменений в SC, вероятно, обеспечит широкое понимание сенсорной обработки — точка, которая четко сформулирована в статье. Документ в целом в хорошем состоянии, но я чувствовал, что некоторые аспекты можно усилить:

Анализ населения.

Большинство основных положений документа хорошо подтверждены популяционным анализом. Такой анализ принесет пользу еще нескольким пунктам:

— пространственно-временной шум.Отсутствие ответов на шумовые стимулы в нейронах dSC по сравнению с нейронами sSC является дополнительным доказательством повышения избирательности. В настоящее время это показано для одного примера нейронов на рисунке 2. Можете ли вы добавить результаты популяции — например, от чего-то вроде скорости стрельбы до шумового стимула (возможно, нормированного на реакцию на расширяющееся темное пятно) в зависимости от глубины?

— передача сигналов SC без коры. На рис. 4 показан пример сохранения привыкания к нейрону SC, зарегистрированного у мыши, у которой отсутствует большая часть коры головного мозга.Можете ли вы проанализировать это во всех записанных ячейках? Сохраняются ли у этих мышей позиционная инвариантность и избирательность к надвигающемуся стимулу? Это подчеркнутый момент в статье, поэтому его следует изучить более подробно и предоставить информацию о популяциях клеток.

— Локальные датчики приближения. На рис. 6 — дополнение к рисунку 1 показан пример ячейки со свойствами, соответствующими локальным детекторам маяка, которые составляют основу предлагаемой модели. Модель предполагает, что таких ячеек много.Это единственный встреченный? Некоторое обсуждение требуемой плотности этих ячеек и зарегистрированного количества очень важно. Это особенно верно, потому что в статье приводятся доводы против некоторых альтернативных моделей, основанных на отсутствии необходимых типов клеток.

Описание ответов ганглиозных клеток сетчатки

В статье в нескольких местах утверждается, что зарегистрированные нейроны обладают свойствами, которые отличаются от свойств входов ганглиозных клеток сетчатки в SC (например, подраздел «Появление новых свойств ответа от поверхностных к глубоким слоям», последний абзац и подраздел «Рабочая модель для схема механизмов визуального просеивания », абзац первый).Было бы весьма полезно предоставить краткое изложение, в идеале в начале статьи, соответствующих свойств ответа RGC, чтобы можно было оценить / оценить отмеченные различия.

Модель.

Модель является хорошим дополнением к статье и дает четкий способ связать результаты с аналогичными свойствами кодирования в других сенсорных цепях. Однако я чувствовал, что альтернативные модели были отклонены слишком сильно (например, Введение, последний абзац; подраздел «Рабочая модель для схемных механизмов визуального просеивания», последний абзац; Обсуждение, первый абзац).Например, казалось бы возможным отменить ответ On предложенной схемы DS (например, используя сигналы от ячеек On DS). Точно так же предложенная тонически активная тормозная клетка, которая может обеспечить привыкание, отвергается, потому что ее не наблюдают (но, похоже, также наблюдается очень мало локальных детекторов маяка; см. Комментарий выше). Я бы предложил несколько менее решительно исключать эти модели (но я согласен с тем, что предлагаемая модель является наиболее вероятной из описанных).

Рецензент № 2:

Рукопись рассказывает интересную историю о различных визуальных реакциях на надвигающиеся темные стимулы в поверхностных и глубоких слоях верхнего холмика мыши.В нем описывается, что в dSC нейроны более избирательно активируются темными надвигающимися стимулами по сравнению с удаляющимися белыми стимулами, менее избирательны в отношении локализации стимула и более подавлены при повторной стимуляции даже в новых местах. Авторы представляют экономную трехуровневую сетевую модель, использующую синаптическую депрессию для объяснения депрессии, специфичной для местоположения. Газета очень удобна для чтения и представляет собой интересную историю. В целом, рукопись в некоторой степени страдает от того, что иногда даются только анекдотические свидетельства и различия в распределении представлены в виде черно-белых различий между sSC и dSC.

«Подавление не было постоянным». Показан только один пример. Пожалуйста, добавьте описание населения или статистику.

«Стимул в одном месте не подавил последующую реакцию.… (Рисунок 4C)». Для подтверждения этого утверждения показан только один пример нейрона. Пожалуйста, добавьте описание населения и статистику.

«Примечательно, что мутант продемонстрировал такое же длительное подавление…» Снова показан только один пример. Пожалуйста, добавьте количественную оценку и статистику.

«Опять же, в данных не наблюдалось». Опять же, показан только один пример, и на изображении действительно трудно наблюдать продолжающееся срабатывание базовой линии. Пожалуйста, добавьте количественную оценку, чтобы сделать это менее анекдотичным.

Рецензент № 3:

В рукописи представлены внеклеточные записи поверхностных и промежуточных / глубоких слоев SC у мышей с неподвижной головой в состоянии бодрствования, способных бегать по беговой дорожке и видеть либо мерцающий стимул в виде шахматной доски, либо один из нескольких визуальных паттернов (черные или белые приближающиеся или удаляющиеся стимулы и движущаяся черная точка).Вопрос в том, какова избирательность этих визуальных паттернов в SC и увеличивается ли эта избирательность в более глубоких слоях. Вопрос мотивирован поведенческими наблюдениями, полученными в этой и других лабораториях, о том, что врожденное защитное поведение может быть вызвано одними стимулами (например, надвигающимся черным диском), но не другими (например, удаляющимся белым диском).

Фундаментальное наблюдение состоит в том, что большинство визуальных паттернов, кажется, вызывают устойчивые ответы в поверхностном SC, но они не вызывают устойчивых ответов в более глубоких SC, за исключением начальных представлений черного надвигающегося диска.Вдобавок ответы на поверхностных слоях ограничены небольшими областями визуального пространства, но на более глубоких уровнях могут быть вызваны из больших областей визуального пространства. Авторы показывают, что в более глубоких SC ответы на черные вырисовывающиеся диски быстро привыкают, и что это привыкание является пространственно специфичным (таким образом, предположительно, на входе в эти более глубокие SC нейроны). Предлагается простая модель, чтобы связать эти наблюдения.

Бумага легко читается, а на рисунках данные представлены в доступной форме.Большинство представленных анализов выглядят уместными и хорошо выполненными. Однако представленный анализ не дает достаточного понимания и требует уточнения.

Основное утверждение состоит в том, что визуальная информация просеивается в холмике, причем более глубокие слои демонстрируют гораздо большую избирательность в отношении стимулов, которые могут иметь отношение к поведению (надвигающийся черный диск). Однако существует так мало анализа избирательности стимулов, что невозможно судить о правдивости утверждения. Единственное представленное количественное свидетельство, я думаю, — это сравнение реакции на белые удаляющиеся диски и черные приближающиеся диски на Рисунке 2C.Существует небольшая, хотя и значительная разница в распределениях в поверхностных и более глубоких слоях, но распределения полностью перекрываются. Этой статистической разницы в одном сравнении недостаточно, чтобы подтвердить утверждение о «просеивании». Необходим анализ всего пространства для ответов — и если различия остаются такими же незначительными, как на рис. 2C, тогда необходимо некоторое смягчение утверждений о наличии сильных различий в избирательности. В связи с этим, амплитуда ответа, по-видимому, существенно снижается в более глубоких слоях, и один из способов увеличения селективности — это если надвигающиеся черные диски будут более способны управлять ответами по всей SC, но нейроны в более глубоких слоях имеют более высокий порог для активация.

Второе утверждение состоит в том, что нейроны в более глубоких SC имеют гораздо большие области активации; это подтверждается красивым анализом на Рисунке 3, который показывает прогрессивное увеличение области активации черного вырисовывающегося стимула для нейронов в более глубоких слоях. Я хотел бы знать, было ли это специфичным для стимулов, нависающих над черным, или также для других стимулов — в тех нейронах, которые на них реагировали, но это потребовало бы значительного количества экспериментов и не является достижимой целью.

Третье утверждение состоит в том, что нейроны в более глубоких SC привыкают сильнее, чем в поверхностных SC. Рисунки 4B и D предполагают, что большинство нейронов как в поверхностных, так и в более глубоких слоях демонстрируют привыкание в течение времени <10 секунд, но что в среднем привыкание сильнее и длится дольше в более глубоких слоях. Возможно, самым приятным результатом здесь является пространственная специфика привыкания, наблюдаемая в более глубоких слоях, что подразумевает «восходящую» десенсибилизацию входных сигналов к этим нейронам. Расшифровка, представленная на Рисунке 5, потеряла меня здесь - текст вокруг десятого абзаца подраздела «Анализ» не особенно информативен, и я не уверен, как выводятся уровни вероятности, и как конкретный выбор анализа (который включает в себя пространственную репликацию). сдвинутые копии записанных нейронов) могут повлиять на результат, и даже на то, сколько нейронов в каждой области (поверхностной / глубокой) было в исходных 3 наборах данных.Этот раздел требует существенного пояснения.

[Примечание редакции: до принятия были предложены дальнейшие исправления, как описано ниже.]

Спасибо, что повторно отправили вашу статью «Просеивание визуальной информации в верхних холмиках» на рассмотрение eLife . Ваша отредактированная статья была рассмотрена тремя рецензентами, включая Фреда Рике в качестве редактора-рецензента и рецензента №1, а оценку контролировал Джошуа Голд в качестве старшего редактора.

Рецензенты обсудили рецензии друг с другом, и редактор-рецензент подготовил это решение, чтобы помочь вам подготовить исправленную заявку. Все рецензенты оценили исправления и посчитали, что они сделали статью значительно сильнее. Остается несколько существенных вопросов, о которых говорится в отдельных обзорах ниже.

Рецензент № 1:

Это повторное представление статьи, в которой сравнивается представление сенсорных стимулов в поверхностных и глубоких слоях верхнего холмика.Основная проблема оригинальной статьи заключалась в отсутствии данных о населении и соответствующих статистических тестов основных выводов. Эти вопросы в значительной степени рассмотрены, и документ намного сильнее. У меня есть еще несколько предложений для ясности изложения.

Рецензент № 2:

Авторы удовлетворительно ответили на все мои вопросы и предложения.

Однако в добавлении, сделанном в ответ на один из моих вопросов, была внесена небольшая ошибка.На новой панели рисунка 4C внизу справа с 30 клетками dSC упоминается, что ответы «нормализованы по ответу на первое испытание пурпурного следа». Это действительно кажется разумным. Однако первая точка на синей кривой — ровно 1 (не приблизительно, я проверял в Illustrator). Сделана ли здесь ошибка в нормализации или в описании, или она была настолько близка к 1, что округление поставило ее ровно на 1? В тексте нет цифр или статистики, поэтому у меня не было возможности проверить этот момент.

Рецензент № 3:

Пересмотр касается большинства вопросов, поднятых рецензентами, в том числе и мной. Бумага сильнее и представляет более убедительную историю. У меня остались вопросы.

1) Я ценю предоставление более описательных обзоров некоторых наборов данных. Однако в Резюме утверждается: «нейронные реакции становятся более избирательными в отношении поведенчески значимых стимулов»), а в начале Обсуждения — «возрастающая избирательность к поведенчески значимому вырисовывающемуся стимулу по сравнению с другими безобидными стимулами с аналогичными низкоуровневыми характеристиками (рис. 2) «) по-прежнему полагаются только на 2 сравнения активности (черный ткацкий станок vs.шахматная доска и черный ткацкий станок против отступающего белого). Еще 4 набора данных представлены для примеров нейронов на рисунке 2, но не анализируются далее. Ранее я предлагал провести полный анализ этого пространства ответов, что, по мнению авторов, невозможно в одном отчете. Но метрику отклика для этих наборов данных получить несложно, и я не могу понять, почему авторы не могут представить (возможно, в виде таблицы в дополнительных данных, сопровождающих рисунок 2) соответствующий многомерный анализ. В качестве альтернативы, текст можно изменить, чтобы прояснить, что утверждения основаны на сравнении популяций для двух стимулов, а также на шахматной доске.

2) Независимо от того, что думают авторы по поводу вышеизложенного, в отношении подраздела «Селективность стимула», я думаю, авторы выводят реакцию на шахматную доску из средней скорости по всей презентации стимула шахматной доски (т.е. несколько минут), в то время как ответ на стимул ткацкого станка — это количество шипов в первом предъявлении (то есть в первой секунде). Если я ошибаюсь, поясните. Если это не так, то, если реакции привыкают к шахматной доске, как к ткацкому станку, тогда это нечестное сравнение, и сопутствующий анализ с использованием тех же временных рамок для обоих стимулов был бы уместен.

3) Использование слова «новинка» в легенде на Рисунке 5 и в последнем абзаце подраздела «Привыкание к знакомым стимулам» остается неясным для читателя, и необходимо внести ясность в основной текст, что новизна здесь означает новое. Место не новой формы. Это нетривиальное различие.