Водяная топливная ячейка Мейера — схема, возможность сделать своими руками

«Топливная ячейка» и «Машина на воде» Стэнли Мейера

Как и о всякой технологии, способной перевернуть мир, о ячейке Стэнли Мейера (или водном топливном элементе) говорят до сих пор. Одни уверяют о ней почти как о вечном двигателе, другие утверждают, что это мошенничество чистой воды. Кое кто даже пророчил создателю этого чуда Нобелевскую премию. А ряд судебных разбирательств и таинственная смерть Мейера только подлили масло в огонь сомнений.

Стэнли Мейер со своим багги

Так что же на самом деле изобрел Стэнли Мейер? Известно следующее: в 1980 году американским изобретателем Стэнли Алленом Мейером для показа публике и журналистам был представлен легкий вездеход – багги. Казалось бы, обычное дело, но его багги ездил не на бензине, а на воде. Причем эффективность двигателя была такова, что на четыре с лишним тысячи км (от Нью-Йорка до Лос-Анджелеса) потребовалось бы всего восемьдесят три литра воды.

Двигатель от водного автомобиля Стэнли Мейера. За основу был взят обыкновенный двигатель Volkswagen

Конечно, целиком конструкцию супердвигателя изобретатель не разглашал. Первоначально Мейер говорил о водных инжекторах вместо свечей, которые и позволяли получать энергию из вода. Затем, неохотно, поведал о созданной им водной ячейке – главном компоненте двигателя. Ячейка позволяла получать водород и кислород из воды, и использовать водород как топливо.

Схема из патента Мейера

И, хотя многие сразу стали говорить про «изобретение» Стэнли Мейером давно и хорошо известного электролизера, устройству Мейера требовалось гораздо меньше энергии для расщепления воды. Фактически его устройство могло само обеспечивать себя энергией – только подливай воду. Не обращая внимания на критику оппонентов, Стэнли Мейер запатентовал свое изобретение и стал искать инвестиции, для дальнейших разработок. И нашел их!

Интервью Стэнли Мейера (можно найти в Интернете)

Слухи и недосказанность вокруг изобретения «водных топливных ячеек» изобретатель поддерживал тем, что не разрешал испытания и исследования их независимыми инспекторами и техниками, мотивируя о том, что все экспертизы пройдены на этапе патентования. Именно поэтому загадка «ячеек» так и осталась загадкой.

В 1996 году два инвестора Мейера подали на него в суд Огайо, который изобретатель проиграл. И чудо-багги и «топливная ячейка» были признаны фальшивками. Принципом получения водорода был признан в разрушении полярных связей в молекуле воды с помощью СВЧ-излучения. Но Стэнли продолжал работать до 1998 года, когда его смерть снова не всколыхнула американские газеты.

Официально – он умер от церебральной аневризмы. Но брат изобретателя рассказал другую историю. «Во время ужина с инвесторами из Бельгии, Стэнли сделал глоток клюквенного сока. Затем он схватил его за шею, выскочил из двери, упал на колени и его вырвало. Я выбежал на улицу и спросил его: «Что случилось?» Он сказал: «Они отравили меня». Это было его последним заявлением.

Хотя остались чертежи и патент Мейера, пока никто достоверно не смог повторить его работу… Или смог, но не хочет делиться этим с миром.

О водородной ячейке Мейера

Если вы сделали и испытали вышеописанную конструкцию, то по горению пламени на конце иглы наверняка заметили, что производительность установки чрезвычайно низкая. Чтобы получить больше гремучего газа, нужно изготовить более серьезное устройство, называемое ячейкой Стэнли Мейера в честь изобретателя.

Принцип действия ячейки тоже основан на электролизе, только анод и катод выполнены в виде трубок, вставляющихся одна в другую. Напряжение подается от генератора импульсов через две резонансные катушки, что позволяет снизить потребляемый ток и увеличить производительность водородного генератора. Электронная схема устройства представлена на рисунке:

Для изготовления ячейки Мейера потребуется:

• цилиндрический корпус из пластмассы или оргстекла, умельцы нередко используют водопроводный фильтр с крышкой и патрубками;
• трубки из нержавеющей стали диаметром 15 и 20 мм длиной 97 мм;
• провода, изоляторы.

Нержавеющие трубки крепятся к основанию из диэлектрика, к ним припаиваются провода, подключаемые к генератору. Ячейка состоит из 9 или 11 трубок, помещенных в пластиковый либо плексигласовый корпус, как показано на фото.

Под ячейку Мейера можно приспособить готовый пластиковый корпус от обычного водопроводного фильтра

Соединение элементов производится по всем известной в интернете схеме, куда входит электронный блок, ячейка Мейера и гидрозатвор (техническое название – бабблер). В целях безопасности система снабжена датчиками критического давления и уровня воды. По отзывам домашних умельцев, подобная водородная установка потребляет ток порядка 1 ампера при напряжении 12 В и обладает достаточной производительностью, хотя точные цифры отсутствуют.

Принципиальная схема включения электролизера

Схема водяной топливной ячейки Мейера

Экология познания. Наука и техника: Ячейка Мейера – устройство, расходующее малое количество электрической энергии, и производящее из обыкновенной воды большое количество водородно-кислородной смеси (газ Брауна).

Очевидно, что изобретатель из США Стэнли Мэйер разработал электрическую ячейку, которая позволяет разделять обыкновенную водопроводную воду на водород и кислород с гораздо меньшей затратой энергии, чем требуется при обычном электролизе.

Демонстрации проводились и прежде профессором Michael Laughton, Dean из Engineering при Колледже Королевы Mary, Лондон, Адмирал Сэр Anthony Griffin, бывший командующий британским Флотом, и Д-ром Keith Hindley, английским химиком-исследователем. Ячейка Мэйер, сделанная дома изобретателем в Grove City, Огайо, производила гораздо больше водородо-кислородной смеси, чем могло ожидаться при простом электролизе.
В то время как обычный элекролиз воды требует тока, измеряемого в амперах, ячейка Мэйер производит тот же эффект при милиамперах. Более того, обыкновенная водопроводная вода требует добавления электролита, например, серной кислоты, для увеличения проводимости; ячейка Мэйер действует при огромной производительности с чистой водой.
Согласно очевидцам, самым поразительным аспектом клетки Мэйер было то, что она оставалась холодной даже после часов производства газа.
Эксперименты Мэйера, которые он счел возможными представить к патентованию, заслужили серию патентов США, представленные под Секцией 101. Представление патента под этой секцией зависит от успешной демонстрации изобретения Патентному Рецензионному Комитету.
Клетка Мэйера имеет много общего с электролитической ячейкой, за исключением того, что она работает при высоком потенциале и низком токе лучше, чем другие методы. Конструкция проста. Электроды — отсылаем заинтересовавшихся к Мэйеру — сделаны из параллельных пластин нержавеющей стали, образующие либо плоскую, либо концентрическую конструкцию. Выход газа зависит обратно пропорционально расстоянию между ними; предлагаемое патентом расстояние 1.5 мм дает хороший результат.
Значительные отличия заключаются в питании ячейки. Мэйер использует внешнюю индуктивность, которая образует колебательный контур с емкостью ячейки, — чистая вода, по-видимому, обладает диэлектрической проницаемостью около 81, — чтобы создать параллельную резонансную схему. Она возбуждается мощным импульсным генератором, который вместе с емкостью ячейки и выпрямительным диодом составляет схему накачки. Высокая частота импульсов производит ступенчато поднимающийся потенциал на электродах ячейки до тех пор, пока не достигаеся точка, где молекула воды распадается и возникает кратковременный импульс тока. Схема измерения тока питания выявляет этот скачок и запирает источник импульсов на несколько циклов, позволяя воде восстановиться.
Химик-исследователь Keith Hindley предлагает следующее описание демонстрации ячейки Мэйера: «После дня презентаций, Griffin комитет засвидетельствовал ряд важных свойств WFC (водяная топливная ячейка, как назвал ее изобретатель).

Группа очевидцев независимых научных наблюдателей Великобритании свидетельствовала что американский изобретатель, Стэнли Мэйер, успешно разлагает обыкновенную водопроводную воду на составляющие элементы посредством комбинации высоковольтных импульсов, при среднем потреблении тока, измеряемого всего лишь милиамперами. Зафиксированный выход газа был достаточным, чтобы показать водородно-кислородное пламя, которое мгновенно плавило сталь.

По сравнению с обычным сильноточным электролизом, очевидцы констатировали отсутствие какого-либо нагревания ячейки. Мэйер отказался прокомменировать подробности, которые бы позволили ученым воспроизвести и оценить его «водяную ячейку». Однако, он представил достаточно детальное описание американскому Патентному Бюро, чтобы убедить их, что он может обосновать его заявку на изобретение.
Одна демонстрационная ячейка была снабжена двумя параллельными электродами возбуждения. После наполнения водопроводной водой, электроды генерировали газ при очень низких уровнях тока — не больше, чем десятые доли ампера, и даже милиамперы, как заявляет Мэйер, — выход газа увеличивался, когда элекроды сдвигались более близко, и уменьшался, когда они отодвигались. Потенциал в импульсе достигал десятков тысяч вольт.
Вторая ячейка содержала 9 ячеек с двойными трубками из нержавеющей стали и производила намного больше газа. Была сделана серия фотографий, показывающая производство газа при миллиамперном уровне. Когда напряжение было доведено до предельного, газ выходил в очень впечатляющем количестве.
«Мы обратили внимание, что вода вверху ячейки медленно стала окрашиваться от бледно-кремового до темно-коричневого цвета, мы почти уверены в влиянии хлора в сильно хлорированной водопроводной воде на трубки из нержавеющей стали, использованные для возбуждения».
Он продемонстрировал производство газа при уровнях милиампер и киловольт.
«Самое замечательное наблюдение — это то, что WFC и все его металлические трубки остались совершенно холодные на ощупь, даже после более чем 20 минут работы. «Раскалывающий молекулы» механизм развивает исключительно мало тепла по сравнению с элекролизом, где элекролит нагревается быстро.»

Результат позволяет рассмотреть эффективное и управляемое производство газа, которое быстро возникает, и безопасно в функционировании. Мы ясно увидели, как увеличение и уменьшение потенциала используется, чтобы управлять производством газа. Мы увидели, как поток газа прекращался и начинался вновь, соответственно когда напряжение на входе было выключено и вновь включено.»
«После часов обсуждения между собой, мы заключили, что Steve Мэйер явился, чтобы изобрести совершенно новый метод для разложения воды, которая обнаруживала некоторые черты классического электролиза. Это подтверждается тем, что его устройства, реально работающие, взятые из его коллекции, удостоверены американскими патентами на разные части WFC системы. Так как они были представлены под Секцией 101 Патентным Бюро США, аппаратура, включенная в патентах, проверена экспериментально экспертами американского Патентного Бюро, их вторыми экспертами и все заявления были установлены.
» Основной WFC подвергался трехлетнему испытанию. Это подняло предоставленные патенты до уровня независимого, критического, научного и инженерного подтверждения того, что устройства фактически работают, как описано.»
Практическая демонстрация ячейки Мэйер’а является существенно более убедительной, чем псевдо-научный жаргон, который использован для объяснения. Изобретатель лично говорил об искажении и поляризации молекулы воды, приводящему к самостоятельному разрыву связи под действием градиента электрического поля, резонанса в пределах молекулы, который усиливает эффект.
Не считая обильного выделения кислорода и водорода и минимального нагревания ячейки, очевидцы также сообщают, что вода в внутри ячейки исчезает быстро, переходя в ее составные части в виде аэрозоли из огромного количества крошечных пузырей, покрывающих поверхность ячейки.
Мэйер заявил, что у него работает конвертер водородно-кислородной смеси в течение последних 4 лет, использующий цепочку из 6 цилиндрических ячеек. Он также заявил, что фотонное стимулирование пространства реактора светом лазера посредством оптоволокна увеличивает производство газа.

Дополнительные данные по водородной ячейке Мейера. Подключение.

Как упоминалось ранее, абсолютно очевидно принять все возможные меры предосторожности. «Гидрокси» газ производимый ячейкой – это смесь водорода и кислорода, смешанных в идеальной пропорции для рекомбинации в воду. Скорость фронта горения смеси в 1000 раз выше, чем скорость фронта горения паров бензина. Стандартные устройства часто просто не работают. Самое лучшее устройство защиты – бабблер (водный затвор). Он прост, легок в изготовлении и обслуживании. Высота водного столба е менее 150мм.

В идеале бабблер должен иметь плотно закрывающуюся крышку, если газ внутри загорится ее должно мгновенно сорвать. Некоторые люди между бабблером и кейсом ставят специальный вентиль – отсекатель, предотвращающий попадание большого давления обратно в ячейку.

Если вы намереваетесь использовать с двигателем внутреннего сгорания, тщательно отрегулируйте зажигание (Смотрите дополнительный материал).

Электронная схема для насоса не критична. Подойдет любая, которая включает насос , когда вода не достигает датчика и выключает когда достигает .

Вполне подойдет данная схема:

Если вы хотите использовать установку для отопления или приготовления пищи, имеется проблема. Водород горит с температурой, которую не выдерживает ни один металл. Стэн Мэйер решил эту проблему и запатентовал решение. Данное описание поможет вам преодолеть эти трудности:

Газ 72 попадает в горелку через вентиль 35. Горящий газ поднимается по вертикальной трубе 63 и затягивает за собой наружный воздух через отверстия 70 и 13, которые имеют скользящую крышку для контроля подачи. В чашке 40 собирается некоторое количество сгоревшего газа и возвращается назад через трубу 45 и смешивается с горящими газами в колонке горения. Регулировка подачи сгоревшего газа – вентиль 42. Большое количество сгоревшего газа (водяного пара) подается назад, что понижает температуру горения. Электрическое зажигание 20 упрощает розжиг.

Настройка ячейки.

Выключите первый генератор 555. Отрегулируйте частоту второго генератора по максимальному выходу газа. Дэйв Лоутон нашел, что на его ячейке Мэйера резонансные точки были около 3кГц и 6кГц.

Включите первый генератор 555. Отрегулируйте по максимальному выходу газа. Регулировку производимого объема газа можно регулировать широтой импульса.

Схема превышает максимум эффективности по Фарадею на 300%. Дальнейшие эксперименты показали, что индукторы, используемые Стэнли Мэйером играют важную роль в дальнейшем повышении эффективности. Дэйв Лоутон предложил добавить два индуктора по 100 витков эмалированного медного провода 22 SWG (21 AWG) (это диаметр примерно 0.6- 0.7мм) на ферритовом стержне диаметром 9 мм и длиной 25мм. Улучшенная схема:

Ферритовый стержень тот же (диаметр 9мм, длина 25мм.), провод тоже. Намотка бифилярная. Использовать ферритовое кольцо – наилучшее возможное решение. Трансформатор с бифилярной намоткой также может быть намотан на любой ферритовый стержень любого диаметра и длины (по обновленным данным).

Дальнейшее развитие системы:

Когда мы производим гидрокси газ из воды, невозможно превысить Фарадеевский максимум без притока дополнительной энергии извне. Поскольку ячейка остается холодной, имеется большой объем производимого газа, что указывает на наличие этого эффекта. Сама идея захвата энергии из окружающего пространства базируется на очень коротком импульсе с идеальной, очень крутой характеристикой подъема и спада формы импульса. Эта дополнительная энергия называется «холодным электричеством», поскольку имеет характеристики отличные от обычного электричества. При прохождении через проводник последний нагревается и на нем «теряется» часть энергии в виде тепла. У холодного электричества противоположный эффект: проводник охлаждается в результате притока энергии извне. Ниже дано дальнейшее улучшение схемы. Заметьте, лампочка 12 вольт 10 Ватт ярко светится, ток потребления остался прежним, выход гидрокси не уменьшился!

Диоды Зенера 150 Вольт 10 Ватт- защита транзистора от пробоя на случай короткого замыкания

Преимущества газа Брауна как источника энергии

• Вода, из которой получают HHO, является одним из наиболее распространённых веществ на нашей планете.
• При сгорании этого вида топлива образуется водяной пар, который можно обратно конденсировать в жидкость и повторно использовать в качестве сырья.
• В процессе сжигания гремучего газа не образуется никаких побочных продуктов, кроме воды. Можно сказать, что нет более экологичного вида топлива, чем газ Брауна.
• При эксплуатации водородной отопительной установки выделяется водяной пар в количестве, достаточном для поддержания влажности в помещении на комфортном уровне.

Область применения

Сегодня электролизёр — такое же привычное устройство, как и генератор ацетилена или плазменный резак. Изначально водородные генераторы использовались сварщиками, поскольку носить за собой установку весом всего несколько килограмм было намного проще, чем перемещать огромные кислородные и ацетиленовые баллоны. При этом высокая энергоёмкость агрегатов решающего значения не имела — всё определяло удобство и практичность. В последние годы применение газа Брауна вышло за рамки привычных понятий о водороде, как топливе для газосварочных аппаратов. В перспективе возможности технологии очень широки, поскольку использование HHO имеет массу достоинств.

• Сокращение расхода горючего на автотранспорте. Существующие автомобильные генераторы водорода позволяют использовать HHO как добавку к традиционному бензину, дизелю или газу. За счёт более полного сгорания топливной смеси можно добиться 20 – 25 % снижения потребления углеводородов.
• Экономия топлива на тепловых электростанциях, использующих газ, уголь или мазут.
• Снижение токсичности и повышение эффективности старых котельных.
• Многократное снижение стоимости отопления жилых домов за счёт полной или частичной замены традиционных видов топлива газом Брауна.
• Использование портативных установок получения HHO для бытовых нужд — приготовления пищи, получения тёплой воды и т. д.
• Разработка принципиально новых, мощных и экологичных силовых установок.

Генератор водорода, построенный с использованием «Технологии водяных топливных ячеек» С. Мейера (а именно так назывался его трактат) можно купить — их изготовлением занимается множество компаний в США, Китае, Болгарии и других странах. Мы же предлагаем изготовить водородный генератор самостоятельно.

Инструкция: как сделать водородный генератор своими руками

Для изготовления топливной ячейки возьмём наиболее совершенную «сухую» схему электролизёра с использованием электродов в виде пластин из нержавеющей стали. Представленная ниже инструкция демонстрирует процесс создания водородного генератора от «А» до «Я», поэтому лучше придерживаться очерёдности действий.

Схема топливной ячейки «сухого» типа

1. Изготовление корпуса топливной ячейки. В качестве боковых стенок каркаса выступают пластины оргалита или оргстекла, нарезанные по размеру будущего генератора. Надо понимать, что размер аппарата напрямую влияет на его производительность, однако, и затраты на получение HHO будут выше. Для изготовления топливной ячейки оптимальными будут габариты устройства от 150х150 мм до 250х250 мм.
2. В каждой из пластин просверливают отверстие под входной (выходной) штуцер для воды. Кроме того, потребуется сверление в боковой стенке для выхода газа и четыре отверстия по углам для соединения элементов реактора между собой.
3. Воспользовавшись угловой шлифовальной машиной, из листа нержавеющей стали марки 316L вырезают пластины электродов. Их размеры должны быть меньше габаритов боковых стенок на 10 – 20 мм. Кроме того, изготавливая каждую деталь, необходимо оставлять небольшую контактную площадку в одном из углов. Это понадобится для соединения отрицательных и положительных электродов в группы перед их подключением к питающему напряжению.
4. Для того чтобы получать достаточное количество HHO, нержавейку надо обработать мелкой наждачной бумагой с обеих сторон.
5. В каждой из пластин сверлят два отверстия: сверлом диаметром 6 — 7 мм — для подачи воды в пространство между электродами и толщиной 8 — 10 мм — для отвода газа Брауна. Точки сверлений рассчитывают с учётом мест установки соответствующих подводящих и выходного патрубков.
6. Начинают сборку генератора. Для этого в оргалитовые стенки устанавливают штуцеры подачи воды и отбора газа. Места их присоединений тщательно герметизируют при помощи автомобильного или сантехнического герметика.
7. После этого в одну из прозрачных корпусных деталей устанавливают шпильки, после чего начинают укладку электродов.
   

   Обратите внимание: плоскость пластинчатых электродов должна быть ровной, иначе элементы с разноимёнными зарядами будут касаться, вызывая короткое замыкание!

8. Пластины нержавеющей стали отделяют от боковых поверхностей реактора при помощи уплотнительных колец, которые можно сделать из силикона, паронита или другого материала. Важно только, чтобы его толщина не превышала 1 мм. Такие же детали используют в качестве дистанционных прокладок между пластинами. В процессе укладки следят, чтобы контактные площадки отрицательных и положительных электродов были сгруппированы в разных сторонах генератора.
9. После укладки последней пластины устанавливают уплотнительное кольцо, после чего генератор закрывают второй оргалитовой стенкой, а саму конструкцию скрепляют при помощи шайб и гаек. Выполняя эту работу, обязательно следят за равномерностью затяжки и отсутствием перекосов между пластинами.

    При финальной затяжке обязательно контролируют параллельность боковых стенок. Это позволит избежать перекосов

10. При помощи полиэтиленовых шлангов генератор подключают к ёмкости с водой и бабблеру.
11. Контактные площадки электродов соединяют между собой любым способом, после чего к ним подключают провода питания.

     Собрав несколько топливных ячеек и включив их параллельно, можно получить достаточное количество газа Брауна

12. На топливную ячейку подают напряжение от ШИМ-генератора, после чего производят настройку и регулировку аппарата по максимальному выходу газа HHO.

Для получения газа Брауна в количестве, достаточном для отопления или приготовления пищи, устанавливают несколько генераторов водорода, работающих параллельно.

Краткая теоретическая часть

Водород, он же hydrogen, – первый элемент таблицы Менделеева – представляет собой легчайшее газообразное вещество, обладающее высокой химической активностью. При окислении (то бишь, горении) выделяет огромное количество теплоты, образуя обычную воду. Охарактеризуем свойства элемента, оформив их в виде тезисов:

1. Горение водорода – процесс экологически чистый, никаких вредных веществ не выделяется.
2. Благодаря химической активности газ в свободном виде на Земле не встречается. Зато в составе воды его запасы неиссякаемы.
3. Элемент добывается в промышленном производстве химическим способом, например, в процессе газификации (пиролиза) каменного угля. Зачастую является побочным продуктом.
4. Другой способ получения газообразного водорода – электролиз воды в присутствии катализаторов – платины и прочих дорогих сплавов.
5. Простая смесь газов hydrogen + oxygen (кислород) взрывается от малейшей искры, моментально высвобождая большое количество энергии.

Для справки. Ученые, впервые разделившие молекулу воды на hydrogen и oxygen, назвали смесь гремучим газом из-за склонности к взрыву. Впоследствии она получила название газа Брауна (по фамилии изобретателя) и стала обозначаться гипотетической формулой ННО.

Раньше водородом наполняли баллоны дирижаблей, которые нередко взрывались

Из вышесказанного напрашивается следующий вывод: 2 атома водорода легко соединяются с 1 атомом кислорода, а вот расстаются весьма неохотно. Химическая реакция окисления протекает с прямым выделением тепловой энергии в соответствии с формулой:

2H₂ + O₂ → 2H₂O + Q (энергия)

Здесь кроется важный момент, который пригодится нам в дальнейшем разборе полетов: hydrogen вступает в реакцию самопроизвольно от возгорания, а теплота выделяется напрямую. Чтобы разделить молекулу воды, энергию придется затратить:

2H₂O → 2H₂ + O₂ — Q

Это формула электролитической реакции, характеризующая процесс расщепления воды путем подведения электричества. Как это реализовать на практике и сделать генератор водорода своими руками, рассмотрим далее.

Создание опытного образца

Чтобы вы поняли, с чем имеете дело, для начала предлагаем собрать простейший генератор по производству водорода с минимальными затратами. Конструкция самодельной установки изображена на схеме.

Из чего состоит примитивный электролизер:

• реактор – стеклянная либо пластиковая емкость с толстыми стенками;
• металлические электроды, погружаемые в реактор с водой и подключенные к источнику электропитания;
• второй резервуар играет роль водяного затвора;
• трубки для отвода газа HHO.

Важный момент. Электролитическая водородная установка работает только от постоянного тока. Поэтому в качестве источника питания применяйте сетевой адаптер, автомобильное зарядное устройство или аккумулятор. Электрогенератор переменного тока не подойдет.

Принцип работы электролизера следующий:

1. К двум электродам, погруженным в воду, подводится напряжение, желательно от регулируемого источника. Для улучшения реакции в емкость добавляется немного щелочи либо кислоты (в домашних условиях – обычной соли).
2. В результате реакции электролиза со стороны катода, подключенного к «минусовой» клемме, станет выделяться водород, а возле анода – кислород.
3. Смешиваясь, оба газа по трубке поступают в гидрозатвор, выполняющий 2 функции: отделение водяного пара и недопущение вспышки в реакторе.
4. Из второй емкости гремучий газ ННО подается на горелку, где сжигается с образованием воды.

Чтобы своими руками сделать показанную на схеме конструкцию генератора, потребуется 2 стеклянных бутылки с широкими горлышками и крышками, медицинская капельница и 2 десятка саморезов. Полный набор материалов продемонстрирован на фото.

Из специальных инструментов потребуется клеевой пистолет для герметизации пластиковых крышек. Порядок изготовления простой:

1. Плоские деревянные палочки скрутите саморезами, располагая их концами в разные стороны. Спаяйте головки шурупов между собой и подсоедините провода – получите будущие электроды.
2. Проделайте отверстие в крышке, просуньте туда разрезанный корпус капельницы и провода, затем герметизируйте с 2 сторон клеевым пистолетом.
3. Поместите электроды в бутылку и завинтите крышку.
4. Во второй крышке просверлите 2 отверстия, вставьте трубки капельниц и накрутите на бутылку, заполненную обычной водой.

Для запуска генератора водорода налейте в реактор подсоленную воду и включите источник питания. Начало реакции ознаменуется появлением пузырьков газа в обеих емкостях. Отрегулируйте напряжение до оптимального значения и подожгите газ Брауна, выходящий из иглы капельницы.

Второй важный момент. Слишком высокое напряжение подавать нельзя — электролит, нагревшийся до 65 °С и более, начнет интенсивно испаряться. Из-за большого количества водяного пара разжечь горелку не удастся. Подробности сборки и запуска импровизированного водородного генератора смотрите на видео:

Проектирование водородного генератора: схемы и чертежи

Самодельная установка для получения газа Брауна состоит из реактора с установленными электродами, ШИМ-генератора для их питания, водяного затвора и соединительных проводов и шлангов. В настоящее время существует несколько схем электролизёров, использующих в качестве электродов пластины или трубки. Кроме того, в Сети можно найти и установку так называемого сухого электролиза. В отличие от традиционной конструкции, в таком аппарате не пластины устанавливаются в ёмкость с водой, а жидкость подаётся в зазор между плоскими электродами. Отказ от традиционной схемы позволяет значительно уменьшить габариты топливной ячейки.

В работе можно использовать чертежи и схемы рабочих электролизёров, которые можно адаптировать под собственные условия.

Выбор материалов для строительства генератора водорода

Для изготовления топливной ячейки практически никаких специфичных материалов не требуется. Единственное, с чем могут возникнуть сложности, так это электроды. Итак, что надо подготовить перед началом работы.

1. Если выбранная вами конструкция представляет собой генератор «мокрого» типа, то понадобится герметичная ёмкость для воды, которая одновременно будет служить и корпусом реактора. Можно взять любой подходящий контейнер, главное требование — достаточная прочность и газонепроницаемость. Разумеется, при использовании в качестве электродов металлических пластин лучше использовать прямоугольную конструкцию, к примеру, тщательно загерметизированный корпус от автомобильного аккумулятора старого образца (чёрного цвета). Если же для получения HHO будут применяться трубки, то подойдёт и вместительная ёмкость от бытового фильтра для очистки воды. Самым же лучшим вариантом будет изготовление корпуса генератора из нержавеющей стали, например, марки 304 SSL.

   При выборе «сухой» топливной ячейки понадобится лист оргстекла или другого прозрачного пластика толщиной до 10 мм и уплотнительные кольца из технического силикона.

2. Трубки или пластины из «нержавейки». Конечно, можно взять и обычный «чёрный» металл, однако в процессе работы электролизёра простое углеродистое железо быстро корродирует и электроды придётся часто менять. Применение же высокоуглеродистого металла, легированного хромом, даст генератору возможность работать длительное время. Умельцы, занимающиеся вопросом изготовления топливных ячеек, длительное время занимались подбором материала для электродов и остановились на нержавеющей стали марки 316 L. К слову, если в конструкции будут использоваться трубки из этого сплава, то их диаметр надо подобрать таким образом, чтобы при установке одной детали в другую между ними был зазор не более 1 мм. Для перфекционистов приводим точные размеры:
   — диаметр внешней трубки — 25.317 мм;
   — диаметр внутренней трубки зависит от толщины внешней. В любом случае он должен обеспечивать зазор между этими элементами равный 0.67 мм.

    От того, насколько точно будут подобраны параметры деталей водородного генератора, зависит его производительность

3. ШИМ-генератор. Правильно собранная электрическая схема позволит в нужных пределах регулировать частоту тока, а это напрямую связано с возникновением резонансных явлений. Другими словами, чтобы началось выделение водорода, надо будет подобрать параметры питающего напряжения, поэтому сборке ШИМ-генератора уделяют особое внимание. Если вы хорошо знакомы с паяльником и сможете отличить транзистор от диода, то электрическую часть можно изготовить самостоятельно. В противном случае можно обратиться к знакомому электронщику или заказать изготовление импульсного источника питания в мастерской по ремонту электронных устройств.
   

   Импульсный блок питания, предназначенный для подключения к топливной ячейке, можно купить в Сети. Их изготовлением занимаются небольшие частные компании в нашей стране и за рубежом.

4. Электрические провода для подключения. Достаточно будет проводников сечением 2 кв. мм.
5. Бабблер. Этим причудливым названием умельцы обозвали самый обычный водяной затвор. Для него можно использовать любую герметичную ёмкость. В идеале она должна быть оборудована плотно закрывающейся крышкой, которая при возгорании газа внутри будет мгновенно сорвана. Кроме того, рекомендуется между электролизёром и бабблером устанавливать отсекатель, который будет препятствовать возвращению HHO в ячейку.
6. Шланги и фитинги. Для подключения генератора HHO понадобятся прозрачная пластиковая трубка, подводящий и отводящий фитинг и хомуты.
7. Гайки, болты и шпильки. Они понадобятся для крепления частей электролизёра между собой.
8. Катализатор реакции. Для того чтобы процесс образования HHO шёл интенсивнее, в реактор добавляют гидроксид калия KOH. Это вещество можно без проблем купить в Сети. На первое время будет достаточно не более 1 кг порошка.
9. Автомобильный силикон или другой герметик.

Заметим, что полированные трубки использовать не рекомендуется. Наоборот, специалисты рекомендуют обработать детали наждачной бумагой для получения матовой поверхности. В дальнейшем это будет способствовать увеличению производительности установки.

Инструменты, которые потребуются в процессе работы

Прежде чем приступить к постройке топливной ячейки, подготовьте такие инструменты:

• ножовку по металлу;
• дрель с набором свёрл;
• набор гаечных ключей;
• плоская и шлицевая отвёртки;
• угловая шлифмашина («болгарка») с установленным кругом для резки металла;
• мультиметр и расходомер;
• линейка;
• маркер.

Кроме того, если вы будете самостоятельно заниматься постройкой ШИМ-генератора, то для его наладки потребуется осциллограф и частотомер. В рамках данной статьи мы этот вопрос поднимать не будем, поскольку изготовление и настройка импульсного блока питания лучше всего рассматривается специалистами на профильных форумах.

Реактор из пластин

Высокопроизводительный генератор водорода, способный обеспечить работу газовой горелки, выполняется из нержавеющих пластин размером 15 х 10 см, количество – от 30 до 70 шт. В них просверливаются отверстия под стягивающие шпильки, а в углу выпиливается клемма для присоединения провода.

Кроме листовой нержавейки марки 316 понадобится купить:

• резина толщиной 4 мм, стойкая к воздействию щелочи;
• концевые пластины из оргстекла либо текстолита;
• шпильки стяжные М10—14;
• обратный клапан для газосварочного аппарата;
• фильтр водяной под гидрозатвор;
• трубы соединительные из гофрированной нержавейки;
• гидроокись калия в виде порошка.

Пластины нужно собрать в единый блок, изолировав друг от друга резиновыми прокладками с вырезанной серединой, как показано на чертеже. Получившийся реактор плотно стянуть шпильками и подключить к патрубкам с электролитом. Последний поступает из отдельной емкости, снабженной крышкой и запорной арматурой.

Примечание. Мы рассказываем, как сделать электролизер проточного (сухого) типа. Реактор с погружными пластинами изготовить проще – резиновые прокладки ставить не нужно, а собранный блок опускается в герметичную емкость с электролитом.

Схема водородной установки мокрого типа

Последующая сборка генератора, производящего водород, выполняется по той же схеме, но с отличиями:

1. На корпусе аппарата крепится резервуар для приготовления электролита. Последний представляет собой 7—15% раствор гидроокиси калия в воде.
2. В «бабблер» вместо воды заливается так называемый раскислитель – ацетон либо неорганический растворитель.
3. Перед горелкой обязательно ставится обратный клапан, иначе при плавном выключении водородной горелки обратный удар разорвет шланги и «бабблер».

Для питания реактора проще всего задействовать сварочный инвертор, электронные схемы собирать не нужно. Как устроен самодельный генератор газа Брауна, расскажет домашний мастер в своем видео:

Почему ячейку Мэйера сделал только он сам, а другие не смогли?

Начнём с того, что существует версия, которая не вызовет ни у кого её отрицания. В мире есть «очень маленькая» кучка людей с «очень огромными» возможностями, это – нефтяные магнаты – владельцы мировых запасов топлива. Им бы очень не хотелось терять свои миллиарды миллиардов, которые они практически «на халяву» кладут к себе в карман выкачивая «кровь Земли». Фактически они живут за счёт всего человечества. Это Вы и я исправно платим им большие деньги, заправляя свой автомобиль, за то, что по сути им не должно принадлежать. И для того, чтобы этот процесс наполнения карманов не останавливался, они предпринимают всё, чтобы никто не придумал альтернативный источник энергии, превосходящий нефтепродукты. Есть, конечно, Атом, но от него быстро «откидывают лапти», поэтому Атом для нефти не конкурент. У нефтяных баронов трудится не одна сотня смышленых мальчиков, в том числе и хакеров, которые «продвинутую» информацию из средств массовой информации, в том числе интернета удаляют. Эти мальчики о совести и о том, что из-за плохой экологии «человечество на грани вымирания» не задумываются, бароны им исправно платят за работу. Поэтому до нас доходят только вершки знаний, а истина находится в корешках. Мало того, необходимая информация подменяется ложной, используя которую, мы никогда ничего не создадим во благо человечества, если «хозяева мира» этого не захотят.

Да и вообще, надо соображать, двигатель на воде это — крах мировой экономической системы. Если цены на нефть резко упадут, произойдёт революция 1917-го года, только в мировом масштабе. Потому, что нефтедоллар определяет цены на другие товары. По началу, год — два будет переоценка всего, в магазинах ничего не будет, а на свалках «завал». Кто то может сказать, что это лирика в защиту «буржуев».

А теперь приступим к существу вопроса ! Как работает ячейка Мэйера ? Я проведу анализ того, что написано в статье «Вода вместо бензина», которая имеется в большом количестве экземпляров на разных сайтах. Отдельные моменты я буду опровергать, а интересные моменты статьи — выделять. Позже, я проанализирую на мой взгляд, действительно важные моменты статьи, которые указывают на то, что существует большая вероятность изготовления ячейки Мэйера своими руками. Стоит отметить, что патенты Мэйера написаны на «техническом» английском языке. Любой знаток «обыкновенного» английского языка не сможет правильно перевести его патенты на русский язык.

1. Обычный электролиз воды требует тока, измеряемого в амперах, ячейка Мэйер производит тот же эффект при миллиамперах.

Оценим эту фразу с учётом большинства тех схем, которые появлялись в интернете. Прибор, который измеряет ток, потребляемый от источника тока – обыкновенный амперметр постоянного тока, а после амперметра никаких сглаживающих конденсаторов нет. Учитывая, что импульсы, поступающие на электроды ячейки, кратковременны и имеют большую скважность, то амперметр, в силу инерционности рамки должен показывать ток не больше одной десятой от реально потребляемого тока, а то и меньше.

2. Обыкновенная водопроводная вода требует добавления электролита, например, серной кислоты, для увеличения проводимости, а ячейка Мэйера действует при огромной производительности с чистой водой.

Любой электролизёр с недистиллированной водой, при расстоянии между электродами 1-2 мм будет работать с огромной производительностью. Кроме того, в статье сначала пишется, что Мэйер использует водопроводную воду, а теперь пишут про чистую воду. Не соответствие. Вообще, у меня появилась мысль, что в статье много «полезного» вырезано, и много «запутывающего нам мозги» добавлено — это к слову о нефтяных баронах, и людях зарабатывающих на сенсациях.

3. Согласно очевидцам, самым поразительным аспектом клетки Мэйера было то, что она оставалась холодной, даже после часов производства газа.

При кратковременных импульсах – ничего поразительного.

4. Эксперименты Мэйера, которые он счел возможными представить к патентованию, заслужили серию патентов США, представленные под Секцией 101. Представление патента под этой секцией зависит от успешной демонстрации изобретения Патентному Рецензионному Комитету.

Мне приходилось представлять научную работу в известный Научно-исследовательский институт России (не буду его называть, чтобы, не принижать его авторитет, а он действительно авторитетный). В этой работе была куча недоработок, но она была высоко оценена. Её ещё потом отправляли на Всероссийский конкурс и за неё у меня даже медаль от министра образования есть. Работа была перспективной, но требовала времени, которого у меня не было, а сейчас она стала не актуальной. Кроме того, запатентовать можно что угодно. Мэйер, например, отдельно запатентовал свою ячейку и отдельно способ генерации водорода, отдельно патентовал и автомобильный двигатель на воде. Странный факт. Но может я не прав, и в Комитете сидели умные и внимательные мужи науки.

5. Мэйер использует внешнюю индуктивность, которая образует колебательный контур с емкостью ячейки, — чистая вода, по-видимому, обладает диэлектрической проницаемостью около 81 (в других статьях — «около 5»), — чтобы создать параллельную резонансную схему. Она возбуждается мощным импульсным генератором, который вместе с емкостью ячейки и выпрямительным диодом составляет схему накачки. Высокая частота импульсов производит ступенчато поднимающийся потенциал на электродах ячейки до тех пор, пока не достигается точка, где молекула воды распадается и возникает кратковременный импульс тока.

Здесь, говорится о каком то, колебательном контуре. Догадайтесь, на какой из приведённых схем изображён колебательный контур, левой или правой, а может найдёте схему накачки? Судя по приведённым схемам, контуром тут не пахнет, да и схемой накачки тоже.

Поясню: Принцип работы колебательного контура предполагает разнополярный перезаряд ёмкости и индуктивности одна от другой, входящих в сам контур, а здесь, во первых мешает диод, во вторых вода ячейки-конденсатора должна быть как минимум дистиллированная, потому, что будет разряд через активное сопротивление воды. Подробно в статье «Колебательный контур. Резонанс«.

Схемы накачки энергии известных в радиоэлектронике устройств как минимум имеют накопительную линию, состоящую из нескольких конденсаторов и дросселей. Есть и более простой способ «накачки», но об этом позже мы обязательно поговорим. А здесь, вообще ничего нет, кроме устройства разряда – пластин ячейки, которые, препятствуют вообще какому либо накоплению. Мало того, накопление в известных системах происходит постепенно, а потом происходит кратковременный разряд. А здесь, описывается, что-то другое, совершенно не понятное классической науке.

6. Стэнли Мэйер, успешно разлагает обыкновенную водопроводную воду на составляющие элементы посредством комбинации высоковольтных импульсов, при среднем потреблении тока, измеряемого всего лишь миллиамперами.

Смотри пункт 1.

7. Мэйер отказался прокомментировать подробности, которые бы позволили ученым воспроизвести и оценить его «водяную ячейку». Однако, он представил достаточно детальное описание американскому Патентному Бюро, чтобы убедить их, что он может обосновать его заявку на изобретение.

Совсем странный факт. Мэйер что, решил стать «водяным магнатом»? Почему отказался? Любитель носить патент, хвалиться его обложкой, но никому не показывать? Патент тогда ценен, когда его владелец получает от его реализации дивиденды!

8. Как заявляет Мэйер, — выход газа увеличивался, когда электроды сдвигались более близко, и уменьшался, когда они отодвигались.

В любом электролизёре при уменьшении расстояния между пластинами, производительность газа увеличивается.

9. Вторая ячейка содержала 9 ячеек с двойными трубками из нержавеющей стали и производила намного больше газа.

А вот на этот факт я прошу обратить внимание. Предполагаю, именно здесь кроется вся загадка ячейки.

10. Практическая демонстрация ячейки Мэйера является существенно более убедительной, чем псевдо-научный жаргон, который использован для объяснения.

Коперфильд тоже убедительно демонстрировал свои фокусы, а в качестве объяснений, так же как и Мэйер, использовал псевдо-научный жаргон (объяснял всё «магией»).

11. Изобретатель лично говорил об искажении и поляризации молекулы воды, приводящему к самостоятельному разрыву связи, под действием градиента электрического поля, резонанса в пределах молекулы, который усиливает эффект.

На это так же, как и в пункте 9, прошу обратить внимание, об этом поговорим позже.

12. Он также заявил, что фотонное стимулирование пространства реактора светом лазера посредством оптоволокна увеличивает производство газа.

При определённой частоте лазерного генератора, он действительно может усиливать резонанс молекул используя гармоники частот (деление и умножение).

13. Подбирают частоту импульсов, поступающих на конденсатор, соответствующую собственной частоте резонанса молекулы.

Написано одно, а представленные схемы и чертежи не способны работать на частоте резонанса молекул воды, но о возможности такой реализации тоже напишем позже (как по пунктам 9 и 11).

14. Повышающая катушка намотана на обычном тороидальном ферритовом сердечнике 1.50 дюйма в диаметре и 0.25 дюйма толщиной. Первичная катушка содержит 200 витков 24 калибра, вторичная 600 витков 36 калибра. Трансформатор обеспечивает повышение напряжения в 5 раз, хотя оптимальный коэффициент подбирается практическим путем.

При указанном количестве витков первичной и вторичной обмоток, напряжение повысится ровно в 3 (три) раза, а не 5 (пять), это скажет любой радиомастер. С таким описанием, Вы долго будете разбираться, как же работает ячейка Мэйера. О том, как рассчитывается коэффициент трансформации, можете прочитать в статье «Силовой трансформатор. Расчёт трансформатора«. А кто-то не знает, как работает трансформатор? Отвечу, это знает любой мастер: «Ууууууууууу…..».

15. Реальная вода обладает некоторой остаточной проводимостью, обусловленной наличием примесей. Идеально, если вода в ячейке будет химически чистой. Электролит к воде не добавляется.

Химически чистая вода это – дистиллированная вода! А сначала говорили о водопроводной!

16. Два концентрических цилиндра 4 дюймов длиной составляют конденсатор. Расстояние между поверхностями цилиндров 0.0625 дюйма.

Запоминайте размеры, мы к ним ещё вернёмся вместе с пунктами 9, 11 и 13.

17. Расчет резонансной частоты традиционный. Вторую индуктивность подстраивают в зависимости от чистоты воды так, чтобы потенциал, приложенный к воде, был постоянен.

Какой «традиционный» расчёт? Авторов статьи учили рассчитывать резонанс колебательного контура состоящего из конденсатора, катушки и полупроводникового диода? Таких «традиционных» контуров не бывает! Подробно о традиционных расчётах читайте в статье «Колебательный контур. Резонанс«. И вообще, под какую резонансную частоту подстраивать?

18. Внешняя трубка подгоняется под размер 3/4 дюйма 16 калибра (толщина стенки 0.06 дюйма), длиной 4 дюйма. Внутренняя трубка диаметром 1/2 дюйма 18 калибра (стенка 0.049 дюйма, это приблизительный размер для этой трубки, фактический калибр не может быть вычислен из патентной документации, но этот размер должен работать), 4 дюйма длиной.

Запоминайте размеры, мы к ним ещё вернёмся вместе с пунктами 9, 11 , 13 и 16.

19. Не указано, должна ли быть вода внутри трубки. Думается, что она там есть, но это совершенно не влияет на работу прибора.

А это как сказать, от этого может быть всё и зависит. Это у переписчика этой статьи не влияет! Вернёмся вместе с пунктами 9, 11 , 13, 16 и 18.

20. Частота не была напечатана, исходя из размера катушек и трансформатора, частота не превышает 50 Mhz. He упирайтесь в этот факт, это всего лишь моя догадка.

На основе чего автор догадывался о частоте, не превышающей 50 мегагерц? По парамерам катушек и трансформатора, без всяких вычислений, любой опытный радиолюбитель скажет, что частота не достигнет и 1 (одного) мегагерца. Автор статьи, как это он пишет сам, действительно попытался «догадаться», но получилось как в «Поле чудес» — играл но не угадал.

Теперь Вы, сами поняли, почему я сначала отнёсся к этой статье, как к очередному надувательству. Сейчас у меня противоположное мнение, но чтобы оно подтвердилось, необходимо всё «разложить по полочкам».

Материалы по водородному генератору Стенли Мейера

• Материалы по технологии изготовления водородного генератора Стенли Мейера.

Американский изобретатель Стенли Мейер, который занимался проблемой высокоэффективного электролиза воды с 1970 по 1991 г. Но уже в 1998 г. Мейер оформляет патенты на свои изобретения, которые основываются на резонансном методе раскола молекулы воды на составляющие. Команде во главе с С.Мейером удалось создать автомобиль, в качестве топлива у которого выступал гремучий газ, полученный из электролизеров конструкции Мейера, для улучшения качеств газа, Мейер подвергал газ ионизации и воздействию лазера, что способствовало еще большему возгоранию его в двигателе. Разработки С.Мейера до сих пор не дают покоя энтузиастам и автолюбителям, рассмотрим основные моменты технологии получения гремучего газа по имеющимся материалам авторства Стенли Мейера.

Выгодно ли получать водород в домашних условиях

Ответ на данный вопрос зависит от сферы применения кислородно-водородной смеси. Все чертежи и схемы, публикуемые различными интернет-ресурсами, рассчитаны на выделение газа HHO для следующих целей:

• использовать hydrogen в качестве топлива для автомобилей;
• бездымно сжигать водород в отопительных котлах и печах;
• применять для газосварочных работ.

Главная проблема, перечеркивающая все преимущества водородного топлива: затраты электричества на выделение чистого вещества превышают количество энергии, получаемое от его сжигания. Что бы ни утверждали приверженцы утопичных теорий, максимальный КПД электролизера достигает 50%. Это значит, что на 1 кВт полученной теплоты затрачивается 2 кВт электроэнергии. Выгода – нулевая, даже отрицательная.

Вспомним, что мы писали в первом разделе. Hydrogen – весьма активный элемент и реагирует с кислородом самостоятельно, выделяя уйму тепла. Пытаясь разделить устойчивую молекулу воды, мы не можем подвести энергию непосредственно к атомам. Расщепление производится за счет электричества, половина которого рассеивается на подогрев электродов, воды, обмоток трансформаторов и так далее.

Важная справочная информация. Удельная теплота сгорания водорода втрое выше, чем у метана, но – по массе. Если сравнивать их по объему, то при сжигании 1 м³ гидрогена выделится всего 3.6 кВт тепловой энергии против 11 кВт у метана. Ведь водород – легчайший химический элемент.

Теперь рассмотрим гремучий газ, полученный электролизом в самодельном водородном генераторе, как топливо для вышеперечисленных нужд:

1. Конечная цена установки, низкая производительность и КПД делает крайне невыгодным сжигание водорода для отопления частного дома. Чем «наматывать» счетчик электролизером, проще поставить любой из электрокотлов – ТЭНовый, индукционный либо электродный.
2. Чтобы заменить 1 л бензина для автомобиля, потребуется 4766 литров чистого водорода или 7150 л гремучего газа, треть которого составляет кислород. Самый завравшийся изобретатель в интернете еще не сделал электролизер, способный обеспечить подобную производительность.
3. Газосварочный аппарат, сжигающий hydrogen, компактнее и легче баллонов с ацетиленом, пропаном и кислородом. Плюс температура пламени до 3000 °С позволяет работать с любыми металлами, стоимость получения горючего здесь особой роли не играет.

Для справки. Чтобы сжигать гидроген в отопительном котле, придется основательно переработать конструкцию, поскольку водородная горелка способна расплавить любую сталь.

Заключение

Гидроген в составе газа ННО, полученный из самодельного водородного генератора, пригодится для двух целей: экспериментов и газосварки. Даже если отбросить низкий КПД электролизера и затраты на его сборку вместе с потребляемым электричеством, на обогрев здания попросту не хватит производительности. Это касается и бензинового двигателя легковой машины.

Источники

• https://zen.yandex.ru/media/incrediblmech/toplivnaia-iacheika-i-mashina-na-vode-stenli-meiera-5d63f654d7859b00ad3b35eb
• https://otivent.com/kak-sdelat-generator-vodoroda-v-domashnix-usloviyax
• https://econet.ru/articles/86660-vodyanaya-toplivnaya-yacheyka-meyera
• https://aqua-rmnt.com/otoplenie/generator-vodoroda-dlya-sistemy-otopleniya-sobiraem-dejstvuyushhuyu-ustanovku-svoimi-rukami.html
• https://meanderss.ru/meiers.shtml
• https://energyscience.ru/topic106.html

[свернуть]

Опубликовано: 13.10.2020

Водяная топливная ячейка мейера. Как работает ячейка Мэйера? Двигатель на воде.Где вымысел, а где правда? Стенли меер отдыхает

Что собой представляет водородный генератор ? Это определенный прибор, который работает с помощью нескольких процессов. Во время своего действия он начинает перерабатывать воду и разлагает ее на водород и кислород. Водородный генератор многие изготавливают самостоятельно. Лучше всего для этого иметь опыт в работе с отопительными системами и изготовлении схожих приборов. В этом случае вы сделаете всё правильно, и не будете волноваться за работу своего генератора.

Как происходит отопление водородом

Отопление водородом – это достаточно практичная вещь. Такое отопление можно встретить внутри автомобиля, в месте, где стоит двигатель. Водород можно получать в больших объёмах. Это делает такой вид отопления всё более и более популярным в условиях, когда надо сберечь деньги и получить отопление в дом максимально эффективно.

Водородный способ отопления был изобретён в компании, которая находится в Италии. Выглядел аппарат как горелка. Получение выглядело иначе, чем сейчас. Способ является экологичным способом получения энергии. К тому же, практически бесшумным. Большое количество водорода сжигается при низкой температуре около 3000 градусов Цельсия. Такая температура поспособствовала изготавливать котлы для отопления водородом из обычных материалов.

Во время отопления водородом, водяной котёл или печь выпускает пар. Пар не приносит вреда человеческой жизни. Он безвредный. Для работы отопления водородом необходима только одна составляющая затрат – электричество. Однако, если поставить солнечные панели , которые будут получать солнечную энергию, то затраты можно снизить до минимальных значений, либо вовсе свести к нулю.

Отопление водородом чаще всего применяются для системы тёплых полов.

Процесс отопления можно представить в виде следующих этапов:

• Вступление кислорода в реакцию с водородом;
• Образование водяных молекул;
• Выделение тепловой энергии;
• Нагрев пола.

Тепловая энергия, которая выделяется во время реакции, нагревает воду до 40 градусов тепла. Это идеальная температура для технологии теплого пола.

Отопление водородом часто применяется в случаях, когда надо существенно сэкономить на использовании технологий теплого пола. Такой способ позволяет быстро согреть пол без существенных затрат. К тому же, если котёл будет питаться от солнечной энергии, то ваши затраты на обеспечение работы котла приблизятся к нулю.

Можно ли сделать водородный генератор своими руками

Сегодня можно найти в открытых источниках большой пласт информации о создании различных агрегатов. В том числе, и водородного генератора и его принцип работы. Если вы обладаете достаточными знаниями, навыками в конструировании такого рода устройств, то вы можете сделать его своими руками.

Чтобы собрать газогенератор, нужно знать его устройство. Топливные ячейки – это своего рода блок. Для их изготовления следует брать пластины из оргалита или оргстекла.

Представим этапы изготовления генератора:

• Создание топливных ячеек;
• Создание отверстий, чтобы дать проход воде;
• Вырезаем электродные пластины;
• Обрабатываем нержавеющую сталь наждачкой;
• Сверлим отверстия для воды между электродами, чтобы отвести газ Брауна ;
• Собираем генератор;
• Вставляем шпильки и укладываем электроды;
• Отделяем от реактора пластины нержавейки уплотнительными кольцами;
• Закрываем генератор оргалитовой стенкой;
• Скрепляем конструкцию шайбами и гайками;
• Подключаем генератор шлангами к ёмкости с водой;
• Соединяем контактные площадки между собой;
• Подключаем провод питания;
• Даём напряжение на топливную ячейку.

При конструировании водородного генератора стоит учитывать, что плоскость электродов должна быть ровной, во избежание короткого замыкания.

Следуя вышеприведённому алгоритму, вы сможете изготовить генератор самостоятельно. И тогда водный генератор будет способен расщепить автоподстройкой частоты необходимые частицы для получения энергии.

Водородный генератор можно сделать самостоятельно. Если у вас есть технические знания и опыт в области конструирования подобных устройств, то сделать генератор для вас будет расплюнуть. Делайте всё согласно схемам, чертежам, смотрите руководство по самостоятельному изготовлению, читайте подробное описание и тогда вы сможете сконструировать самодельный электрогенератор для тепла своими руками из доступных деталей, как для легковых авто, так и для домашнего использования. Электрохимический прибор отлично осуществит обогрев как настоящая печка.

Из чего изготавливается электролизер своими руками: чертежи

Чтобы изготовить электролизер своими руками быстро и без лишних проблем, то стоит воспользоваться чертежами. Они помогут вам точнее понять схему и устройство изделия, чтобы сделать его самостоятельно.

Электролизная часть должна быть изготовлена из нержавеющей стали. Можете даже использовать старый лист стали. Покупать новый лист не стоит. Определим список материалов, которые понадобятся при изготовлении.

Пластины в электролизере должны быть двух видов: положительная и отрицательная.

Для изготовления электролизера вам понадобится несколько деталей:

• Лист нержавейки;
• Болты, гайки и шайбы;
• Труба;
• Штуцеры;
• Ёмкость на 1,5 литра;
• Фильтр для проточной воды;
• Обратный клапан для воды.

Данные материалы понадобятся вам при изготовлении электролиза. В процессе конструирования изделия, следует чётко придерживаться чертежей. Следует заранее в них разобраться, чтобы знать, где все составляющие элементы конструкции.

Сделать гидролизер самостоятельно можно с помощью разных компонентов, вам может и не потребоваться сварка, конечно если вы не будете делать сварочный или ацетиленовый резак, а вот электронный компонент buz350, аккумулятор и батарея которые вырабатывают достаточное количество Джо. Они, для подключения вам могут понадобиться. Если вам нужно много мощности, то можно использовать аккумулятор, который имеет мотоцикл Питер или Вуд, кстати, очень часто такое приспособление работает на спирту, что упрощает задачу. Так что такая добыча водорода будет упрощенной. Для мощных установок, может быть использована машина употребляющая дизель, а точнее ее ДВС.

Для грамотного изготовления электролиза, используйте чертежи. Они помогут вам сделать установку правильной. Заранее посмотрите список материалов и средств, которые могут вам понадобиться во время создания электролиза. Удачи при изготовлении!

Что такое газ Брауна

Во время работы водородный генератор создаёт водород. Но на выходе мы получаем не чистый водород, а его модификацию. Это и есть газ Брауна. Он необходим для воспроизведения энергии и обозначается как HHO. Часто люди хотят отапливать свой дом, применяя оксиводород.

Газ Брауна или Стенли получают из воды. Это осуществляется с помощью метода электролиза или резонанса. Данное топливо всё чаще пробуют использовать для отопления частного дома и жилых помещений. Формула гремучего газа в чём-то схожа с формулой газа Брауна.

Генераторы, которые выделяют такой газ, можно купить, либо изготовить самостоятельно.

Для самостоятельного получения газа вам необходимо:

• Трубки из ферросплавной нержавейки;
• Регулятор для настройки мощности элемента нагрева;
• Осушитель;
• Источник питания на 12 В.

Стоит отметить, что трубки из нержавейки должны быть разных диаметров.

Газ Брауна – это модификация водородного газа. Именно его мы получаем на выходе, когда используем водородный генератор в быту. Газ можно применять для технологии теплого пола. Так ваши ноги всегда будут в тепле. При этом, затраты на содержания генератора, крайне малы.

Как выбрать водородный котел

Водородный котёл – это самый необходимый элемент для водородного генератора. Без него ваш агрегат не будет работать. Водородный котел можно сделать самостоятельно. Однако многие владельцы дачных участков и домов, где используются теплые полы, рекомендуют котел покупать.

Чтобы выбрать водородный котел, надо обращать внимание на базовые характеристики:

• Мощность;
• Количество контуров;
• Объём потребляемой энергии.

Также стоит обращать внимание на производство. Чем популярнее марка – тем лучше.

Это три основные параметры, по которым можно определить, насколько перед вами эффективный котёл с высоким КПД.

Если вы собираетесь отапливать весь дом – покупайте самые большие котлы. Если нет, то стоит остановиться на маленьком котле. Подходите к выбору котла внимательно. Это самый важный элемент в водородном генераторе. Выбирайте качественные котлы только популярных марок, и тогда ваш генератор прослужит вам много лет.

Насколько эффективна ячейка Мейера

Ячейка Мейера – это топливная ячейка. Элемент, который тратит малый объём электроэнергии, создавая большое количество водородно-кислородной смеси из обычной воды. Преимущества ячейки очевидны. Именно поэтому её применяют в водородных генераторах.

3 главные преимущества ячейки Майера:

• Малое потребление;
• Высокая эффективность от чистой воды;
• Ячейка остаётся холодной даже после часовом создании газа.

Ячейка Мейера применяется вместо обычного электролиза.

За счёт малого потребления и высокой эффективности, ячейка получила широкое применение в создании водородного генератора в домашних условиях. Установка затрачивается малое количество энергии. При этом, даже от чистой воды, она способна производить огромное количество газа, оставаясь холодной.

Ячейка Мейера гораздо эффективнее электролиза. Она изготавливается из нержавейки, требует мало затрат, но при этом на выходе мы получаем большой объём газа. Для работы её необходимо погружать в воду. Если вы хотите получить большое количество газа, то следует использоваться именно ячейку Мейера.

Авто на воде своими руками: чертежи (видео)

Водородный генератор – это очень полезное устройство для тех, кто хочет сэкономить на электроэнергии и получить максимально эффективный агрегат, с помощью которого можно производить газ для системы теплых полов. При использовании генератора, вы будете обеспечены теплым полом на долгое время.

Знаете, почему технологии использования воды в качестве рабочего топлива до сих пор не стали нашей ежедневной практикой? Потому что двигатель на воде это – крах мировой экономической системы, называемой Капитализмом. Если цены на нефть резко упадут, произойдёт революция 1917-го года, только в мировом масштабе. Потому, что нефтедоллар сегодня является базисом власти мировой власти и определяет цены на другие товары…

Как работает ячейка Мэйера?

Прошло уже достаточно много времени, после изобретения двигателя на воде, или так называемой, «топливной ячейки» американца Стэнли (Стива) Мэйера (Мейера, или Майера) – как изобретателя только не называют. Кто случайно не знает, поясню: Ячейка Мейера – устройство, расходующее малое количество электрической энергии (фактически «на халяву»), и производящее из обыкновенной воды большое количество водородно-кислородной смеси. В попытках разобраться, как работает ячейка Мэйера, в настоящее время, «бьется» большое количество умов. Кто то, даже заявляет, что ему удалось реализовать этот «генератор водорода», но как то это делается украдкой, да и потом ничего не происходит: Мы, почему то не пересаживаемся на автомобили, работающие на воде, потому что их попросту нет. Я так же интересуюсь этой проблемой, проводил эксперименты с ячейкой Мэйера, поэтому предлагаю разобраться в этом вместе. Как знать, может быть, мои советы Вам помогут, и вскоре Вы заявите, что Ваш автомобиль на воде поехал. Почему не я? В анналы истории я не рвусь, на ближайшие половину года – год основная моя работа занимает много времени и кроме того, у меня нет условий позволяющих воссоздать ячейку Мэйера в “ближайшее время”. Что, по моему мнению, необходимо и как вообще работает ячейка Мэйера Мы с Вами будем разбираться вместе. Об этом, Вы прочтёте в последующих статьях.

Для того, кто желает увидеть видеоматериал сделанный самим Мейером и его друзьями, тот может перейти на страничку Книги, программы и видеоматериал для бесплатного скачивания , на которой имеются ссылки на большое количество видеофильмов от демонстраций, до конференций, а также другой материал от автора Ячейки – Стенли Мейера.

Перед изложением материала, хочу акцентировать внимание на следующем: Эксперименты с водородом чрезвычайно опасны, Вы осуществляете их на свой страх и риск! Скорость сгорания водорода на несколько порядков выше скорости сгорания любых других видов углеводородного топлива и их паров. А смесь водорода с кислородом – так называемая “Гремучая смесь” не просто горит, а взрывается с огромной силой. Учитывая определённые сложности в изготовлении установки по разложению воды на составляющие, я осознаю, что простой школяр установку сам не сделает. Поскольку Вы взрослые люди, за Ваши действия, я ответственности не несу, и кроме того, заявляю, что если Вы не имеете достаточных знаний, навыков и умений обеспечивающих Вашу безопасность, то категорически не рекомендую Вам заниматься практическим изготовлением установок по выделению водорода.
Настоящая статья предназначена для того, чтобы развеять Ваши фантазии и невежество, которые в бесчисленном колличестве появляются на различных форумах. Смешно выглядят публикуемые на различных сайтах радиосхемы Ячеек Мэйера, которые должны расходовать минимум энергии для получения резонанса воды. Это грамотно исполненные схемы, на самом деле “работающие”, но абсолютно все они работают по принципу обыкновенного Электролизёра! Какой резонанс, какое накопление? Полный бред!!!

Почему ячейку Мэйера сделал только он сам, а другие не смогли? Начнём с того, что существует версия, которая не вызовет ни у кого её отрицания. В мире есть «очень маленькая» кучка людей с «очень огромными» возможностями, это – нефтяные магнаты – владельцы мировых запасов топлива. Им бы очень не хотелось терять свои миллиарды миллиардов, которые они практически «на халяву» кладут к себе в карман выкачивая «кровь Земли». Фактически они живут за счёт всего человечества. Это Вы и я исправно платим им большие деньги, заправляя свой автомобиль, за то, что по сути им не должно принадлежать. И для того, чтобы этот процесс наполнения карманов не останавливался, они предпринимают всё, чтобы никто не придумал альтернативный источник энергии, превосходящий нефтепродукты. Есть, конечно, Атом, но от него быстро «откидывают лапти», поэтому Атом для нефти не конкурент. У нефтяных баронов трудится не одна сотня смышленых мальчиков, в том числе и хакеров, которые «продвинутую» информацию из средств массовой информации, в том числе интернета удаляют. Эти мальчики о совести и о том, что из-за плохой экологии «человечество на грани вымирания» не задумываются, бароны им исправно платят за работу. Поэтому до нас доходят только вершки знаний, а истина находится в корешках. Мало того, необходимая информация подменяется ложной, используя которую, мы никогда ничего не создадим во благо человечества, если “хозяева мира” этого не захотят.
Да и вообще, надо соображать, двигатель на воде это – крах мировой экономической системы. Если цены на нефть резко упадут, произойдёт революция 1917-го года, только в мировом масштабе. Потому, что нефтедоллар определяет цены на другие товары. По началу, год – два будет переоценка всего, в магазинах ничего не будет, а на свалках «завал». Кто то может сказать, что это лирика в защиту «буржуев».

А теперь приступим к существу вопроса! Как работает ячейка Мэйера? Я проведу анализ того, что написано в статье “Вода вместо бензина” , которая имеется в большом количестве экземпляров на разных сайтах. Отдельные моменты я буду опровергать, а интересные моменты статьи – выделять. Позже, я проанализирую на мой взгляд, действительно важные моменты статьи, которые указывают на то, что существует большая вероятность изготовления ячейки Мэйера своими руками. Стоит отметить, что патенты Мэйера написаны на “техническом” английском языке. Любой знаток “обыкновенного” английского языка не сможет правильно перевести его патенты на русский язык. Посетители сайта могут бесплатно скачать патенты Стэнли Мэйера с Депозита по ссылке: http://depositfiles.com/files/q7i9yjjrw . А мы, тем временем, приступаем к анализу “русскоязычного перевода”!

1. Обычный элекролиз воды требует тока, измеряемого в амперах, ячейка Мэйер производит тот же эффект при милиамперах.
Оценим эту фразу с учётом большинства тех схем, которые появлялись в интернете. Прибор, который измеряет ток, потребляемый от источника тока – обыкновенный амперметр постоянного тока, а после амперметра никаких сглаживающих конденсаторов нет. Учитывая, что импульсы, поступающие на электроды ячейки, кратковременны и имеют большую скважность, то амперметр, в силу инерционности рамки должен показывать ток не больше одной десятой от реально потребляемого тока, а то и меньше.

2. Обыкновенная водопроводная вода требует добавления электролита, например, серной кислоты, для увеличения проводимости, а ячейка Мэйера действует при огромной производительности с чистой водой.
Любой электролизёр с недистиллированной водой, при расстоянии между электродами 1-2 мм будет работать с огромной производительностью. Кроме того, в статье сначала пишется, что Мэйер использует водопроводную воду, а теперь пишут про чистую воду. Не соответствие. Вообще, у меня появилась мысль, что в статье много «полезного» вырезано, и много «запутывающего нам мозги» добавлено – это к слову о нефтяных баронах, и людях зарабатывающих на сенсациях.

3. Согласно очевидцам, самым поразительным аспектом клетки Мэйера было то, что она оставалась холодной, даже после часов производства газа.
При кратковременных импульсах – ничего поразительного.

4. Эксперименты Мэйера, которые он счел возможными представить к патентованию, заслужили серию патентов США, представленные под Секцией 101. Представление патента под этой секцией зависит от успешной демонстрации изобретения Патентному Рецензионному Комитету.
Мне приходилось представлять научную работу в известный Научно-иследовательский институт России (не буду его называть, чтобы, не принижать его авторитет, а он действительно авторитетный). В этой работе была куча недоработок, но она была высоко оценена. Её ещё потом отправляли на Всероссийский конкурс и за неё у меня даже медаль от министра образования есть. Работа была перспективной, но требовала времени, которого у меня не было, а сейчас она стала не актуальной. Кроме того, запатентовать можно что угодно. Мейер, например, отдельно запатентовал свою ячейку и отдельно способ генерации водорода, отдельно патентовал и автомобильный двигатель на воде. Странный факт. Но может я не прав, и в Комитете сидели умные и внимательные мужи науки.

5. Мэйер использует внешнюю индуктивность, которая образует колебательный контур с емкостью ячейки, – чистая вода, по-видимому, обладает диэлектрической проницаемостью около 81 (в других статьях – “около 5”), – чтобы создать параллельную резонансную схему. Она возбуждается мощным импульсным генератором, который вместе с емкостью ячейки и выпрямительным диодом составляет схему накачки. Высокая частота импульсов производит ступенчато поднимающийся потенциал на электродах ячейки до тех пор, пока не достигается точка, где молекула воды распадается и возникает кратковременный импульс тока.
Здесь, говорится о каком то, колебательном контуре. Догадайтесь, на какой из приведённых схем изображён колебательный контур, левой или правой, а может найдёте схему накачки? Судя по приведённым схемам, контуром тут не пахнет, да и схемой накачки тоже.
Поясню: Принцип работы колебательного контура предполагает разнополярный перезаряд ёмкости и индуктивности одна от другой, входящих в сам контур, а здесь, во первых мешает диод, во вторых вода ячейки-конденсатора должна быть как минимум дистиллированная, потому, что будет разряд через активное сопротивление воды. Подробно в статье “ “.
Схемы накачки энергии известных в радиоэлектронике устройств как минимум имеют накопительную линию, состоящую из нескольких конденсаторов и дросселей. Есть и более простой способ “накачки”, но об этом позже мы обязательно поговорим. А здесь, вообще ничего нет, кроме устройства разряда – пластин ячейки, которые, препятствуют вообще какому либо накоплению. Мало того, накопление в известных системах происходит постепенно, а потом происходит кратковременный разряд. А здесь, описывается, что-то другое, совершенно не понятное классической науке.

6. Стэнли Мэйер, успешно разлагает обыкновенную водопроводную воду на составляющие элементы посредством комбинации высоковольтных импульсов, при среднем потреблении тока, измеряемого всего лишь милиамперами.
Смотри пункт 1.

7. Мэйер отказался прокомменировать подробности, которые бы позволили ученым воспроизвести и оценить его “водяную ячейку”. Однако, он представил достаточно детальное описание американскому Патентному Бюро, чтобы убедить их, что он может обосновать его заявку на изобретение.
Совсем странный факт. Мэйер что, решил стать «водяным магнатом»? Почему отказался? Любитель носить патент, хвалиться его обложкой, но никому не показывать? Патент тогда ценен, когда его владелец получает от его реализации дивиденды!

8. Как заявляет Мэйер, – выход газа увеличивался, когда электроды сдвигались более близко, и уменьшался, когда они отодвигались.
В любом электролизёре при уменьшении расстояния между пластинами, производительность газа увеличивается.

9. Вторая ячейка содержала 9 ячеек с двойными трубками из нержавеющей стали и производила намного больше газа.
А вот на этот факт я прошу обратить внимание. Предполагаю, именно здесь кроется вся загадка ячейки.

10. Практическая демонстрация ячейки Мэйера является существенно более убедительной, чем псевдо-научный жаргон, который использован для объяснения.
Коперфильд тоже убедительно демонстрировал свои фокусы, а в качестве объяснений, так же как и Мэйер, использовал псевдо-научный жаргон (объяснял всё «магией»).

11. Изобретатель лично говорил об искажении и поляризации молекулы воды, приводящему к самостоятельному разрыву связи, под действием градиента электрического поля, резонанса в пределах молекулы, который усиливает эффект.
На это так же, как и в пункте 9, прошу обратить внимание, об этом поговорим позже.

12. Он также заявил, что фотонное стимулирование пространства реактора светом лазера посредством оптоволокна увеличивает производство газа.
При определённой частоте лазерного генератора, он действительно может усиливать резонанс молекул используя гармоники частот (деление и умножение).

13. Подбирают частоту импульсов, поступающих на конденсатор, соответствующую собственной частоте резонанса молекулы.
Написано одно, а представленные схемы и чертежи не способны работать на частоте резонанса молекул воды, но о возможности такой реализации тоже напишем позже (как по пунктам 9 и 11).

14. Повышающая катушка намотана на обычном тороидальном ферритовом сердечнике 1.50 дюйма в диаметре и 0.25 дюйма толщиной. Первичная катушка содержит 200 витков 24 калибра, вторичная 600 витков 36 калибра. Трансформатор обеспечивает повышение напряжения в 5 раз, хотя оптимальный коэффициент подбирается практическим путем.
При указанном количестве витков первичной и вторичной обмоток, напряжение повысится ровно в 3 (три) раза, а не 5 (пять), это скажет любой радиомастер. С таким описанием, Вы долго будете разбираться, как же работает ячейка Мэйера. О том, как рассчитывается коэффициент трансформации, можете прочитать в статье “Силовой трансформатор. Расчёт трансформатора “. А кто-то не знает, как работает трансформатор? Отвечу, это знает любой мастер: «Ууууууууууу…..».

15. Реальная вода обладает некоторой остаточной проводимостью, обусловленной наличием примесей. Идеально, если вода в ячейке будет химически чистой. Электролит к воде не добавляется.
Химически чистая вода это – дистиллированная вода! А сначала говорили о водопроводной!

16. Два концентрических цилиндра 4 дюймов длиной составляют конденсатор. Расстояние между поверхностями цилиндров 0.0625 дюйма.
Запоминайте размеры, мы к ним ещё вернёмся вместе с пунктами 9, 11 и 13.

17. Расчет резонансной частоты традиционный. Вторую индуктивность подстраивают в зависимости от чистоты воды так, чтобы потенциал, приложенный к воде, был постоянен.
Какой «традиционный» расчёт? Авторов статьи учили рассчитывать резонанс колебательного контура состоящего из конденсатора, катушки и полупроводникового диода? Таких «традиционных» контуров не бывает! Подробно о традиционных расчётах читайте в статье “Колебательный контур. Резонанс “. И вообще, под какую резонансную частоту подстраивать?

18. Внешняя трубка подгоняется под размер 3/4 дюйма 16 калибра (толщина стенки 0.06 дюйма), длиной 4 дюйма. Внутренняя трубка диаметром 1/2 дюйма 18 калибра (стенка 0.049 дюйма, это приблизительный размер для этой трубки, фактический калибр не может быть вычислен из патентной документации, но этот размер должен работать), 4 дюйма длиной.
Запоминайте размеры, мы к ним ещё вернёмся вместе с пунктами 9, 11 , 13 и 16.

19. Не указано, должна ли быть вода внутри трубки. Думается, что она там есть, но это совершенно не влияет на работу прибора.
А это как сказать, от этого может быть всё и зависит. Это у переписчика этой статьи не влияет! Вернёмся вместе с пунктами 9, 11 , 13, 16 и 18.

20. Частота не была напечатана, исходя из размера катушек и трансформатора, частота не превышает 50 Mhz. He упирайтесь в этот факт, это всего лишь моя догадка.
На основе чего автор догадывался о частоте, не превышающей 50 мегагерц? По парамерам катушек и трансформатора, без всяких вычислений, любой опытный радиолюбитель скажет, что частота не достигнет и 1 (одного) мегагерца. Автор статьи, как это он пишет сам, действительно попытался «догадаться», но получилось как в “Поле чудес” – играл но не угадал.

Теперь Вы, сами поняли, почему я сначала отнёсся к этой статье, как к очередному надувательству. Сейчас у меня противоположное мнение, но чтобы оно подтвердилось, необходимо всё “разложить по полочкам”.

В следующей статье (всего их 9) , мы с Вами «снимем с ушей лапшу» и раскроем то, что скрыто за выделенными в этой статье пунктами №№ 9, 11, 13, 16, 18, 19. А это именно то звено цепи загадок, которое нам предстоит раскрыть, чтобы ответить на вопрос: Как работает ячейка Мэйера? 5

Автор публикации

Евгений Гигаури – идеолог-координатор международного Движения за Новый Мир – Форсайт-Проект Мидгард-ЭДЕМ — http://сайт/

Информация обо мне — http://geogen-mir.livejournal.com/profile/
АиФ — http://www.aif.ua/society/955562

МОИ СТРАНИЧКИ В СОЦ. СЕТЯХ:

«FACEBOOK» — https://www.facebook.com/EugeneGigauri
«LIVE JOURNAL» — http://geogen-mir.livejournal.com/
«В КОНТАКТЕ» — https://vk.com/staligen
«TWITTER» — https://twitter.com/Geogen2012
«YouTube» — http://www.youtube.com/user/Geogenus/
«Google+» — https://plus.google.com/+Geogenus/
«МОЙ МИР» на Mail.Ru — http://my.mail.ru/mail/geo-gen/

В данной статье поговорим про импульсный генератор для ячейки Мэйера.

Изучая элементную базу электронных плат, на которых были собраны все устройства входящие в состав сложной установки, применяемой Мэйером в водородном генераторе, установленном им на автомобиль, я собрал «главную часть» устройства – импульсный генератор.

Все электронные платы выполняют в Ячейке определённые задачи.

Электронная часть мобильной установки генератора водорода Мэйера состоит из двух полноценных устройств, оформленных в виде двух независимых блоков. Это блок управления и контроля ячейки, вырабатывающей кислородно-водородную смесь и блок управления и контроля за подачей этой смеси в цилиндры двигателя внутреннего сгорания. Фотография первого представлена ниже.

Блок управления и контроля за работой ячейки состоит из устройства вторичного питания обеспечивающего все платы модуля энергией и одиннадцати модулей – плат, состоящих из генераторов импульсов, схем контроля и управления. В этом же блоке, за платами импульсных генераторов находятся импульсные трансформаторы. Один из одиннадцати комплектов: плата импульсного генератора и импульсного трансформатора используется конкретно только для одной пары трубок Ячейки. А поскольку пар трубок одиннадцать, то и генераторов тоже одиннадцать.

.

Судя по фотографиям, импульсный генератор собран на простейшей элементной базе цифровых логических элементов. Принципиальные схемы, публикуемые на различных сайтах, посвящённых Ячейке Мэйера, по принципу работы не так далеки от её оригинала, за исключением одного – они упрощены и работают бесконтрольно. Другими словами, импульсы подаются на трубки-электроды до той поры, пока не наступит «пауза», которую по своему усмотрению оперативно с помощью регулировки устанавливает конструктор схемы. У Мэйера «пауза» формируется только тогда, когда сама Ячейка, состоящая из двух трубок, сообщит что пора бы эту паузу сделать. Имеется регулировка чувствительности схемы контроля, уровень которой устанавливается оперативно с помощью регулировки. Кроме того, имеется оперативная регулировка длительности «паузы» — времени, в течение которого на ячейку не поступают импульсы. В схеме генератора Мэйера предусмотрена автоматическая регулировка «паузы» в зависимости от необходимости количества вырабатываемого газа. Эта регулировка осуществляется по сигналу, поступающему от блок управления и контроля за подачей топливной смеси в цилиндры ДВС. Чем быстрее вращается двигатель внутреннего сгорания, тем больше расход кислородно-водородной смеси и тем короче «пауза» у всех одиннадцати генераторов.

На переднюю панель генератора Мэйера выведены шлицы подстроечных резисторов осуществляющих регулировку частоты импульсов, длительности паузы между пачками импульсов и ручной установки уровня чувствительности схемы контроля.

Для репликации опытного импульсного генератора нет необходимости в автоматическом контроле потребности газа и автоматическом регулировании «паузы». Это упрощает электронную схему импульсного генератора. Кроме того, современная электронная база более развита, чем была 30 лет назад, поэтому при наличии более современных микросхем, нет смысла использовать простейшие логические элементы, которые ранее использовал Мэйер.

В настоящей статье публикуется схема импульсного генератора, собранного мной, воссоздающего принцип работы генератора ячейки Мэйера. Это не первая моя конструкция импульсного генератора, до неё было ещё две более сложных схемы, способных генерировать импульсы различной формы, с амплитудной, частотной и временной модуляцией, схемами контроля тока нагрузки в цепях трансформатора и самой Ячейки, схемами стабилизации амплитуд импульсов и формы выходного напряжения на Ячейке. В результате исключения, по моему мнению «ненужных» функций получилась простейшая схема, очень похожая на схемы, публикуемые на различных сайтах, но отличающаяся от них наличием схемы контроля тока Ячейки.

Как и в других публикуемых схемах, в ячейке имеются два генератора. Первый является генератором – модулятором, формирующим пачки импульсов, а второй генератором импульсов. Особенностью схемы является то, что первый генератор — модулятор работает не в режиме автогенератора, как у других разработчиков схем Ячейки Мейера, а в режиме ждущего генератора. Модулятор работает по следующему принципу: На начальном этапе он разрешает работу генератора, а по достижении непосредственно на пластинах Ячейки определённой амплитуды тока, происходит запрет генерации.

В мобильной установке Мэйера в качестве импульсного трансформатора используется тонкий сердечник, а количество витков всех обмоток огромное. Ни в одном патенте не указаны ни размеры сердечника, ни количество витков. В стационарной установке у Мэйера замкнутый торроид с известными размерами и количеством витков. Именно его и решено было использовать. Но поскольку тратить энергию впустую на намагничивание в однотактной схеме генератора это – расточительство, было решено использовать трансформатор с зазором, взяв за основу ферритовый сердечник от строчного трансформатора ТВС-90 применяемого в транзисторных чёрно-белых телевизорах. Он наиболее подходит под параметры, указанные в патентах Мэйера для стационарной установки.

Принципиальная электрическая схема Ячейки Мэйера в моём исполнении представлена на рисунке.

.

Никакой сложности в конструкции генератора импульсов нет. Он собран на банальных микросхемах – таймерах LM555. По причине того, что генератор экспериментальный и неизвестно какие токи нагрузки нас могут ожидать, для надёжности в качестве выходного транзистора VT3 используется IRF.

Когда ток Ячейки достигнет определённого порога, при котором происходит разрыв молекул воды, необходимо сделать паузу в подаче импульсов на Ячейку. Для этого служит кремниевый транзистор VT1 — КТ315Б, который запрещает работу генератора. Резистор R13 «Ток срыва генерации» предназначен для установки чувствительности схемы контроля.

Переключатель S1 «Длительность грубо» и резистор R2 «Длительность точно» являются оперативными регулировками длительности паузы между пачками импульсов.

В соответствии с патентами Мэйера трансформатор имеет две обмотки: первичная содержит 100 витков (для 13 вольт питания) провода ПЭВ-2 диаметром 0,51 мм, вторичная содержит 600 витков провода ПЭВ-2 диаметром 0,18 мм.

При указанных параметрах трансформатора оптимальная частота следования импульсов – 10 кГц. Катушка индуктивности L1 намотана на картонной оправке диаметром 25 мм, и содержит 100 витков провода ПЭВ-2 диаметром 0,51 мм.

Теперь, когда вы всё это «проглотили», произведём разбор полётов этой схемы. С данной схемой я не применял дополнительных схем повышающих выход газа, потому что в мобильной Ячейке Мэйера их не наблюдается, конечно не считая лазерной стимуляции. Или я забыл сходить со своей Ячейкой к «бабке – шептунье», чтобы она нашептала высокую производительность Ячейки, или не правильно выбрал трансформатор, но КПД установки получился очень низкий, а сам трансформатор сильно нагревался. Учитывая, что сопротивление воды мало, сама Ячейка не способна выступать в качестве накопительного конденсатора. Ячейка просто не работала по тому «сценарию» который описывал Мэйер. Поэтому я добавил в схему дополнительный конденсатор С11. Только в этом случае на осциллограмме выходного напряжения появилась форма сигнала, с выраженным процессом накопления. Почему я поставил его не параллельно Ячейке, а через дроссель? Схема контроля тока ячейки должна отслеживать резкое повышение этого тока, а конденсатор будет препятствовать этому своим зарядом. Катушка уменьшает влияние С11 на схему контроля.

Я использовал простую воду из под крана, использовал и свежее дистиллированную. Как я только не извращался, но затраты энергии при фиксированной производительности были в три — четыре раза выше, чем напрямую от аккумулятора через ограничительный резистор. Сопротивление воды в ячейке настолько мало, что повышение импульсного напряжения трансформатором, с лёгкостью гасилось на малом сопротивлении, заставляя магнитопровод трансформатора сильно нагреваться. Возможно, предположить, что вся причина в том, что я использовал трансформатор на феррите, а в мобильной версии Ячейки Мэйера стоят трансформаторы, у которых сердечник почти отсутствует. Он больше выполняет функцию каркаса. Не трудно понять, что Мэйер компенсировал малую толщину сердечника большим количеством витков, тем самым увеличив индуктивность обмоток. Но сопротивление воды от этого не увеличится, поэтому и напряжение, о котором пишет Мэйер, не поднимется до описываемого в патентах значения.

С целью повышения КПД я решил «выкинуть» из схемы трансформатор, на котором происходит потеря энергии. Принципиальная электрическая схема Ячейки Мэйера без трансформатора представлена на рисунке.

.

Так как индуктивность катушки L1 очень маленькая, я так же исключил её из схемы. И «о чудо» установка стала выдавать сравнительно высокий КПД. Я провёл эксперименты и пришел к выводу, что на заданный объём газа установка затрачивает ту же самую энергию, что и при электролизе постоянным током, плюс-минус погрешность измерений. То есть я наконец собрал установку, в которой не происходит потерь энергии. Но зачем она нужна, если напрямую от аккумулятора точно такие же затраты энергии?

Завершение

Завершим тему очень маленького сопротивления воды. Сама Ячейка не способна работать в качестве накопительного конденсатора потому, что вода, которая выступает в качестве диэлектрика конденсатора, быть им не может – она проводит ток. Для того, чтобы над ней совершался процесс электролиза – разложения на кислород и водород, она должна быть проводящей. Получается неразрешимое противоречие, которое возможно разрешить только по одному пути: Отказаться от версии «Ячейка-конденсатор». Накопления в Ячейке подобно конденсатору происходить не может, это Миф! Если учитывать площадь обкладок конденсатора образованного поверхностями трубок, то даже при воздушном диэлектрике ёмкость ничтожно мала, а здесь в качестве диэлектрика выступает вода со своим малым активным сопротивлением. Не верите? Возьмите учебник физики и посчитайте ёмкость.

Можно предположить, что накопление происходит на катушке L1, но этого также не может быть по той причине, что её индуктивность также очень мала для частоты порядка 10 кГц. Индуктивность трансформатора на несколько порядков выше. Можно даже задуматься над тем, зачем её с малой индуктивностью вообще «воткнули» в схему.

Послесловие

Кто-то скажет, что всё чудо в бифилярной намотке. В том виде, в каком она представлена в патентах Мэйером, толку от неё не будет. Бифилярная намотка применяется в защитных фильтрах питания, не одного и того же проводника, а противоположных по фазе и предназначена для подавления высоких частот. Она даже имеется во всех без исключения блоках питания компьютеров и ноутбуков. А для одного и того же проводника, бифилярная намотка делается в проволочном резисторе, для подавления индуктивных свойств самого резистора. Бифилярная намотка может использоваться в качестве фильтра, защищающего выходной транзистор, не пропускающего мощные СВЧ-импульсы в схему генератора, подаваемые от источника этих импульсов непосредственно на Ячейку. Кстати и катушка L1 является отличным фильтром для СВЧ. Первая схема импульсного генератора, которая использует повышающий трансформатор – правильная, только чего-то не хватает между транзистором VT3 и самой Ячейкой. Этому я посвящу следующую статью.

Экология познания. Наука и техника: Ячейка Мейера – устройство, расходующее малое количество электрической энергии, и производящее из обыкновенной воды большое количество водородно-кислородной смеси (газ Брауна).

Очевидно, что изобретатель из США Стэнли Мэйер разработал электрическую ячейку, которая позволяет разделять обыкновенную водопроводную воду на водород и кислород с гораздо меньшей затратой энергии, чем требуется при обычном электролизе.

Демонстрации проводились и прежде профессором Michael Laughton, Dean из Engineering при Колледже Королевы Mary, Лондон, Адмирал Сэр Anthony Griffin, бывший командующий британским Флотом, и Д-ром Keith Hindley, английским химиком-исследователем. Ячейка Мэйер, сделанная дома изобретателем в Grove City, Огайо, производила гораздо больше водородо-кислородной смеси, чем могло ожидаться при простом электролизе.

В то время как обычный элекролиз воды требует тока, измеряемого в амперах, ячейка Мэйер производит тот же эффект при милиамперах. Более того, обыкновенная водопроводная вода требует добавления электролита, например, серной кислоты, для увеличения проводимости; ячейка Мэйер действует при огромной производительности с чистой водой.

Согласно очевидцам, самым поразительным аспектом клетки Мэйер было то, что она оставалась холодной даже после часов производства газа.

Эксперименты Мэйера, которые он счел возможными представить к патентованию, заслужили серию патентов США, представленные под Секцией 101. Представление патента под этой секцией зависит от успешной демонстрации изобретения Патентному Рецензионному Комитету.

Клетка Мэйера имеет много общего с электролитической ячейкой, за исключением того, что она работает при высоком потенциале и низком токе лучше, чем другие методы. Конструкция проста. Электроды — отсылаем заинтересовавшихся к Мэйеру — сделаны из параллельных пластин нержавеющей стали, образующие либо плоскую, либо концентрическую конструкцию. Выход газа зависит обратно пропорционально расстоянию между ними; предлагаемое патентом расстояние 1.5 мм дает хороший результат.

Значительные отличия заключаются в питании ячейки. Мэйер использует внешнюю индуктивность, которая образует колебательный контур с емкостью ячейки, — чистая вода, по-видимому, обладает диэлектрической проницаемостью около 81, — чтобы создать параллельную резонансную схему. Она возбуждается мощным импульсным генератором, который вместе с емкостью ячейки и выпрямительным диодом составляет схему накачки. Высокая частота импульсов производит ступенчато поднимающийся потенциал на электродах ячейки до тех пор, пока не достигаеся точка, где молекула воды распадается и возникает кратковременный импульс тока. Схема измерения тока питания выявляет этот скачок и запирает источник импульсов на несколько циклов, позволяя воде восстановиться.

Химик-исследователь Keith Hindley предлагает следующее описание демонстрации ячейки Мэйера: «После дня презентаций, Griffin комитет засвидетельствовал ряд важных свойств WFC (водяная топливная ячейка, как назвал ее изобретатель).

Группа очевидцев независимых научных наблюдателей Великобритании свидетельствовала что американский изобретатель, Стэнли Мэйер, успешно разлагает обыкновенную водопроводную воду на составляющие элементы посредством комбинации высоковольтных импульсов, при среднем потреблении тока, измеряемого всего лишь милиамперами. Зафиксированный выход газа был достаточным, чтобы показать водородно-кислородное пламя, которое мгновенно плавило сталь.

По сравнению с обычным сильноточным электролизом, очевидцы констатировали отсутствие какого-либо нагревания ячейки. Мэйер отказался прокомменировать подробности, которые бы позволили ученым воспроизвести и оценить его «водяную ячейку». Однако, он представил достаточно детальное описание американскому Патентному Бюро, чтобы убедить их, что он может обосновать его заявку на изобретение.

Одна демонстрационная ячейка была снабжена двумя параллельными электродами возбуждения. После наполнения водопроводной водой, электроды генерировали газ при очень низких уровнях тока — не больше, чем десятые доли ампера, и даже милиамперы, как заявляет Мэйер, — выход газа увеличивался, когда элекроды сдвигались более близко, и уменьшался, когда они отодвигались. Потенциал в импульсе достигал десятков тысяч вольт.

Вторая ячейка содержала 9 ячеек с двойными трубками из нержавеющей стали и производила намного больше газа. Была сделана серия фотографий, показывающая производство газа при милиамперном уровне. Когда напряжение было доведено до предельного, газ выходил в очень впечатляющем количестве.

«Мы обратили внимание, что вода вверху ячейки медленно стала окрашиваться от бледно-кремового до темно-коричневого цвета, мы почти уверены в влиянии хлора в сильно хлорированной водопроводной воде на трубки из нержавеющей стали, использованные для возбуждения».

Он продемонстрировал производство газа при уровнях милиампер и киловольт.

«Самое замечательное наблюдение — это то, что WFC и все его металлические трубки остались совершенно холодные на ощупь, даже после более чем 20 минут работы. «Раскалывающий молекулы» механизм развивает исключительно мало тепла по сравнению с элекролизом, где элекролит нагревается быстро.»

Результат позволяет рассмотреть эффективное и управляемое производство газа, которое быстро возникает, и безопасно в функционировании. Мы ясно увидели, как увеличение и уменьшение потенциала используется, чтобы управлять производством газа. Мы увидели, как поток газа прекращался и начинался вновь, соответственно когда напряжение на входе было выключено и вновь включено.»

«После часов обсуждения между собой, мы заключили, что Steve Мэйер явился, чтобы изобрести совершенно новый метод для разложения воды, которая обнаруживала некоторые черты классического элекролиза. Это подтверждается тем, что его устройства, реально работающие, взятые из его коллекции, удостоверены американскими патентами на разные части WFC системы. Так как они были представлены под Секцией 101 Патентным Бюро США, аппаратура, включенная в патентах, проверена экспериментально экспертами американского Патентного Бюро, их вторыми экспертами и все заявления были установлены.

» Основной WFC подвергался трехлетнему испытанию. Это подняло предоставленные патенты до уровня независимого, критического, научного и инженерного подтверждения того, что устройства фактически работают, как описано.»

Практическая демонстрация ячейки Мэйер»а является существенно более убедительной, чем псевдо-научный жаргон, который использован для объяснения. Изобретатель лично говорил об искажении и поляризации молекулы воды, приводящему к самостоятельному разрыву связи под действием градиента электрического поля, резонанса в пределах молекулы, который усиливает эффект.

Не считая обильного выделения кислорода и водорода и минимального нагревания ячейки, очевидцы также сообщают, что вода в внутри ячейки исчезает быстро, переходя в ее составные части в виде аэрозоли из огромного количества крошечных пузырей, покрывающих поверхность ячейки.

Мэйер заявил, что у него работает конвертер водородно-кислородной смеси в течение последних 4 лет, использующий цепочку из 6 цилиндрических ячеек. Он также заявил, что фотонное стимулирование пространства реактора светом лазера посредством оптоволокна увеличивает производство газа.

Дополнительные данные по водородной ячейке Мейера. Подключение.

Как упоминалось ранее, абсолютно очевидно принять все возможные меры предосторожности. «Гидрокси» газ производимый ячейкой – это смесь водорода и кислорода, смешанных в идеальной пропорции для рекомбинации в воду. Скорость фронта горения смеси в 1000 раз выше, чем скорость фронта горения паров бензина. Стандартные устройства часто просто не работают. Самое лучшее устройство защиты – бабблер (водный затвор). Он прост, легок в изготовлении и обслуживании. Высота водного столба е менее 150мм.

В идеале бабблер должен иметь плотно закрывающуюся крышку, если газ внутри загорится ее должно мгновенно сорвать. Некоторые люди между бабблером и кейсом ставят специальный вентиль – отсекатель, предотвращающий попадание большого давления обратно в ячейку.

Если вы намереваетесь использовать с двигателем внутреннего сгорания, тщательно отрегулируйте зажигание (Смотрите дополнительный материал).

Электронная схема для насоса не критична. Подойдет любая, которая включает насос, когда вода не достигает датчика и выключает когда достигает.

Вполне подойдет данная схема:

Если вы хотите использовать установку для отопления или приготовления пищи, имеется проблема. Водород горит с температурой, которую не выдерживает ни один металл. Стэн Мэйер решил эту проблему и запатентовал решение. Данное описание поможет вам преодолеть эти трудности:

Газ 72 попадает в горелку через вентиль 35. Горящий газ поднимается по вертикальной трубе 63 и затягивает за собой наружный воздух через отверстия 70 и 13, которые имеют скользящую крышку для контроля подачи. В чашке 40 собирается некоторое количество сгоревшего газа и возвращается назад через трубу 45 и смешивается с горящими газами в колонке горения. Регулировка подачи сгоревшего газа – вентиль 42. Большое количество сгоревшего газа (водяного пара) подается назад, что понижает температуру горения. Электрическое зажигание 20 упрощает розжиг.

Настройка ячейки.

Выключите первый генератор 555. Отрегулируйте частоту второго генератора по максимальному выходу газа. Дэйв Лоутон нашел, что на его ячейке Мэйера резонансные точки были около 3кГц и 6кГц.

Включите первый генератор 555. Отрегулируйте по максимальному выходу газа. Регулировку производимого объема газа можно регулировать широтой импульса.

Схема превышает максимум эффективности по Фарадею на 300%. Дальнейшие эксперименты показали, что индукторы, используемые Стэнли Мэйером играют важную роль в дальнейшем повышении эффективности. Дэйв Лоутон предложил добавить два индуктора по 100 витков эмалированного медного провода 22 SWG (21 AWG) (это диаметр примерно 0.6- 0.7мм) на ферритовом стержне диаметром 9 мм и длиной 25мм. Улучшенная схема:

Ферритовый стержень тот же (диаметр 9мм, длина 25мм.), провод тоже. Намотка бифилярная. Использовать ферритовое кольцо – наилучшее возможное решение. Трансформатор с бифилярной намоткой также может быть намотан на любой ферритовый стержень любого диаметра и длины (по обновленным данным).

Дальнейшее развитие системы:

Когда мы производим гидрокси газ из воды, невозможно превысить Фарадеевский максимум без притока дополнительной энергии извне. Поскольку ячейка остается холодной, имеется большой объем производимого газа, что указывает на наличие этого эффекта. Сама идея захвата энергии из окружающего пространства базируется на очень коротком импульсе с идеальной, очень крутой характеристикой подъема и спада формы импульса. Эта дополнительная энергия называется «холодным электричеством», поскольку имеет характеристики отличные от обычного электричества. При прохождении через проводник последний нагревается и на нем «теряется» часть энергии в виде тепла. У холодного электричества противоположный эффект: проводник охлаждается в результате притока энергии извне. Ниже дано дальнейшее улучшение схемы. Заметьте, лампочка 12 вольт 10 Ватт ярко светится, ток потребления остался прежним, выход гидрокси не уменьшился!

Диоды Зенера 150 Вольт 10 Ватт- защита транзистора от пробоя на случай короткого замыкания.

Ячейка Мэйера или Вода вместо бензина

Эта статья на тему Ячейки Мэйера (Майера) явилась началом моих исследований в возможности разложения воды на водород и кислород, для их дальнейшего использования в качестве топливного газа. Например, вместо бензина в двигателях внутреннего сгорания, или топливного газа, используемого для обогрева домов и помещений. Я не являюсь автором этой статьи, Вы можете найти её на различных других сайтах. Она носит больше ознакомительный характер, нежели научно-познавательный, поскольку в ней практически нет информативного материала. Но именно с этой статьи начинались исследования, или эксперименты у многих «Кулибиных». Я так же не стал исключением.
Грамотный инженер прочитав статью, поймёт «бестолковость» этой статьи и захочет прочесть, что ни будь интеллектуальней, и более похожее на правду. Глупец, торопящийся быстрее сделать водородный генератор и не желающий разобраться в сути вопроса, примет эту статью за «чистую монету» и начнёт свои «антинаучные» эксперименты, на что потратит ещё больше времени и в конце концов будет разочарован. Публикую её, без каких либо изменений для того, чтобы было понятно, о чём ведётся речь в других моих статьях посвященных Ячейке Мэйера. Но крайне не рекомендую на основе только этой статьи о Ячейке Мэйера, делать преждевременные выводы о возможностях создания двигателя на воде. Тому, кто действительно желает создать водородный генератор, я советую прочитать остальные статьи моего сайта, посвящённые Ячейке Мэйера, автором которых являюсь я лично. Я думаю, этот посетитель сайта не будет разочарован изложенным в моих статьях материалом.
О себе: Я не мотаю «бифилярных» катушек надеясь на чудо, как многие другие «балбесы». Своё мнение я стараюсь обосновать научно, не верить тому, что написано «на заборе». Любая информация должна подтверждаться существующими физическими законами, правилами, или хотя бы быть авторитетной. Я не верю «скользким авторитетным» научным деятелям, про исследования которых пишут в Интернете, если научность их открытий или наблюдений, кроме самой статьи без формулировок ничем не подтверждается. Например, мне недавно написали на Майл об активации воды по технологии MRET. Я статью читал ранее, она меня не заинтересовала лишь потому, что про М.В. Курика, Н.Д. Девяткова, В.И. Петросяна я не слышал ранее, и в статье отсутствуют какие либо обоснования их наблюдений. Попытки найти, что либо вразумительное по технологии MRET, ничем толковым не закончились, чистой воды РЕКЛАМА, рассчитанная на заработок авторов сайтов и продавцов фильтров, не более того. Я изменю своё мнение об этих людях и об их работах лишь тогда, когда найду об этом более менее «достойный» материал.
Это было вступление, а теперь обещанная статья о Ячейке Мэйера, которая собственно называется «Вода вместо бензина» и которая стала предлогом для моих исследований:
Обычный электролиз воды требует тока, измеряемого в амперах, ячейка Мэйера производит тот же эффект при миллиамперах. Более того, обыкновенная водопроводная вода требует добавления электролита, например, серной кислоты, для увеличения проводимости, ячейка Мэйер действует при огромной производительности с чистой водой.
Согласно очевидцам, самым поразительным аспектом клетки Мэйер было то, что она оставалась холодной даже после часов производства газа.
Эксперименты Мэйер, которые он счел возможными представить к патентованию, заслужили серию патентов США, представленные под Секцией 101. Представление патента под этой секцией зависит от успешной демонстрации изобретения Патентному Рецензионному Комитету.
Клетка Мэйера имеет много общего с электролитической ячейкой, за исключением того, что она работает при высоком потенциале и низком токе лучше, чем другие методы. Конструкция проста.
Электроды — отсылаем заинтересовавшихся к Мэйеру — сделаны из параллельных пластин нержавеющей стали, образующие либо плоскую, либо концентрическую конструкцию. Выход газа зависит обратно пропорционально расстоянию между ними; предлагаемое патентом расстояние 1,5 мм дает хороший результат.
Значительные отличия заключаются в питании ячейки. Мэйер использует внешнюю индуктивность, которая образует колебательный контур с емкостью ячейки, — чистая вода, по-видимому, обладает диэлектрической проницаемостью около 5, — чтобы создать параллельную резонансную схему.
Она возбуждается мощным импульсным генератором, который вместе с емкостью ячейки и выпрямительным диодом составляет схему накачки. Высокая частота импульсов производит ступенчато поднимающийся потенциал на электродах ячейки до тех пор, пока не достигается точка, где молекула воды распадается и возникает кратковременный импульс тока.
Схема измерения тока питания выявляет этот скачок и запирает источник импульсов на несколько циклов, позволяя воде восстановиться.
Химик-исследователь Keith Hindley предлагает следующее описание демонстрации ячейки Мэйера: «После дня презентаций, Griffin комитет засвидетельствовал ряд важных свойств WFC (водяная топливная ячейка, как назвал ее изобретатель).
Группа очевидцев независимых научных наблюдателей Великобритании свидетельствовала, что американский изобретатель, Стэнли Мэйер, успешно разлагает обыкновенную водопроводную воду на составляющие элементы посредством комбинации высоковольтных импульсов, при среднем потреблении тока, измеряемого всего лишь миллиамперами.
Зафиксированный выход газа был достаточным, чтобы показать водородно-кислородное пламя, которое мгновенно плавило сталь.
По сравнению с обычным сильноточным электролизом, очевидцы констатировали отсутствие какого-либо нагревания ячейки. Мэйер отказался прокомментировать подробности, которые бы позволили ученым воспроизвести и оценить его «водяную ячейку«. Однако, он представил достаточно детальное описание американскому Патентному Бюро, чтобы убедить их, что он может обосновать его заявку на изобретение.
Одна демонстрационная ячейка была снабжена двумя параллельными электродами возбуждения. После наполнения водопроводной водой, электроды генерировали газ при очень низких уровнях тока — не больше, чем десятые доли ампера, и даже миллиамперы, как заявляет Мэйер, — выход газа увеличивался, когда электроды сдвигались более близко, и уменьшался, когда они отодвигались. Потенциал в импульсе достигал десятков тысяч вольт.
Вторая ячейка содержала 9 ячеек с двойными трубками из нержавеющей стали и производила намного больше газа. Была сделана серия фотографий, показывающая производство газа при миллиамперном уровне. Когда напряжение было доведено до предельного, газ выходил в очень впечатляющем количестве.
«Мы обратили внимание, что вода вверху ячейки медленно стала окрашиваться от бледно-кремового до темно-коричневого цвета, мы почти уверены в влиянии хлора в сильно хлорированной водопроводной воде на трубки из нержавеющей стали, использованные для возбуждения».
Он продемонстрировал производство газа при уровнях миллиампер и киловольт.
«Самое замечательное наблюдение — это то, что WFC и все его металлические трубки остались совершенно холодные на ощупь, даже после более чем 20 минут работы. «Раскалывающий молекулы» механизм развивает исключительно мало тепла по сравнению с электролизом, где электролит нагревается быстро.»
Результат позволяет рассмотреть эффективное и управляемое производство газа, которое быстро возникает, и безопасно в функционировании. Мы ясно увидели, как увеличение и уменьшение потенциала используется, чтобы управлять производством газа. Мы увидели, как поток газа прекращался и начинался вновь, соответственно когда напряжение на входе было выключено и вновь включено.»
«После часов обсуждения между собой, мы заключили, что Steve Мэйер явился, чтобы изобрести совершенно новый метод для разложения воды, которая обнаруживала некоторые черты классического электролиза. Это подтверждается тем, что его устройства, реально работающие, взятые из его коллекции, удостоверены американскими патентами на разные части WFC системы.
Так как они были представлены под Секцией 101 Патентным Бюро США, аппаратура, включенная в патентах, проверена экспериментально экспертами американского Патентного Бюро, их вторыми экспертами и все заявления были установлены.»
«Основной WFC подвергался трехлетнему испытанию. Это подняло предоставленные патенты до уровня независимого, критического, научного и инженерного подтверждения того, что устройства фактически работают, как описано.»
Практическая демонстрация ячейки Мэйера является существенно более убедительной, чем псевдонаучный жаргон, который использован для объяснения. Изобретатель лично говорил об искажении и поляризации молекулы воды, приводящему к самостоятельному разрыву связи под действием градиента электрического поля, резонанса в пределах молекулы, который усиливает эффект.
Не считая обильного выделения кислорода и водорода и минимального нагревания ячейки, очевидцы также сообщают, что вода в внутри ячейки исчезает быстро, переходя в ее составные части в виде аэрозоли из огромного количества крошечных пузырей, покрывающих поверхность ячейки.
Мэйер заявил, что у него работает конвертер водородно-кислородной смеси в течение последних 4 лет, использующий цепочку из 6 цилиндрических ячеек. Он также заявил, что фотонное стимулирование пространства реактора светом лазера посредством оптоволокна увеличивает производство газа.

Описание изобретения

Это изобретение описывает топливную камеру и процесс, в котором молекулы воды разбиваются на водород и кислород, и другие, растворенные в воде газы. Здесь и далее используется термин «топливная ячейка», относящийся к данному изобретению, содержащему конденсаторную водяную камеру, которая, как будет объяснено далее, вырабатывает топливный газ в соответствии с описанным методом.
Краткое описание рисунков

РИСУНОК 1 Иллюстрирует теоретические основы явлений, наблюдаемых во время функционирования изобретения.
РИСУНОК 2 Иллюстрирует схему, используемую в процессе.
РИСУНОК 3 Блок схема.
РИСУНОК 4 Показывает «водяной конденсатор» в перспективе.
Описание лучшей реализации

Кратко, изобретение представляет собой метод получения смеси водорода и кислорода и других растворенных в воде газов.

Процесс заключается в следующем:

(A) конденсатор, в котором вода заключена в качестве диэлектрической жидкости между обкладками, включенный в последовательную резонансную схему с дросселем;
(B) к конденсатору прикладывается пульсирующее однополярное напряжение, в котором полярность никак не связана с внешним заземлением, благодаря чему молекулы воды в конденсаторе подвержены заряду той же полярности и молекулы растягиваются под действием электрических полярных сил;
(C) подбирают частоту импульсов, поступающих на конденсатор, соответствующую собственной частоте резонанса молекулы;
(D) продолжительное действие импульсов в режиме резонанса приводит к тому, что уровень колебательной энергии молекул возрастает с каждым импульсом;
(E) комбинация пульсирующего и постоянного электрического поля приводит к тому, что в некоторый момент сила электрической связи в молекуле ослабляется настолько, что сила внешнего электрического поля превосходит энергию связи, и атомы кислорода и водорода освобождаются как самостоятельные газы;
(F) сбор готовой к употреблению смеси кислорода, водорода и других растворенных в воде газов в качестве топлива.
Последовательность процессов показана в следующей Таблице 1, в которой молекулы воды подвергаются увеличению электрических сил. В обычном состоянии, наугад ориентированные молекулы воды выравниваются по отношению к внешнему полю.
Конструкционные параметры, основанные на знании теоретических принципов, позволяют рассчитать энергию постоянного и импульсного тока, необходимого для разложения воды.
ТАБЛИЦА 1
——————————————————————-
Последовательность состояний молекулы воды и/или водорода/кислорода/других атомов:
——————————————————————-
A. случайное
B. ориентация молекул вдоль силовых линий поля
C. поляризация молекулы
D. удлинение молекулы
E. разрыв ковалентной связи
F. освобождение газов

рис.1

Оптимальный выход газа достигается в резонансной схеме. Частота подбирается равной резонансной частоте молекул.
Для изготовления пластин конденсатора отдается предпочтение нержавеющей стали марки T-304, которая не взаимодействует с водой, кислородом и водородом.
Начавшийся выход газа управляется уменьшением эксплуатационных параметров. Поскольку резонансная частота фиксирована, производительностью можно управлять с помощью изменения импульсного напряжения, формы или количества импульсов.

рис.2

рис.3

Повышающая катушка намотана на обычном тороидальном ферритовом сердечнике 1.50 дюйма в диаметре и 0.25 дюйма толщиной. Первичная катушка содержит 200 витков 24 калибра, вторичная 600 витков 36 калибра.
Диод типа 1N1198 служит для выпрямления переменного напряжения. На первичную обмотку подаются импульсы скважности 2. Трансформатор обеспечивает повышение напряжения в 5 раз, хотя оптимальный коэффициент подбирается практическим путем.
Дроссель содержит 100 витков калибра 24, в диаметре 1 дюйм. В последовательности импульсов должен быть короткий перерыв.
Через идеальный конденсатор ток не течет. Рассматривая воду как идеальный конденсатор, убеждаемся, что энергия не будет расходоваться на нагрев воды.
Реальная вода обладает некоторой остаточной проводимостью, обусловленной наличием примесей. Идеально, если вода в ячейке будет химически чистой. Электролит к воде не добавляется.
В процессе электрического резонанса может быть достигнут любой уровень потенциала. Как отмечалось выше, емкость зависит от диэлектрической проницаемости воды и размеров конденсатора.

рис.4

В примере схемы РИСУН. 1 два концентрических цилиндра 4 дюймов длиной составляют конденсатор. Расстояние между поверхностями цилиндров 0.0625 дюйма. Резонанс в схеме был достигнут при импульсе 26 вольт, приложенном к первичной обмотке. В любой резонансной схеме при достижении резонанса ток минимален, а выходное напряжение максимально. Расчет резонансной частоты традиционный.
Вторую индуктивность подстраивают в зависимости от чистоты воды так, чтобы потенциал, приложенный к воде, был постоянен. Расход воды контролируется любым подходящим способом.
Примечание
Диод 1N1198 можно заменить на NTE5995 или ECG5994. Это импульсные диоды на 40 ампер 600 вольт (40 А — куда столько?!). Нержавеющая сталь T304 великолепна, но другие типы должны работать так же. T304 просто более доступна. Внешняя трубка подгоняется под размер 3/4 дюйма 16 калибра (толщина стенки 0.06 дюйма), длиной 4 дюйма. Внутренняя трубка диаметром 1/2 дюйма 18 калибра (стенка 0.049 дюйма, это приблизительный размер для этой трубки, фактический калибр не может быть вычислен из патентной документации, но этот размер должен работать), 4 дюйма длиной. Вам потребуется присоединить два проводника к трубкам. Используйте для этого нержавеющие стержни и БЕСКИСЛОТНЫЙ ПРИПОЙ! (когда-нибудь эта вода все равно вернется в ваш водопроводный кран).
Вы должны также предусмотреть, чтобы трубки были разделены. Это можно сделать с помощью небольшого куска пластика. Он не должен препятствовать свободному прохождению воды. Не указано, должна ли быть вода внутри трубки. Думается, что она там есть, но это совершенно не влияет на работу прибора.
Частота не была напечатана, исходя из размера катушек и трансформатора, частота не превышает 50 Mhz. Не упирайтесь в этот факт, это всего лишь моя догадка
В прочитанной Вами статье содержится огромное количество «сказочной» информации. Почему это произошло, кто нас пытается запутать и что действительно заслуживает внимания?

Нетрадиционные источники энергии — Главная страница

Энергетические запасы на Земле не бесконечны…

Новый Век несет новые Источники Энергии!..

Но, есть у Прогресса тормоз — Алчность Старого Мира…

Каждый Божий день мы платим за Нефть, уголь и газ. Чтобы у нас в квартире было тепло и светло, чтобы наши машины ездили по дорогам. Каждый Божий день через телевидение и радио нам внушается, что эффективных источников энергии на Свете больше нет!!! Это основная ложь, которая является нашим лозунгом жизни. Уже на сегодняшний день сделано огромное число открытий в сфере свободной энергии, вот только распространять такую информацию и тем более воплотить всячески мешают люди, которые каждый день кормят вас НЕФТЬЮ, ГАЗОМ и УГЛЕМ! Даже из обычной воды, которой на Земле больше чем суши, топливо 100 раз превосходящее бензин по всем параметром! А если взять открытия Великого ученого Н. Тесла, то энергию можно черпать прямо из окружающей среды!

После двух летнего иследования патентов С. Мейера в лаболатории нашего факельтета, мой автомобиль ездит на воде используя эффективный электролиз! Я решил распространить эту технологию в интернете, т.к. в реале продвижение ей не дают!

Все у кого руки на месте качаем и ездим на бесплатном, чистом топлеве!!!

В архивах Вы найдете все от демонстрационного видео до схем и чертежей работающих технологий свободной энергии!

1.Краткое содержание документов

2.Теория Эфира и ее применение на практике.

3.Трансформатор Тесла как источник энергии

4.Эфективный электролиз воды

5.Ячейка Майера

6.Патенты Майера

7.Вода вмето бензина

8.Установка ячейки на двигателе внутреннего сгорания

9.Домашнее отопление своими руками с помощью эффективного электролиза воды

10.Теория магнитного тока

11.Магнитные генераторы различных изобретателей

12.Электро статические генераторы

13.Эфективное Использование силы воды

и многое другое

Подробное описание процессов

Качаем с Депозита

Всем Удачи!!!

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Клиническое проявление метастазов в отдаленных органах представляет собой завершающую стадию прогрессирования рака и составляет более 90% смертей, связанных с раком¹. Переход от локализованного к метастатическим заболеванием является многоступенчатый процесс, часто опосредованный циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК)^2,3,4. Эти клетки сбрасывают из первичной опухоли в кровообращение и транспортируются в отдаленные органы, где они могут экстратравате и установить метастатические поражения^5,6. Хотя твердые опухоли могут выпустить относительно большое количество ЦОК, большинство ЦОК суждено умереть, из-за высокой силы сдвига в обращении, аноки-опосредованной клеточной смерти, иммунного нападения или ограниченные возможности, чтобы адаптироваться к иностранной микросреде⁷. Таким образом, это имеет решающее значение для создания инструментов, которые позволяют рассечение молекулярных особенностей тех, ЦОК, которые наделены с метастазами-посевной способности. Недавние доклинические и клинические исследования показывают, что наличие и количество единичных ЦОК и КТК кластеров связано с худшим результатом у пациентов с различными типами твердых опухолей^{8,9,10,11,12,13,14} -ое . КТК кластеры группы из двух или более ЦВК, прилагаемый друг к другу во время циркуляции и более эффективны в формировании метастазов по сравнению с одной ЦОК^3,15,16. Ячейки внутри кластера поддерживают сильную адгезианию клеток через десмоссомы и адхеренс соединения, которые могут помочь преодолеть анаикис^17,18. В последнее время мы наблюдали, что кластеризация ЦОК связано с гипомеэтилляции сайтов связывания для штемфее и связанных с распространением транскрипционных факторов, что приводит к увеличению способности успешно инициировать метастазирование¹⁹. СТС кластерной диссоциации приводит к реконструкции ключевых сайтов связывания, и, следовательно, подавление их метастатического потенциала¹⁹. Дополнительно к кластерам раковых клеток, ЦОК также может ассоциировать с лейкоцитов (чаще всего нейтрофилов) для поддержания высокого уровня распространения в обращении и увеличить их метастатическим потенциалом²⁰. Тем не менее, биология ЦОК понимается только в части и несколько вопросов остаются открытыми, в том числе основные молекулярные особенности и уязвимости отдельных и кластерных клеток.

В последние годы было создано несколько стратегий, которые используют шаблоны выражения клеточной поверхности, а также физические свойства ЦВК для их изоляции^{21,22,23,24,25}. антиген-зависимые методы изоляции опираются в основном на экспрессию клеточной поверхности клеток эпителиальной адгезии (EpCam)²⁶. Наиболее часто используемой и (в настоящее время) единственной одобренной FDA платформой для перечисления КТК является система CellSearch, которая основывается на двухэтапной процедуре для изолирования ЦОК²¹. На первом этапе плазменные компоненты удаляются с помощью центрифугирования, в то время как ЦОК улавливания с магнитной фермофлюидов в сочетании с анти-EpCAM антител. На втором шаге раствор, обогащенный КТК, окрашивается для нуклеажных (DAPI-положительных) клеток, выражающих цитокератин (CK)^8,18,19, в то время как белые кровяные тельца (лейкоциты) идентифицируются с использованием Пан-лейкоцитарный маркер CD45. Наконец, захваченные клетки помещаются на интегрированной платформе скрининга и ЦОК идентифицируются через выражение EpCAM, Рикс, и DAPI, будучи отрицательным для CD45. Несмотря на то, что это считается золотым стандартом для перечисления КТК, молекулярный анализ ниже по течению является сложной задачей с помощью этой технологии из-за присущих им ограничений поиска КТК. Кроме того, с учетом его процедуры изоляции, CellSearch может способствовать обогащению ЦОК с более высокими уровнями EpCAM по сравнению с ЦОК с более низким EpCAM выражение, из-за, например, гетерогенность рака²⁷ или Даунрегуляция эпителиальных маркеров ^28,29. Для преодоления этих ограничений появились антиген-независимые технологии обогащения ЦОК. Например, «СТС-чип» интегрирует гидродинамическая разделение нуклеированных ячеек, включая ЦВК и лейкоциты из оставшихся компонентов крови, а затем иммуномагнетик истощение антител, отмеченных лейкоцитов, что позволяет очистить немаркированные и жизнеспособные ЦОК в решение²⁵. Кроме того, тот факт, что большинство ЦОК немного больше, чем красных кровяных телец (эритроцитов) или лейкоцитов привело к развитию на основе размера КТК технологий обогащения^23,30 (например, система парсоркс (угол)), которая делает использование микрофлюидическая технология, включающая сужение канала через разделение кассеты, ведущие ячейки к терминальным пробелом 10, 8, 6,5 или 4,5 мкм (различные размеры доступны в зависимости от ожидаемого диаметра целевых раковых клеток). Большая часть клеток крови проходит через узкий зазор, в то время как ЦОК попадают в ловушку из-за их размера (но также из-за их нижней деформируемого) и, следовательно, сохраняются в кассете. Возврат направления потока позволяет выпустить захваченные ЦОК, которые находятся в жизнеспособное состояние и подходит для нисходящего анализа. Независимо от выбранного протокола для изоляции КТК, однако, типичные после обогащения процедуры по-прежнему дают ЦВК, которые смешиваются с относительно небольшим числом эритроцитов и кровяных телец, что делает анализ чистой одной или объемных ЦОК сложным. Для решения этой проблемы, мы создали рабочий процесс, который позволяет КТК манипуляции без потенциальной предвзятости, введенных загрязняющих клеток крови. Добавление иммуноокрашивания заранее, с переменными антителами-комбинациями, отличает ЦОК от клеток крови и даже позволяет идентифицировать КТК подгрупп с отдельными поверхностными маркером выражения профилей. Эта высоко настраиваемая процедура может быть затем дополнительно объединено с конкретными нижестоящих приложениями.

Здесь мы описываем рабочий процесс, который начинается с продуктов, обогащенных КТК (полученных с помощью любой технологии по обогащению КТК), и сочетает в себе несколько подходов для получения понимания СТС биологии при разрешении одной ячейки. В двух словах, наш рабочий процесс позволяет идентификации одного ЦОК, СТС кластеров и КТК-WBC кластеров в прямом эфире иммуноокрашивания, а затем одноклеточных микроманипуляции и нисходящего анализа с использованием ex естественных условиях культивирования протоколов, одной ячейки последовательности, и в естественных условиях метастазов анализов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

CSS — каскадные таблицы стилей — Подробное руководство

Название: CSS — каскадные таблицы стилей — Подробное руководство.

Автор: Мейер Э.

2008.

     Третье издание «CSS- каскадные таблицы стилей. Подробное руководство» показывает, как реализовать на практике все возможности каскадных таблиц стилей для стандартов CSS2 и СSS2.1. Множество примеров позволят научиться быстро и без усилий разрабатывать стилевое оформление веб-страниц, отвечающее современным требованиям.
Эрнк Мейер, признанный эксперт по CSS, HTML и веб-стандартам, опираясь иа свой богатейший опыт, рассматривает все свойства CSS и их взаимодействие, теги, атрибуты, реализации, поддержку различными браузерами, дает рекомендации разработчикам* Вы узнаете о сложном стилевом оформлении документов, пользовательском интерфейсе, верстке таблиц, о списках н генерируемом содержимом, о свободном перемещении и позиционировании, о семействах шрифтов и механизмах резервирования, о том, как работает модель блоков, о новых селекторах CSS3, поддерживаемых IE7, Firefox и другими браузерами. Книга поможет избежать распространенных ошибок, она является полным справочником по CSS и будет полезна как опытному веб-разработчику, так и новичку. От читателя потребуется только знание HTML 4.0.

     Если вы веб-дизайнер, разработчик веб-страниц и вас интересуют сложные стили оформления страниц, улучшение их восприятия и экономия времени и усилий, эта книга — для вас. Все, что надо для начала, — это неплохое знание HTML 4.0. Чем лучше вы знаете HTML, тем лучше вы подготовлены к чтению книги. Что касается остальных знаний и умений, для работы с этой книгой достаточно базового уровня,
Третье издание книги «CSS — каскадные таблицы стилей. Подробное руководство» посвящено стандартам CSS2 и CSS2.1 (вплоть до рабочего проекта, вышедшего 11 апреля 2006 года), последний из которых во многом представляет собой дополненную версию первого. Несмотря на то что некоторые части CSS3 получили статус предварительной рекомендации, в этом издании я решил их не рассматривать (за исключением некоторых селекторов CSS3), потому что реализация соответствующих модулей до сих пор не завершена или ее попросту нет. Я считаю, что сейчас важно сосредоточиться на поддерживаемых в настоящий момент и хорошо понятных уровнях CSS, а все грядущие возможности лучше оставить для последующих изданий.

Оглавление
Введение
1.CSS и документы
Веб спускается с Олимпа
CSS спешит на помощь
Элементы
Объединение CSS и XHTML
Заключение
2. Селекторы
Основные правила
Группировка
Селекторы классов и идентификаторов
Селекторы атрибутов
Использование структуры документа
Псевдоклассы и псевдоэлементы
Заключение
3. Структура и каскад
Специфичность
Наследование
Каскад
Заключение
4. Значения и единицы измерения
Числа
Процентные значения
Цвет
Единицы измерения длины
URL
Единицы измерения CSS2
Заключение
5. Шрифт
Семейства шрифтов
Насыщенность шрифта
Размер шрифта
Стили и варианты
Растяжение и корректировка шрифтов
Свойство font
Сопоставление шрифтов
Заключение
6. Свойства текста
Отступы и горизонтальное выравнивание
Вертикальное выравнивание
Расстояние между буквами и словами
Преобразование текста
Оформление текста
Затенение текста
Заключение
7.Основы модели визуального форматирования
Основные блоки
Блочные элементы
Строковые элементы
Изменение представления элемента
Заключение
8. Отступы, рамки и поля
Основные блоки элементов
Поля
Рамки
Отступы
Заключение
9. Цвета и фон
Цвета
Основные цвета
Фон
Заключение
10. Свободное перемещение и позиционирование
Свободное перемещение
Позиционирование
Заключение
11. Верстка таблиц
Форматирование таблиц
Рамки ячеек таблицы
13.Стили пользовательского интерфейса
Системные шрифты и цвета
Курсоры
Контуры
Заключение
14.Неэкранные устройства
Разработка зависящих от среды таблиц стилей
Устройства с постраничной разбивкой
Стили аудиопредставления
Заключение
A. Обзор свойств
B. Обзор селекторов, псевдоклассов и псевдоэлементов
С  Пример таблицы стилей HTML 4
Алфавитный указатель

Купить книгу CSS — каскадные таблицы стилей — Подробное руководство — Мейер Э. —

Купить книгу CSS — каскадные таблицы стилей — Подробное руководство — Мейер Э.

По кнопкам выше и ниже «Купить бумажную книгу» и по ссылке «Купить» можно купить эту книгу с доставкой по всей России и похожие книги по самой лучшей цене в бумажном виде на сайтах официальных интернет магазинов Лабиринт, Озон, Буквоед, Читай-город, Литрес, My-shop, Book24, Books.ru.

По кнопке «Купить и скачать электронную книгу» можно купить эту книгу в электронном виде в официальном интернет магазине «ЛитРес», и потом ее скачать на сайте Литреса.

По кнопке «Найти похожие материалы на других сайтах» можно найти похожие материалы на других сайтах.

On the buttons above and below you can buy the book in official online stores Labirint, Ozon and others. Also you can search related and similar materials on other sites.

Дата публикации: 28.08.2011 07:17 UTC

Теги: учебник по веб-дизайну :: CSS :: HTML :: Мейер :: верстка таблиц

---

Смотрите также учебники, книги и учебные материалы:

Следующие учебники и книги:

Предыдущие статьи:

---

Клинические исследование Хронический ишемический инсульт: Имплант SB623 (2,5 м), Имплантат SB623 (5,0 м), Ложная хирургия — Реестр клинических исследований

Расположение

Объект: University of Alabama at Birmingham (Surgical/Assessment) | Birmingham, Alabama, 35233, United States University of Alabama at Birmingham | Birmingham, Alabama, United States Xenoscience, Inc. (Assessment) | Phoenix, Arizona, 85004, United States The Research Center of Southern California (Assessment) | Carlsbad, California, 92011, United States Rancho Los Amigos National Rehab Center | Downey, California, 90242, United States Neuro-Pain Medical Center (Assessment) | Fresno, California, 93710, United States Neuro Pain Medical Center | Fresno, California, 95710, United States University of California Irvine | Irvine, California, United States Ronald Reagan UCLA Medical Center (Assessment/Surgical) | Los Angeles, California, 90095, United States UCLA Medical Center | Los Angeles, California, United States University of California Irvine (Assessment) | Orange, California, 92868, United States Westview Clinical Research (Assessment) | Placentia, California, 92870, United States Providence Saint John’s Health Center (Assessment) | Santa Monica, California, 90404, United States Providence St. John’s Health Center (Surgical) | Santa Monica, California, 90404, United States Providence St. Johns Health Center | Santa Monica, California, United States Stanford Health Care (Surgical/Assessment) | Stanford, California, 94305, United States New England Institute for Clinical Research (Assessment) | Stamford, Connecticut, 06905, United States MedStar National Rehabilitation Hospital (Assessment) | Washington, District of Columbia, 20010, United States University of Miami Miller School of Medicine (Assessment/Surgical) | Miami, Florida, 33136, United States University of Miami Jackson Memorial Hospital | Miami, Florida, United States NeuroMedical Research Institute (Assessment) | Panama City, Florida, 32405, United States Medsol Clinical Research Center (Assessment) | Port Charlotte, Florida, 33952, United States Neurostudies, Inc. (Assessment) | Port Charlotte, Florida, 33952, United States University of South Florida (Assessment) | Tampa, Florida, 33606, United States Grady Memorial Hospital (Assessment) | Atlanta, Georgia, 30303, United States Emory University Hospital (Surgical) | Atlanta, Georgia, 30322, United States Center for Advanced Research and Education (Assessment) | Gainesville, Georgia, 30501, United States Northwestern Memorial Hospital (Surgical) | Chicago, Illinois, 60611, United States University of Chicago Medical Center (Assessment) | Chicago, Illinois, 60637, United States University of Chicago Medical Center (Surgical) | Chicago, Illinois, 60637, United States Rehabilitation Institute of Chicago | Chicago, Illinois, United States Consultants in Neurology, Ltd. (Assessment) | Northbrook, Illinois, 60062, United States OSF Saint Francis Healthcare System (Assessment) | Peoria, Illinois, 61637, United States Indiana Medical Research, Elkhart Clinic (Assessment) | Elkhart, Indiana, 46514, United States University of Kansas Medical Center (Surgical) | Kansas City, Kansas, 66160, United States Kansas Institute of Research (Assessment) | Overland Park, Kansas, 66211, United States University of Kentucky Hospital (Surgical) | Lexington, Kentucky, 40536, United States University of Louisville Clinical Trials Unit (Assessment) | Louisville, Kentucky, 40202, United States NeuroMedical Clinic of Central Louisiana (Assessment) | Alexandria, Louisiana, 71301, United States Beth Israel Deaconess Medical Center (Surgical) | Boston, Massachusetts, 02215, United States Wayne State University (Assessment) | Detroit, Michigan, 48201, United States Henry Ford Health System (Assessment) | Detroit, Michigan, 48202, United States Henry Ford Hospital | Detroit, Michigan, United States Rutgers New Jersey Medical School (Assessment) | Newark, New Jersey, 07013, United States New York University Langone Medical Center (Surgical/Assessment) | New York, New York, 10016, United States NYU Langone Medical Center | New York, New York, United States The Burke Rehabilitation Hospital (Assessment) | White Plains, New York, 10605, United States Carolinas Rehabilitation (Assessment) | Charlotte, North Carolina, 28203, United States Neurology and Neuroscience Associates, Inc. (Assessment) | Akron, Ohio, 44320, United States Neurology and Neuroscience Associates | Akron, Ohio, 44320, United States University Hospital Case Medical Center (Surgical) | Cleveland, Ohio, 44106, United States University of Toledo Medical Center (Assessment) | Toledo, Ohio, 43614, United States Moss Rehab (Assessment) | Elkins Park, Pennsylvania, 19006, United States Hospital of the University of Pennsylvania (Assessment) | Philadelphia, Pennsylvania, 19104, United States Pennsylvania Hospital (Surgical) | Philadelphia, Pennsylvania, 19106, United States Thomas Jefferson University Comprehensive Stroke Center (Assessment) | Philadelphia, Pennsylvania, 19107, United States Pennsylvania Hospital | Philadelphia, Pennsylvania, United States University of Pittsburgh Medical Center (Surgical/Assessment)) | Pittsburgh, Pennsylvania, 15213, United States Abington Neurological Associates (Assessment) | Willow Grove, Pennsylvania, 19090, United States Medical University of South Carolina (Surgical) | Charleston, South Carolina, 29425, United States Chattanooga Center for Neurologic Research (Assessment) | Chattanooga, Tennessee, 37403, United States University of Texas Medical School | Dallas, Texas, United States University of Texas Health Science Center at Houston (Assessment/Surgical) | Houston, Texas, 77030, United States West Virginia University Hospitals (Assessment) | Morgantown, West Virginia, 26506, United States West Virginia University | Morgantown, West Virginia, 26506, United States

Мартин Мейер-Шеллерсхайм, доктор философии. | NIH: Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний

Основными ограничивающими факторами, препятствующими прогрессу в сторону более количественной биологии, являются нехватка подробных количественных экспериментальных данных и вычислительных инструментов, предназначенных для использования таких данных для разработки и тестирования биологически значимых моделей. Это особенно верно для клеточной биологии, где успех прогностических моделей в таких областях, как иммунология или онкология, зависит от нашей способности собирать и моделировать данные в нескольких пространственных / физиологических масштабах, от субклеточного, молекулярного масштаба до масштаба целых клеток и за пределы популяций клеток.

К сожалению, эти два фактора усиливают друг друга. Например, большинство биологов-экспериментаторов не видят необходимости в последовательной калибровке измерений сортировки активируемых флуоресценцией клеток или обеспечении абсолютных уровней — в отличие от просто относительных к «контролю» — внутриклеточной экспрессии или фосфорилирования белков и их внутриклеточного пространственного распределения. Это связано с тем, что вычислительные подходы, которые могли бы превратить эти данные в количественные модели, были либо недоступны, либо недоступны для экспериментаторов, потому что их применение требует серьезного опыта в физике, математике и информатике.

Теоретики, с другой стороны, часто прибегают к чрезмерно упрощенным подходам к моделированию, потому что отсутствуют подробные количественные данные, которые потребовались бы для более реалистичных с биологической точки зрения моделей.

Системная биология обещает преодолеть этот тупик путем систематической генерации очень подробных наборов данных и содействия развитию вычислительных подходов, подходящих для этих данных. Такие новые вычислительные подходы обязательно отличаются от классических стратегий математической биологии, в которых упор делается на экономию — в большинстве случаев в основном для того, чтобы уравнения были легко разрешимыми.

В нашей работе мы стремимся объединить тщательно спланированные количественные эксперименты с подходами компьютерного моделирования, которые позволяют нам фиксировать столько биологических деталей, сколько требуется для систематического исследования таких аспектов клеточного поведения, как процессы передачи сигналов или миграция. Обычно мы начинаем с довольно простых («голых») моделей клеточно-биологического процесса, который хотим проанализировать, а затем итеративно добавляем дополнительные компоненты, чтобы иметь возможность воспроизводить экспериментальные данные. Модификация и расширение вычислительных моделей осуществляется с помощью нашего программного обеспечения для моделирования Simmune.”

Программное обеспечение Simmune

Simmune — это название набора программных инструментов, которые направляют пользователя по множеству иерархических шкал поведения сотовой связи, облегчая создание всеобъемлющих моделей. Первоначально он был создан для моделирования иммунологических явлений — отсюда и его название — Simmune — но он применим к очень широкому классу биологических моделей клетки.

Разработка Simmune началась в Институте теоретической физики Гамбургского университета, Германия.Сейчас его разработка продолжается в рамках усилий по биокомпьютации в Лаборатории иммунной системной биологии NIAID.

Цель нашей работы — предоставить вычислительные подходы, подходящие для моделирования клеточных биологических систем на основе данных, которые описывают клеточное поведение в различных масштабах, от взаимодействий между молекулярными доменами до поведения популяций клеток.

На наш взгляд, такое программное обеспечение для моделирования должно не только предлагать передовые возможности технического моделирования, но и, что важно, должно давать возможность (экспериментальным) биологам определять вычислительные эквиваленты своих биологических моделей без необходимости иметь дело с языками сценариев или математикой. участвует в переводе этих моделей в формализованные представления, которые можно (количественно) моделировать.

Графический пользовательский интерфейс программы моделирования Simmune позволяет биологам легко взаимодействовать с программным обеспечением для моделирования и в значительной степени устраняет необходимость следовать «классической» стратегии: сначала переводить биологическую модель в упрощенную версию, которую затем можно «смоделировать» с помощью теоретик.

Проект Симмун

Анализ и моделирование стохастического поведения отдельных частиц

На фундаментальном уровне все биохимические процессы являются результатом стохастического молекулярного движения и взаимодействий.Во многих случаях концентрации молекул достаточно высоки, а молекулы достаточно равномерно распределены в пространстве, чтобы можно было применять подходы, основанные на массовых действиях. Однако, особенно в контексте взаимодействий между мембраносвязанными белками, пространственные неоднородности и низкие концентрации могут приводить к эффектам, которые нельзя уловить с помощью методов, предполагающих равномерно распределенные молекулярные игроки. Для решения концептуальных и технических проблем, связанных с правильной вычислительной обработкой, мы разрабатываем математические инструменты, основанные на описании в терминах функций Грина реакции-диффузии.

SBML3 многокомпонентный многоуровневый

Язык разметки системной биологии (SBML) обеспечивает стандарт для кодирования (биохимических) реакционных сетей, таких как те, которые регулируют клеточное поведение. Классически описания на основе SBML были технически эквивалентны описаниям, основанным на наборах связанных дифференциальных уравнений. Совсем недавно были предприняты попытки расширить SBML таким образом, чтобы разрешить кодирующие взаимодействия между сайтами связывания (доменами) молекулярных объектов, которые могут состоять из нескольких компонентов и существовать в нескольких состояниях.Это расширение, которое отражает тенденцию к описанию и моделированию клеточной биохимии на основе таких свойств, называется «SBML3 multi» и является основным направлением нашей работы.

Подробнее о SBML.

Этот документ представляет текущее предложение по SBML3 multi.

Методы анализа данных о времени до наступления события: кривая выживаемости Каплана-Мейера

Исследования, проводимые в области оксидативной медицины и клеточного долголетия, часто сосредоточены на связи между биомаркерами клеточных и молекулярных механизмов окислительного стресса, а также старения , иммунная функция и биология сосудов с конкретными данными о времени до события, такими как смертность и органная недостаточность.Действительно, анализ времени до события — одна из наиболее важных методологий, используемых в клинических и эпидемиологических исследованиях для рассмотрения этиологических и прогностических гипотез. Данные о выживаемости требуют адекватных методов анализа. Среди них анализ Каплана-Мейера является наиболее используемым как в наблюдательных, так и в интервенционных исследованиях. В этой статье мы описываем математические основы этого метода и концепцию цензурирования (правое цензурирование, интервальное цензурирование и левое цензурирование) и приводим некоторые примеры, демонстрирующие, как построить кривую выживаемости Каплана-Мейера и как применить этот метод для получения ответ на конкретные исследовательские вопросы.

1. Введение

Клинические исследования в области окислительного стресса и биологических последствий старения и изменений иммунной функции и метаболизма обычно требуют применения специальных статистических методов, направленных на изучение силы взаимосвязи между определенными факторами риска (для например, окисленный липопротеин низкой плотности) и неблагоприятные исходы (например, смерть и сердечно-сосудистые события). Анализ данных о времени до наступления события имеет первостепенное значение в клинических и эпидемиологических исследованиях [1].В контексте проспективных или ретроспективных когортных исследований [2] данные о выживаемости относятся к промежутку времени от четко определенной даты (которая совпадает с датой включения в исследование или начала наблюдения за человеком) до наступления данной клинической конечной точки. (например, смерть, сердечно-сосудистые события и рецидив данного заболевания).

Таким образом, время выживания не всегда соответствует фактическому выживанию данного человека, при этом интересующим событием является смертность. Анализ выживаемости направлен на оценку тенденции возникновения данного события как функции времени (т.е., одна кривая выживаемости в зависимости от времени в днях, месяцах или годах) и сравнение кривых выживаемости между двумя (например, между леченными и нелеченными пациентами или подвергшимися / не подвергавшимися воздействию данного фактора риска индивидуумами) или более чем двумя группами частные лица. Данные о выживаемости требуют особых методов анализа, поскольку не все пациенты, включенные в данное исследование, переживают интересующее событие. Например, в когортном исследовании с сердечно-сосудистой смертью в качестве первичной конечной точки [3] кто-то может бросить учебу из-за смены места жительства, смерти из-за не сердечно-сосудистых причин (например, рака), или он может завершить запланированный период времени, не испытав интересующее событие.Эти неполные наблюдения называются «цензурированными наблюдениями», которые могут происходить во время или в конце исследования. Существует три типа цензуры. Первый — это правильная цензура, которая является наиболее распространенной и происходит, когда за пациентом наблюдают в течение определенного периода времени, в котором не было интересующего события. Таким образом, время выживания является неполным в правой части периода наблюдения. Что касается этого пациента, мы знаем, что интересующее событие не произойдет до даты цензуры, но мы не знаем, произойдет это событие после этого или нет.Второй — интервальная цензура, которая описывает ситуацию, когда интересующее событие происходит в интервале между двумя датами, но мы не знаем точно дату. Третий — это левосторонняя цензура, которая происходит, когда известно, что у человека, принадлежащего к данной когорте, событие произошло до определенной даты, но период времени между возникновением события и конкретной датой остается неизвестным.

В 1958 году Эдвард Л. Каплан и Пол Мейер написали статью, описывающую, как поступать с цензурированными наблюдениями, тем самым положив основу анализа выживаемости Каплана-Мейера (К-М).Метод выживания Каплана-Мейера позволяет анализировать время до первого события, и одна из особенностей этого метода заключается в том, что временные интервалы продиктованы наступлением интересующего события. Например, гипотетическое когортное исследование с возникновением инфаркта миокарда в течение 1-летнего периода времени является первичной конечной точкой; если у пациента два инфаркта миокарда (первый через 6 месяцев, а второй через 10 месяцев после включения в исследование), анализ Каплана-Мейера будет учитывать только первое возникновение события (т.е. инфаркт миокарда в 6 месяцев).

При построении кривой выживаемости K-M следует тщательно учитывать три основных допущения. Первое предположение состоит в том, что цензура должна быть неинформативной, то есть не иметь отношения к результатам исследования. Это означает, что цензурированные наблюдения должны иметь такую ​​же вероятность события (после цензуры), что и оставшиеся под наблюдением. Это означает, что исходные прогностические характеристики пациентов, прошедших цензуру, должны быть аналогичны таковым у пациентов, которые остаются под наблюдением.Второе предположение состоит в том, что вероятности выживания должны быть одинаковыми для людей, набранных на ранней и поздней стадии данного исследования. Третье предположение состоит в том, что день, месяц и год наступления конкретного интересующего события должны быть доступны для получения точных оценок выживаемости. Еще одна характеристика метода Каплана-Мейера состоит в том, что он не позволяет вносить поправки на смешение; Проблема, имеющая особую актуальность в наблюдательных исследованиях, направлена ​​на оценку причинно-следственных связей [4].

В этой статье мы приводим серию примеров, полезных для понимания и интерпретации кривой выживаемости КМ.

2. Математические основы анализа Каплана-Мейера

Минимальный набор информации для построения кривой выживаемости Каплана-Мейера включает время до интересующего события (например, дни, месяцы и годы) и двоичную переменную. с указанием статуса пациента (наличие / отсутствие состояния) на данный момент времени. Время между регистрацией и конечным событием / окончанием наблюдения представлено случайной величиной (), определяемой как «время выживания».«Учитывая пациентов и наблюдаемое время до события, время выживания во времени составляет. По сути, метод Каплана-Мейера оценивает условную вероятность выживания, рассчитанную в определенные моменты времени, продиктованные наступлением события. Условная вероятность (или кумулятивная вероятность, или кумулятивная выживаемость) — это вероятность того, что пациент выживет через несколько дней после включения в исследование при условии, что тот же пациент выжил за несколько дней до этого. Например, в гипотетической обстановке, в которой пациент, поступивший в отделение интенсивной терапии, выживает в течение трех дней, совокупная выживаемость (рассчитанная по правилу произведения условных вероятностей) является произведением вероятностей выживания на 1-й день (), на 2-й день. (), а в день 3 (), то есть:

Если мы укажем с помощью, количество субъектов, представляющих интересующее событие (например, смерть) во время, а с, количество людей, находящихся в группе риска в данный момент.Индивидуальная вероятность умереть при условном проживании составляет:

Следовательно, вероятность выживания во время такова:

Умножая оценки условных вероятностей выживания, мы получаем оценку совокупной вероятности выживания за пределами данного момента:

Эта последняя формула представляет собой оценку Каплана-Мейера с асимптотической дисперсией, оцененной по формуле Гринвуда следующим образом:

, что обратно пропорционально количеству субъектов риска.

Оценка вероятности выживания Каплана-Мейера представлена ​​кривой, которая начинается с 1 и уменьшается с течением времени. Величина шагов зависит от количества событий и количества субъектов риска. Для сравнения распределения выживаемости двух или более групп субъектов, подвергшихся разному лечению или воздействию, используется логранговый тест (непараметрический ранговый тест). Мы рассматриваем серию пациентов, рандомизированных 1: 1 для экспериментального лечения и для контрольного лечения.Конечная точка исследования — смерть. При нулевой гипотезе (H ₀ ) о том, что два лечения имеют одинаковую эффективность, ожидается, что число умерших пациентов будет примерно одинаковым в обеих группах. И наоборот, альтернативная гипотеза (H ₁ ) состоит в том, что уровень смертности в двух группах исследования различается, что означает, что существует разница между ожидаемой и наблюдаемой смертностью. Таким образом, лог-ранговый тест сравнивает наблюдаемое количество смертей в каждой группе с ожидаемым уровнем смертности, если бы нулевая гипотеза была верной.Статистика логарифмического ранга приблизительно распределена как статистика критерия хи-квадрат со степенью свободы, соответствующей количеству групп сравнения-1:

, где — сумма наблюдаемого количества событий в группе ^-й за время () и — сумма ожидаемого количества событий в группе ^-й за время.

Чтобы рассчитать ожидаемое количество событий, мы оцениваем долю событий, происходящих в каждый момент времени (), используя данные из обеих групп, объединенных в предположении отсутствия разницы в выживаемости (т.е., предполагая, что нулевая гипотеза верна). Мы умножаем эти оценки на количество участников, подвергающихся риску в это время в каждой из групп сравнения (и для групп 1 и 2, соответственно). Например, мы рассматриваем 10 пациентов из группы риска в группе 1 и 10 пациентов в группе 2 и 1, общее количество ожидаемых событий во время (например, 14 месяцев) составляет и, соответственно. Используя эту информацию и формулу, приведенную выше, можно вычислить a, а значение для этого теста можно получить из противоположной таблицы в соответствии со значением и степенями свободы.

2.1. Пример 1

В гипотетическом исследовании десять пожилых пациентов с энцефалитом (воспалительное состояние мозга), поступивших в отделение интенсивной терапии (ОИТ), наблюдались в течение 365 дней. Первичной конечной точкой была смерть от сердечно-сосудистых заболеваний. За период наблюдения умерли 5 пациентов. Целью этого исследования является построение кривой выживаемости и частоты сердечно-сосудистой смерти в исследуемой популяции. Кривая выживаемости K-M отображает совокупную вероятность выживания в заданный период как функцию времени.Перед построением кривой КМ фундаментальным предварительным условием является знание точного времени наступления события, количества субъектов, подвергающихся риску, количества событий в период и цензурированных наблюдений (например, людей, потерянных для последующего наблюдения). up или пациенты, которые покидают исследование из-за событий, отличных от интересующих). Пациенты, подвергшиеся цензуре, остаются в анализе до тех пор, пока не станет доступна информация об их статусе. Для каждого временного интервала вероятность выживания в каждом периоде рассчитывается как количество выживших субъектов, деленное на количество пациентов, находящихся в группе риска в начале периода.Следовательно, согласно правилу произведения вероятностей, совокупная выживаемость после каждого периода (кроме первого) рассчитывается путем умножения вероятностей выживания предыдущих периодов. Рассмотрим подробно данные нашего гипотетического примера. Пациенты 1, 8 и 9 были подвергнуты цензуре: первые двое были потеряны для последующего наблюдения, а последний умер от другой причины (рака). Пациенты 2 и 4 были живы до конца наблюдения. Пять пациентов умерли от сердечно-сосудистых заболеваний в разное время: пациент 3 умер на 120-й день, 5-й в 250-й, 6-й в 230-й, 7-й в 80-й и 10 на 180-й днях.На графике двойные вертикальные линии обозначают цензурированные наблюдения, а серые кружки обозначают пациентов с интересующим событием (рис. 1 (а)). Чтобы построить кривую K-M, мы делим время на интервалы, соответствующие возникновению каждого события. В таблице 1 представлена ​​информация, необходимая для построения кривой K-M.

Интервал Дней Пациенты группы риска Смерти от сердечно-сосудистых заболеваний (0 = нет; 1 = да) Цензура Вероятность выживания Кумулятивная выживаемость 1 0-80 10 1 0 0.900 0,900 2 81-120 9 1 1 0,890 0,801 3 121-180 7 1 1 0,857 0,687 4 180-230 5 1 1 0,800 0,549 5 231-250 3 1 0 0.667 0,366 6 251-365 2 0 2 1.000 0,366

В интервале 1 ^st , там только один пациент умер от сердечно-сосудистых заболеваний; в случае 2 ^и есть 1 пациент с интересующим событием и 1 пациент, подвергшийся цензуре, и так далее. Для расчета вероятности выживания мы рассматриваем числитель как разницу между количеством пациентов из группы риска и количеством умерших пациентов, а в знаменателе — количество пациентов из группы риска в начале периода.Для первых двух периодов мы имеем:

Наконец, мы рассчитываем совокупную выживаемость за весь период исследования как произведение вероятностей выживания для каждого периода. В первом интервале вероятность выживания и кумулятивная вероятность совпадают. В конце второго периода совокупная выживаемость была рассчитана как (80,1%). В конце третьего периода совокупная выживаемость была рассчитана как (68,7%). Чтобы построить график выживаемости K-M, мы указываем по оси абсцисс время наблюдения (с указанием единиц измерения дней, месяцев или лет), а по оси ординат — кумулятивную выживаемость (т.е.е. вероятности со значениями от 0 до 1) (рисунок 1 (б)). Размер горизонтальных линий (т. Е. Линий, параллельных оси абсцисс, рисунок 1 (b)) соответствует продолжительности интервала между последовательными событиями, тогда как вертикальные расстояния представляют собой изменение совокупной выживаемости. Используя графический подход, мы можем рассчитать среднее время выживания, то есть время, которое соответствует кумулятивной выживаемости 50% (рисунок 1 (b)). В нашем случае среднее время выживания составляет 250 дней.Мы можем построить одну кривую выживаемости, две или более двух кривых выживаемости. Например, мы можем сравнить выживаемость двух групп пациентов (подвергшихся / не подвергавшихся воздействию данного фактора риска, например, с диабетом или без него, мужчин / женщин и курильщиков / некурящих). Тест, используемый для сравнения двух или более кривых, — это тест логарифмического ранга. Подробное описание этого теста приведено в [5].

2.2. Пример 2

Чтобы проиллюстрировать применение метода КМ, мы рассмотрим проспективное когортное исследование Li et al.[6]. В этой статье авторы исследовали взаимосвязь между биомаркерами окислительного стресса и прогрессированием поля зрения у пациентов с первичной закрытоугольной глаукомой (PACG). Девяносто четыре пациента с PACG наблюдались в течение как минимум двух лет с периодическими посещениями каждые 6 месяцев. У этих пациентов были измерены уровни общего антиоксидантного статуса (TAS — биомаркер окислительного стресса). У 43 пациентов (45,7%) наблюдалось прогрессирование глаукомы, оцениваемое по полю зрения. Здесь мы сосредоточены на анализе выживаемости взаимосвязи между TAS и прогрессией поля зрения.Авторы разделили пациентов на две группы в соответствии со средним значением TAS на исходном уровне (ниже / выше 0,95). Как показано на рисунке 2, пациенты с низким TAS (<0,95) имели значительно более высокий процент прогрессирования PACG (лог-ранговый тест), чем пациенты с низким уровнем. Следует отметить, что две кривые расходятся по истечении 6 месяцев. У пациентов с этим средняя продолжительность жизни составляет 12 месяцев. Кумулятивная выживаемость не превышает 50% у пациентов с; следовательно, среднее время выживания не поддается расчету. Под графиком также указано количество пациентов из группы риска в соответствующие моменты времени.Эта информация должна быть сообщена, потому что она представляет собой фундаментальную информацию для интерпретации кривой выживаемости. Результаты этого исследования генерируют гипотезу о том, что ТАС является полезным биомаркером для стратификации риска прогрессирования у пациентов с PACG.

2.3. Пример 3

Рассмотрим еще один пример, в котором авторы изучали общую картину выживаемости [7]. В рамках ретроспективного исследования авторы рассмотрели 103 пациента с болезнью Альцгеймера (БА), т.е.е., доля пациентов, которые выживают в течение определенного периода после начала деменции. Средняя продолжительность заболевания у 103 больных БА составила 7,1 года. Информация о семейной болезни Альцгеймера (FAD), о спорадической болезни Альцгеймера (SAD) и о генах пресенилина (PSEN) также была собрана для изучения влияния FAD, SAD и PSEN на уровень смертности у этих пациентов с помощью анализа Каплана. -Meir кривые выживаемости. Двадцать пять процентов заболевших умерли в течение четырех лет, 50% — в течение 6,9 лет и 75% — в течение 10 лет после начала болезни Альцгеймера.Во всей группе пациентов () кумулятивная выживаемость составила около 60% через 5 лет, 20% через 10 лет и около 10% через 15 лет (рис. 3 (а)). Прежде всего, авторы сравнили кривые выживаемости пациентов с ФАД и САР с помощью двухвыборочного теста Гехана-Вилкоксона (G-W) [8], и было обнаружено существенное различие в уровне смертности между двумя группами (,). При рассмотрении более двух групп уровень смертности между группами сравнивался с использованием критерия логарифмического ранжирования. Графики выживаемости (рис. 3 (b)) показали, что пациенты с генами PSEN выживали дольше, чем пациенты с FAD и SAD, и разница между тремя кривыми выживаемости была очень значимой (,).Влияние генов PSEN на смертность представляет интерес из-за роли пресенилина в митохондриальном окислительном стрессе и нейродегенерации [9].

Как описано выше, в дополнение к критерию логарифмического ранжирования можно использовать критерий Гехана-Бреслоу-Уилкоксона для проверки статистической значимости между кривыми Каплана-Мейра. Метод Гехана-Бреслоу-Уилкоксона придает больший вес смертям в ранние моменты времени. Однако важно отметить, что результаты этого теста могут вводить в заблуждение, если большая часть пациентов подвергается цензуре на ранней стадии.В отличие от этого, логранговый тест дает равный вес всем временным точкам [5].

2.4. Пример 4

Множественная миелома (ММ) представляет собой тип новообразования плазматических клеток. В этом состоянии перепроизводство внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) сопровождает злокачественную трансформацию с активацией онкогена и / или усилением метаболизма в опухолевых клетках. Как следствие, эти клетки обладают более высокими уровнями АФК и более низкими уровнями молекул антиоксидантов по сравнению с их нормальными аналогами. Несбалансированное производство АФК приводит к окислительному стрессу, который может оказывать токсическое действие на клетку [10].Существуют научные доказательства того, что антиоксидантная защита придает устойчивость к высоким дозам мелфалана в клетках ММ, подтверждая, что окислительно-восстановительный статус в клетках множественной миеломы может быть определяющим для реакции пациентов на мелфалан [11].

Здесь мы рассматриваем статью [12], в которой авторы сравнили данные пациентов () из двух рандомизированных исследований фазы III, чтобы оценить влияние мелфаланпреднизона плюс бортезомиб (VMP;) по сравнению с леналидомидом и низкими дозами дексаметазона (Rd; ) на выживаемость без прогрессирования (ВБП) у пожилых пациентов с впервые диагностированной множественной миеломой.Триста шесть пациентов имели прогрессирование заболевания или умерли в течение периода наблюдения (в среднем 32 месяца). Глядя на кривую выживаемости Каплана-Мейера, можно отметить, что, хотя VMP значительно снизил скорость прогрессирования заболевания между включением в исследование и 12 месяцами последующего наблюдения, никакой разницы между двумя графиками не было обнаружено между 12 и 32 месяцами. Через 32 месяца у пациентов, получавших Rd, частота прогрессирования заболевания была ниже (рис. 4). Авторы заключают, что время играет решающую роль в интерпретации эффекта MPV в отношении Rd на ВБП у пожилых пациентов с впервые диагностированной множественной миеломой.

2.5. Пример 5

Suvakov et al. [13] исследовали полиморфизм гена GST (глутатион-S-трансфераза) как предикторов выживаемости у ряда пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности (ТПН). На основе консолидированного представления о том, что глутатион-S-трансфераза (GST) является хорошо зарекомендовавшим себя антиоксидантом, авторы проанализировали суррогат этого биомаркера, полиморфизмы гена GST, чтобы оценить прогностическую роль этого SNP для выживаемости. у пациентов с ХПН.Они также измерили другие окислительные биомаркеры, такие как малоновый диальдегид (МДА). Эти окислительные биомаркеры были измерены у 199 гемодиализных пациентов, находящихся под наблюдением в течение 8 лет. В данной статье мы сосредоточимся на взаимосвязи между общей выживаемостью и двумя упомянутыми выше окислительными биомаркерами (рис. 5). Всего умерло 120 пациентов, 62 из которых — от сердечно-сосудистых причин (51,7%). Генотип GSTM1 был отнесен к нулевым и активным, тогда как уровни MDA ниже / выше соответствующего медианного уровня (2.33 мкм моль / л). Анализ выживаемости Каплана-Мейера показал, что пациенты с генотипом GSTM1-null имели более короткую общую выживаемость (лог-ранг 5,748; рис. 5 (а)) по сравнению с остальными пациентами. Соответственно, пациенты с более высокими концентрациями MDA имели тенденцию к более низкой общей выживаемости по сравнению с пациентами с относительно более низким уровнем MDA (Breslow: 3,766; Рисунок 5 (b)). Авторы приходят к выводу, что эти два биомаркера могут быть полезны для стратификации риска у пациентов с ESRD.

3.Выводы

Анализ выживаемости принадлежит к семейству статистических методов, которые анализируют распределение времени наступления данного состояния в определенный период времени. Таким образом, он исследует частоту данного события. Термин «выживаемость» относится не только к смертности, т.е. смерти, но также и к любому интересующему событию (например, снижению уровня сахара в крови, госпитализации и рецидиву рака). Исследования выживаемости проводятся с использованием когорт, т. Е. Пациентов, наблюдаемых во времени, для сбора соответствующих клинических событий, когда они происходят, и для связи таких случаев с данным воздействием.Чтобы выполнить анализ выживаемости, необходимо рассчитать «время выживания», определяемое разницей между датой, в которую событие происходит или нет, и датой исходного уровня. Таким образом, важно знать, переживают ли субъекты интересующее событие или подвергаются цензуре. Знание этой информации является фундаментальным для того, чтобы статистическое программное обеспечение могло рассчитать совокупную вероятность события. Таким образом, метод Каплана-Мейера — это, по сути, способ построения кривых выживаемости как функции времени, что позволяет сразу же получить представление об исследуемом клиническом феномене.Кривая Каплана-Меира показывает по оси ординат совокупную выживаемость, а по оси абсцисс — период времени. При построении кривой Каплана-Меира временные интервалы не устанавливаются заранее, а продиктованы наступлением каждого события, определяющего продолжительность тех же интервалов. Важным преимуществом подхода Каплана-Мейера является то, что метод учитывает цензуру, которая происходит, когда пациент теряется для последующего наблюдения по любой причине (выход из исследования, смена места жительства, смерть по причинам, отличным от интересующего события. , так далее.). Если у нас есть больше кривых выживаемости (стратифицированных по любому фактору), их можно сравнить с помощью различных методов, таких как логранговый тест и двухвыборочный тест Гехана-Вилкоксона (G-W). Анализ Каплана-Меира не позволяет делать поправку на искажающие факторы. По этой причине, хотя он хорошо подходит для использования в рандомизированных клинических испытаниях [1], его следует рассматривать только как анализ первого уровня в обсервационных исследованиях, направленных на проверку причинно-следственных связей.

3.1. Предлагаемое программное обеспечение

Существует несколько статистических программ, позволяющих выполнять анализ времени до события по методу Каплана-Меира.Наиболее известны:

SPSS 23.0 (https://www.ibm.com/support/knowledgecenter/SSLVMB_23.0.0/spss/advanced/idh_kmei.html)

Stata 16 (https://www.stata.com /support/faqs/graphics/gph/graphdocs/kaplan-meier-survival-function/index.html)

SAS (https://support.sas.com/documentation/onlinedoc/stat/142/kaplan.pdf)

MEDCALC (https://www.medcalc.org/manual/kaplan-meier.php)

Конфликт интересов

Эта рукопись не связана с конфликтом интересов.

Вклад авторов

Фузаро Мария и Трипепи Джованни внесли равный вклад в качестве последних авторов.

Публикации | Лаборатория Мейера

Zhou X, Boruc J, & Meier I (2018) Комплекс ядерных пор растений — ядерно-цитоплазматический барьер и за его пределами. Ежегодные обзоры завода

Groves NR, Biel AM, Newman-Griffis AH, & Meier I (2018) Динамические изменения в ядерной организации станции в ответ на сигналы окружающей среды и развития. Физиология растений 176: 230-241

Meier I, Richards EJ, & Evans DE (2017) Клеточная биология ядра растений. Ежегодный обзор биологии растений 68: 139-172.

Evans D, Meier I, & Graumann K (2016) От редакции специального выпуска SEB в Брайтоне: Динамическая организация ядра. Ядро 8 (1): 1-1.

Meier, I (2016) LINCING the eukaryotic tree of life — к широкому эволюционному сравнению нуклеоцитоплазматических мостиковых комплексов. Journal of Cell Science 129: 3523-3531.

Мейер I, Гриффис А.Н., Гровс Н.Р. и Вагнер А. (2016) Регулирование формы и размера ядер у растений. Current Opinion in Cell Biology 40: 114-123.

Zhou X, Tamura K, Graumann K, & Meier I (2016) Изучение белкового состава ядерной оболочки растений. Ядерная оболочка: методы и протоколы , eds Shackleton S., Collas P, & Schirmer EC (Springer New York, New York, NY), стр. 45-65.

Zhou X, Groves NR, & Meier I (2015) SUN закрепляет комплексы WIP-WIT пыльцы на вегетативной ядерной оболочке и необходимо для нацеливания на пыльцевые трубки и фертильности. J Exp Bot 66: 7299-7307.

Boruc J *, Griffis AHN *, Rodrigo-Peiris T, Zhou X, Tilford B, Van Damme D, & Meier, I (2015) Активность GAP, но не субклеточное нацеливание, требуется для клеточных функций Arabidopsis RanGAP и функций развития. Растительная клетка 27 (7): 1985-1998.

Zhou X, Groves NR, & Meier I (2015) Форма ядер растений независимо определяется комплексом SUN-WIP-WIT2-миозин XI-i и CRWN1. Ядро 6 (2).

Zhou X, Graumann K, & Meier I (2015) Ядерная оболочка станции как многофункциональная платформа, ПОДКЛЮЧЕННАЯ SUN и KASH. Журнал экспериментальной ботаники 66 (6): 1649-1659.

Zhou X & Meier I (2014) Эффективная мужская фертильность растений зависит от вегетативного ядерного движения, опосредованного двумя семействами белков внешней ядерной мембраны растений. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 111 (32): 1190-11905

Zhou X, Graumann K, Wirthmueller L, Jones JDG, & Meier I (2014) Идентификация уникальных SUN-взаимодействующих белков ядерной оболочки с различными функциями в растениях. Журнал клеточной биологии 205 (5): 677-692.

Griffis AHN, Groves NR, Zhou X, & Meier I (2014) Ядра в движении: движение и расположение ядер растений в развитии, передаче сигналов, симбиозе и болезни. Границы растениеводства 5.

Zhou X & Meier I (2013) Как сажают СВЯЗАТЬ СОЛНЦЕ с КАШ. Ядро 4: 206-215.

Чжоу X, Борук Дж и Мейер I (2013) Комплекс ядерных пор растений — ядерно-цитоплазматический барьер и за его пределами. Annual Plant Reviews (John Wiley & Sons Ltd), стр. 57-91.

Venkatakrishnan S, Mackey D, & Meier I (2013) Функциональное исследование растительных белков с длинной спиральной спиралью, индуцированной PAMP, спиральной спиралью (PICC) и PICC-LIKE (PICL) у Arabidopsis thaliana . PLoS ONE 8: e57283.

Zhou X, Graumann K, Evans DE, & Meier I (2012) Новый завод Мосты SUN – KASH участвуют в закреплении RanGAP и определении формы ядра. Журнал клеточной биологии 196: 203-211.

Мейер I (2012). Экспорт мРНК и сумоилирование — Уроки растений. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Механизмы регуляции генов 1819: 531-537.

Ding D, Muthuswamy S, & Meier I (2012) Функциональное взаимодействие между ортологами Arabidopsis белков контрольной точки сборки веретена MAD1 и MAD2 и нуклеопорином NUA. Молекулярная биология растений 79: 203-216.

Boruc J, Zhou X и ​​Meier I. (2012) Динамика ядерной оболочки и ядерной поры станции. Физиология растений 158: 78-86.

Zhao Q, & Meier I (2011) Идентификация и характеристика нуклеопорина Nup62 с FG-повторами Arabidopsis. Сигнализация и поведение растений 6: 330-334.

Rodrigo-Peiris T, Xu XM, Zhao Q, Wang H-J, & Meier I (2011) RanGAP необходим для постмейотического митоза в развитии женских гаметофитов у Arabidopsis thaliana. Журнал экспериментальной ботаники 62: 2705-2714.

Muthuswamy S & Meier I (2011) Генетические и экологические изменения гомеостаза SUMO приводят к сохранению ядерной мРНК в растениях. Planta 233: 201-208.

Meier I & Somers DE (2011) Регулирование ядерно-цитоплазматического переноса в растениях. Текущее мнение по биологии растений 14: 538-546.

Meier I & Brkljacic J (2009) Ядерные поры и развитие растений. Текущее мнение по биологии растений 12: 87-95.

Meier I & Brkljacic J (2009) Добавление деталей в загадочную ядерную оболочку завода. Текущее мнение по биологии растений 12: 752-759.

Brkljacic, J., Чжао, Q., и Мейер, I. (2009). Белки WPP-домена имитируют активность шаперона HSC70-1 в предотвращении ошибочного нацеливания на RanGAP1-заякоренный белок WIT1. Физиология растений 151 , 142-154.

Zhao, Q., Brkljacic, J., and Meier, I. (2008). Два различных взаимодействующих класса белков спиральной спирали, ассоциированных с ядерной оболочкой, необходимы для тканеспецифичного нацеливания на ядерную оболочку Arabidopsis RanGAP. Растительная клетка 20 , 1639-1651.

Сюй, X.M., Zhao, Q., Rodrigo-Peiris, T., Brkljacic, J., He, C.S., Müller, S., and Meier, I. (2008). RanGAP1 — непрерывный маркер плоскости деления клеток Arabidopsis. Труды Национальной академии наук 105 , 18637-18642.

Xu, X.M., и Meier, I. (2008). На первый план выходит ядерная пора. Тенденции в растениеводстве 13 , 20-27.

Мейер И., Сюй X.M., Брклячич Дж., Чжао К. и Ван Х. Дж. (2008). Going green: альтернативный способ растений позиционировать градиент Ran.Журнал микроскопии 231 , 225-233.

Мейер, И. (2008). Функциональная организация растительного ядра. In the Plant Plasma Membrane, A.S. Мерфи, У. Пир и Б. Шульц, ред. (Springer Berlin Heidelberg), стр. 1-8.

Xu, X.M., Rose, A., Muthuswamy, S., Jeong, S.Y., Venkatakrishnan, S., Zhao, Q., and Meier, I. (2007). NUCLEAR PORE ANCHOR, гомолог Arabidopsis Tpr / Mlp1 / Mlp2 / Megator, участвует в экспорте мРНК и гомеостазе SUMO и влияет на различные аспекты развития растений.Растительная клетка 19 , 1537-1548.

Сюй, X.M., Роуз, А., Мейер, И. (2007). Деятельность АНУ на АЭС «Ядерная пора». Сигнализация и поведение предприятия 2 , 553-555.

Xu, X.M., Meulia, T., and Meier, I. (2007). Закрепление RanGAP растений на ядерной оболочке включает новые белки, связанные с ядерными порами. Текущая биология 17 , 1157-1163.

Торговец, С.С., Прочник, С.Э., Валлон, О., Харрис, Э.Х., Карпович, С.Дж., Витман, Г.Б., Терри А., Саламов А., Фриц-Лейлин Л.К., Марешаль-Друар Л. и др. (2007). Геном хламидомонады раскрывает эволюцию основных функций животных и растений. Наука 318 , 245-250.

Мейер, И. (2007). Композиция ядерной оболочки завода: тема и вариации. Журнал экспериментальной ботаники 58 , 27-34.

Чжао, К., Люн, С., Корбетт, А.Х., и Мейер, И. (2006). Идентификация и характеристика ортологов Arabidopsis фактора ядерного транспорта 2, фактора ядерного импорта Ran.Физиология растений 140 , 869-878.

Саманьего Р., Чон С.Ю., де ла Торре К., Мейер И. и Диас де ла Эспина С.М. (2006). Фосфорилирование CK2 ослабляет ассоциацию 90 кДа MFP1 с ядерным матриксом в Allium cepa. Журнал экспериментальной ботаники 57 , 113-124.

Саманьего Р., Чон С., Мейер И. и де ла Эспина С. (2006). Двойное расположение MAR-связывающего нитеподобного белка 1 у Arabidopsis, табака и томата. Планта 223 , 1201-1206.

Мейер, И., Роуз, А., Патель, С., Чон, С., Сюй, X., и Брклячич, Дж. (2006). Белки ядерной оболочки растений: Тема и вариации. Статья представлена ​​по адресу: Сравнительная биохимия и физиология A-Молекулярная и интегративная физиология (Elsevier Science).

Каликовски Т., Мейер И. (2006). Выделение ядерных белков. В протоколах Arabidopsis, J. Salinas и J. Sanchez-Serrano, eds. (Humana Press), стр. 393-402.

Rose, A., Schraegle, S.J., Stahlberg, E.А., Мейер И. (2005). Белковая композиция Coiled-coil из 22 протеомов — различия и общие темы в субклеточной инфраструктуре и управлении движением. BMC эволюционная биология 5 , 66.

Пател С., Брклячич Дж., Гиндуллис Ф., Роуз А. и Мейер И. (2005). Белок ядерной оболочки растений MAF1 имеет дополнительное место в Гольджи и связывается с новым Гольджи-ассоциированным белком спиральной спирали. Планта 222 , 1028-1040.

Мейер, И. (2005). Субъядерный оборот и ядерная матрица.В «Ядерный импорт и экспорт растений и животных» (Springer, США), стр. 35-49.

Мейер, И. (2005). Глобальная биотехнология растений и потребность в образованной публике. Минерва Biotecnologica 17 , 21-31.

Мейер, И. (2005). Нуклеоцитоплазматический перенос в растительных клетках. В Международном обзоре цитологии, W.J. Kwang, ed. (Academic Press), стр. 95-135.

Джеонг, С.Ю., Роуз, А., Джозеф, Дж., Дассо, М., и Мейер, И. (2005). Специфичное для растений митотическое нацеливание RanGAP требует функционального домена WPP.Заводской журнал 42 , 270-282.

Роуз А., Патель С. и Мейер И. (2004). Ядерная оболочка завода. Планта 218 , 327-336.

Роуз А., Патель С. и Мейер И. (2004). Белки ядерной оболочки растений. В книге «Ядерная оболочка» Д. Эванс, К. Хатчисон и Дж. А. Брайант, ред. (Издательство Garland Science / BIOS Scientific).

Роуз, А., Мейер, И. (2004). Каркасы, рычаги, стержни и пружины: разнообразные клеточные функции длинных спиральных белков.CMLS, Cell Mol Life Sci 61 , 1996-2009.

Роуз А., Маникантан С., Шрегл С.Дж., Малой М.А., Штальберг Е.А. и Мейер И. (2004). Полногеномная идентификация белков спиральной спирали Arabidopsis и создание базы данных ARABI-COIL. Физиология растений 134 , 927-939.

Патель, С., Роуз, А., Меулия, Т., Диксит, Р., Сир, Р.Дж., и Мейер, И. (2004). Белки WPP-домена Arabidopsis связаны в процессе развития с ядерной оболочкой и способствуют делению клеток.Растительная клетка 16 , 3260-3273.

Jeong, S., Peffer, N., and Meier, I. (2004). Фосфорилирование протеинкиназой CKII модулирует ДНК-связывающую активность белка, ассоциированного с нуклеоидом хлоропласта. Планта 219 , 298-302.

Роуз А., Гиндуллис Ф. и Мейер И. (2003). Новый альфа-спиральный белок, специфичный и высококонсервативный для растений, связан с фракцией ядерного матрикса. Журнал экспериментальной ботаники 54 , 1133-1141.

Чон, С. Ю., Роуз, А., Мейер, И. (2003). MFP1 представляет собой связанный с тилакоидами нуклеоид-связывающий белок со структурой спиральной спирали. Исследование нуклеиновых кислот 31 , 5175-5185.

Каликовски Т.Т., Меулия Т. и Мейер И. (2003). Протеомное исследование ядерного матрикса арабидопсиса. Журнал клеточной биохимии 90 , 361-378.

Гиндуллис Ф., Роуз А., Патель С. и Мейер И. (2002). Четыре сигнатурных мотива определяют первый класс структурно связанных белков большой спиральной спирали у растений.BMC Genomics 3 , 9.

Саманьего Р., Ю. В., Мейер И. и Морено Диас де ла Эспина С. (2001). Характеристика и распределение с высоким разрешением связывающего белка области прикрепления матрикса (MFP1) в пролиферирующих клетках лука. Planta 212 , 535-546.

Роуз А., Штальберг Э.А., Мейер И. (2001). Полногеномная идентификация и сравнительный анализ белков спиральной спирали. Масштабируемые вычисления: практика и опыт 8 .

Роза, А., и Мейер, I. (2001). Домен, уникальный для растения RanGAP, отвечает за его нацеливание на ядерный край растения. Труды Национальной академии наук 98 , 15377-15382.

Мейер, И. (2001). Ядерная оболочка завода. CMLS, Cell Mol Life Sci 58 , 1774-1780.

Мейер, И. (2000). Новая связь между передачей сигнала Ran и белками ядерной оболочки у растений. Физиология растений 124 , 1507-1510.

Хардер П.А., Сильверштейн Р.А., Мейер И. (2000). Сохранение нитеподобного белка 1, связывающего область прикрепления матрикса, среди высших растений. Физиология растений 122 , 225-234.

Роуз А., Мейер И. и Винанд У. (1999). Фактор связывания I-бокса томата LeMYBI является членом нового класса Myb-подобных белков. Заводской журнал 20 , 641-652.

Gindullis, F., Peffer, N.J., and Meier, I. (1999). MAF1, новый растительный белок, взаимодействующий с связывающим белком MFP1 области прикрепления матрицы, расположен в ядерной оболочке.Растительная клетка 11 , 1755-1767.

Гиндуллис Ф. и Мейер И. (1999). Связывающий белок MFP1 области прикрепления матрицы локализован в дискретных доменах ядерной оболочки. Растительная клетка 11 , 1117-1128.

de la Espina, S., Samaniego, R., Yu, W., and Meier, I. (1999). Характеристика и субклеточное распределение с высоким разрешением MAR-связывающего белка MFP1 в ядрах лука и ядерных матрицах. Статья представлена ​​по адресу: Молекулярная биология клетки.

Баум К., Винанд У. и Мейер И. (1999). Снижение активности связывания ДНК фактора связывания G-бокса, но не изобилие фактора связывания G-бокса, вызывает подавление экспрессии RBCS2 во время раннего развития плодов томата. Письма FEBS 454 , 95-99.

Мейер И., Грёнинг Б., Михаловски С. и Спайкер С. (1997). Промотор RBCS3A томата требует интеграции в хроматин для правильной органоспецифической регуляции. Письма FEBS 415 , 91-95.

Баум К., Грёнинг Б. и Мейер И. (1997). Улучшенные условия баллистической транзиентной трансформации для плодов томата позволяют идентифицировать органоспецифический вклад I-бокса и G-бокса в активность промотора RBCS2. Заводской журнал 12 , 463-469.

Мейер, И., Фелан, Т., Груиссем, В., Спайкер, С., и Шнайдер, Д. (1996). MFP1, новый растительный филаментоподобный белок, обладающий сродством к ДНК области прикрепления матрикса. Растительная клетка 8 , 2105-2115.

Мейер И., Груиссем В. и Шнайдер Д. (1995). MBP1, растительный MAR-связывающий белок со структурным сходством с миозином. Журнал клеточной биохимии.

Мейер И., Каллан К.Л., Флеминг А.Дж. и Груиссем В. (1995). Органоспецифическая дифференциальная регуляция подсемейства промоторов для генов малых субъединиц рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы в томате. Физиология растений 107 , 1105-1118.

Мейер И. и Груиссем В. (1994). Новые консервативные мотивы последовательностей в G-бокс-связывающих белках растений и их значение для интерактивных доменов.Исследования нуклеиновых кислот 22 , 470-478.

Корфхаге У., Трезини Г.Ф., Мейер И., Хальброк К. и Сомсих И. (1994). Белок гомеодомена растений участвует в регуляции транскрипции гена, связанного с защитой от патогенов. Растительная клетка 6 , 695-708.

Мейер И., Манзара Т. и Груиссем В. (1993). Ядерные факторы, участвующие в органоспецифической дифференциальной экспрессии генов RBCS у помидоров. Журнал клеточной биохимии.

Мейер, И., Hahlbrock, K., and Somssich, I.E. (1991). Индуцируемые элиситором и конститутивные следы ДНК in vivo указывают на новые цис-действующие элементы в промоторе гена петрушки, кодирующего связанный с патогенезом белок 1. Растительная клетка 3 , 309-315.

Ван де Лёхт, У., Мейер, И., Хальброк, К., и Сомсих, И. (1990). Фрагмента промотора длиной 125 п.н. достаточно для сильной активации гена, опосредованной элиситором, у петрушки. Журнал EMBO 9 , 2945.

Van de Löcht, U., Мейер, И., Хальброк, К., Сомсих, И. (1990). Фрагмента промотора длиной 125 п.н. достаточно для сильной активации гена, опосредованной элиситором, у петрушки. Журнал EMBO 9 , 2945.

Somssich, I., Meier, I., Kawalleck, P., Loecht, U., and Hahlbrock, K. (1990). 231: Регуляция защитных генов петрушки. Physiologia Plantarum (Дания).

Виссманн А., Мейер И. и Хиллен В. (1988). Мутагенез насыщения кодируемого Tn10 оператора tet O1: идентификация пар оснований, участвующих в распознавании репрессора Tet.Журнал молекулярной биологии 202 , 397-406.

Мейер, И., Рэй, Л.В., и Хиллен, В. (1988). Дифференциальная регуляция генов устойчивости к тетрациклину, кодируемых Tn10, tetA и tetR с помощью тандемных операторов tet O1 и O2. Журнал EMBO 7 , 567.

Wissmann, A., Meier, I., Wray, L.V., Geissendörfer, M., and Hillen, W. (1986). Мутации оператора Tn10 tet, влияющие на распознавание репрессора Tet. Исследование нуклеиновых кислот 14 , 4253-4266.

Hillen, W., Gatz, C., Altschmied, L., Schollmeier, K., and Meier, I. (1983). Контроль экспрессии генов устойчивости к тетрациклину, кодируемых Tn10: равновесие и кинетическое исследование регуляторных реакций. Журнал молекулярной биологии 169 , 707-721.

Цифровой справочный атлас в 3D показывает модели роста клеток, формирующие яйцеклетку Arabidopsis

Заголовок: В названии написано 3D, а в бумаге — 4D.

Это было изменено.

Резюме:

Эта статья представляет собой экспресс-анализ роста семяпочек и демонстрирует, как проводить трехмерный анализ роста сложных органов для анализа всех слоев ткани. Авторы сканировали последовательные оптические срезы семяпочек Arabidopsis во время развития, от небольших зачатков до зрелых органов, которые незадолго до оплодотворения содержат женский гаметофит. Этот пространственно-временной атлас роста и развития органов в семяпочке ранее не подходил для визуализации живых клеток из-за его сложной трехмерной структуры.Полученный набор данных является важным сборником данных о росте семяпочек. Авт. Демонстрируют силу этого анализа, обеспечивая несколько новых взглядов на развитие яйцеклеток, включая подробный анализ клеток, экспрессирующих фактор стволовых клеток WUSCHEL, и детальную фенотипическую характеристику мутантов inner no external. Тем не менее, авторы должны приложить больше усилий, чтобы подчеркнуть полезность этого подхода в целом, мы, как сообщество яйцеклеток, невелико. То есть будут ли другие использовать аналогичные методы для изучения других интересующих их органов?

В Обсуждении исправленной рукописи мы теперь лучше подчеркнем общую полезность подхода.Уже было показано, что конвейер PlantSeg, используемый для прогнозирования контуров клеток и сегментации, применим ко многим различным тканям растений и даже животных. Более того, методы окрашивания, использованные в этом исследовании, также могут быть использованы для различных органов растений.

Кроме того, рукопись очень длинна по отношению к представленному содержанию. Бумага трудна для чтения из-за всех описаний количества ячеек, объемов и процентов. Для большинства из них значение неясно, и поэтому мы настоятельно рекомендуем сократить такие описания в основном тексте.Например, рисунки 1-5 можно было легко сократить до меньшего числа фигур, а некоторые графики и количественные оценки можно было бы перенести на дополнительные рисунки.

Мы значительно реорганизовали рукопись, чтобы учесть поднятые вопросы. Некоторые данные были удалены, а большинство упомянутых пространных описаний были перенесены в Приложение 1. Кроме того, мы включили дополнительные данные более общего значения и упростили представление и обсуждение результатов, оставшихся в рукописи.В целом, мы считаем, что отредактированная рукопись более содержательна и ее намного легче читать.

Редакции для этого документа:

В целом, анализ приводит к новым интересным открытиям относительно поведения различных клеточных популяций, динамики роста, экспрессии WUS относительно развития яйцеклетки, инициации 5-го слоя покровов и роли регулятора INO. Но это в основном отрывки, каждый из которых может быть отправной точкой для дальнейшего исследования, и по ним не доходит до того момента, когда мы узнаем что-то совершенно новое.Например, косой рост интересен, но в чем его значение и есть ли идеи, что его регулирует?

В этом исследовании мы установили, что ранний наклон представляет собой первое морфологическое проявление полярности в развивающейся семяпочке. Это новое открытие. Соответствующая передне-задняя полярность впоследствии наблюдается на протяжении развития семяпочки и во всех (также внутренних) тканях, которые мы исследовали (включая халазу (см. Ниже)). Соответствующие результаты дополнительно указывают на то, что окончательная ориентация этой полярной оси относительно длинной оси гинецея не устанавливается в то время, когда ось становится очевидной, а является следствием более сложного морфогенетического процесса, включающего скручивание семенного канатика.Это тоже новое открытие. Мы реорганизовали целые разделы в результатах и ​​обсуждении, чтобы прояснить эти важные моменты.

Механизм регуляции ранней передне-задней полярности в зачатке в настоящее время неизвестен. Таким образом, мы можем только догадываться. Мы даем некоторые возможные подсказки в отредактированном тексте (параграф 2 обсуждения).

Паттерн экспрессии WUS интересен, но совершенно не связан с фенотипами мутанта wus, поэтому неясно, какой урок из этого извлечь.

На одном уровне анализ экспрессии WUS служит доказательством концепции, что пространственный контроль активности генов может быть исследован с одноклеточным разрешением в трехмерных цифровых яйцеклетках. На другом уровне есть захватывающая биология, связанная с WUS и развитием семяпочек. Мы перефразировали большую часть этого раздела, чтобы лучше представить известную функцию WUS в яйцеклетке (подраздел «Рассеянное накопление экспрессии WUSCHEL в нуцеллусе»). Кроме того, теперь мы очерчиваем несколько открытых вопросов, касающихся экспрессии WUS в яйцеклетке, и даем лучшее резюме относительно релевантности наших результатов.Эти вопросы рассматриваются в данном исследовании.

Например, данные, опубликованные несколькими лабораториями, указывают, что WUS контролирует формирование паттерна в формировании халазы и MMC. Более того, недавние данные свидетельствуют о том, что экспрессия WUS должна быть исключена из MMC, чтобы обеспечить регулярный мейоз. Доступные данные по экспрессии позволяют предположить, что активность WUS ограничена нуцеллярным эпидермисом. Эти и другие находки показали, что WUS функционирует не клеточно-автономным образом в зачатке яйцеклетки.Интересно, что механизмы WUS в семяпочке и апикальной меристеме побегов (SAM) д. Различаться, поскольку в семязачатке отсутствует передача сигналов CLAVATA и WUS, по-видимому, не перемещается между клетками. Было неясно, когда экспрессия WUS становится обнаруживаемой во время развития семяпочки и всегда ли ее экспрессия ограничивается нуцеллусом и нуцеллярным эпидермисом. Мы находим репортерный сигнал WUS только в эпидермисе нуцеллуса во время стадии 1-II. Однако экспрессия WUS , по-видимому, не всегда ограничивается нуцеллярным эпидермисом, поскольку мы в конечном итоге наблюдали репортерную активность и в клетках L2.Интересно, однако, что мы никогда не обнаруживали репортерный сигнал в MMC (ячейке L2). Таким образом, наше исследование экспрессии позволило по-новому взглянуть на временное и пространственное установление экспрессии WUS (сильный временной контроль инициации экспрессии WUS на ранней стадии 1-II, первоначально рассеянная экспрессия внутри нуцеллярного эпидермиса, в конечном итоге случайный сигнал в L2 клетки нуцеллуса). Наши данные также предоставляют дополнительную сильную поддержку текущим идеям относительно функции WUS в яйцеклетке.

Аспект непрерывного роста интересен, но неясно, почему это было проверено. Была ли гипотеза о наличии импульсов роста? Результат неожиданный?

Ранее было неизвестно, какой тип временного паттерна роста лежит в основе разрастания примордиев, и поэтому было неясно, чего ожидать. Мы решили заняться этим вопросом и задали вопрос, происходит ли разрастание зачатка семяпочки равномерно или подвержено ли импульсам роста. По нашим данным, зачаток постоянно разрастается.Во введении к этому разделу мы прямо заявляем, что неизвестно, какой тип роста происходит во время формирования зачатка (подраздел «Равный рост зачатков семяпочки»).

Интересное описание ino мутантного фенотипа и любое обсуждение неавтономной роли в стимулировании роста и деления внутренних клеток имеет смысл только в том случае, если накопление белка INO также показано в тех же яйцеклетках, как это было сделано для WUS.

Мы считаем, что этот комментарий можно разделить на две части.Мы не будем возражать относительно описания фенотипа ino . По нашему мнению, это описание само по себе, независимо от того, где указано INO . С описанием фенотипа ino мы показываем, какое глубокое понимание функции генов можно получить с помощью количественного клеточного анализа мутантного трехмерного цифрового органа. Более того, анализ ino показывает, что это может быть верно даже для мутантного фенотипа, который уже был достаточно хорошо изучен с использованием традиционных подходов.Анализ выявил новые функции INO в развитии нуцелл и в контроле раннего искривления семяпочки (образование излома). В отредактированной рукописи нам лучше ввести INO в Результаты (подраздел «ВНУТРЕННИЙ НЕТ ВНЕШНИЙ влияет на развитие нуцеллуса»). Кроме того, мы подчеркиваем больше того, что можно узнать от мутанта ino относительно кривизны яйцеклетки в Обсуждении (последний абзац).

Мы согласны с тем, что подробный клеточный анализ экспрессии генов и белков важен для рассмотрения концепции не автономной функции клетки INO .Текущие данные в литературе согласованы и указывают на то, что присутствие транскриптов INO, и белка INO ограничено эпидермисом и внешним слоем наружных покровов (oi2). Тем не менее, это понятие нуждается в дальнейшей проверке с использованием преимуществ увеличенного клеточного разрешения, обеспечиваемого трехмерными цифровыми яйцеклетками. Мы перефразировали соответствующие разделы, чтобы лучше представить имеющиеся данные по экспрессии INO и подчеркнуть необходимость дальнейших исследований.

Актуальность идентификации клеточных популяций в домене халязала (рис. 12B / C) не ясна. Кроме того, определение того, какие ячейки к какому домену принадлежат, кажется довольно произвольным. Какие критерии использовались? Здесь есть риск круговой аргументации.

Мы реорганизовали этот раздел и рисунок 12 (новые рисунки 8 и 11). Мы пришли к выводу, что имеет смысл удалить характеристики двух разных популяций клеток халазы (теперь называемых передней и задней халазой) из рисунка 12 (контроль образования излома) и поместить результаты на отдельный рисунок (новый рисунок). 8).В новом разделе, охватывающем Рисунки 7 и 8, представлен последовательный анатомический план установления и поддержания передне-задней полярности в процессе развития семяпочки (подраздел «Первое морфологическое проявление полярности в молодой семяпочке»). Теперь мы также предоставляем точное морфологическое определение двух доменов, которое подтверждается данными предыдущего клонального анализа.

В целом, пожалуйста, приведите более четкие аргументы в пользу того, как конвейер и атлас могут быть использованы для открытия новых функций известных генов или, лучше, для объяснения мутантного фенотипа.

Мы считаем, что исправленная рукопись решает эти проблемы.

Ожидаемые изменения в ходе последующей работы:

Например, локализация белка INO в сегментированных семязачатках и / или описание фенотипа wus с использованием этого конвейера может добавить больше биологической информации.

Мы согласны с обоими вопросами. Фактически, в настоящее время мы создаем линии, которые позволяют количественно оценить экспрессию INO в трехмерных цифровых яйцеклетках.Они сыграют важную роль в нашей будущей работе.

Изучение функции WUS в семяпочке нетривиально. Помимо своей функции в развитии семяпочек WUS важен для развития меристем побегов и цветков. Как следствие, мутанты wus не образуют пестиков или семяпочек. Таким образом, для изучения роли WUS в развитии яйцеклетки необходимо ограничить манипулирование активностью WUS яйцеклеткой. Такие линии были доступны в прошлом, но сейчас были утеряны.Поскольку WUS играет центральную роль в формировании раннего паттерна во время развития семяпочек, мы планируем регенерировать такие линии и анализировать фенотип wus с помощью трехмерных цифровых семяпочек.

https://doi.org/10.7554/eLife.63262.sa2

Коинфекция вируса простого герпеса способствует репликации по катящемуся кругу генома аденоассоциированного вируса

Abstract

Репликация генома аденоассоциированного вируса (AAV) происходит только в присутствии сопутствующего вспомогательного вируса, такого как аденовирус типа 5 (AdV5) или вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1).Поддерживаемая AdV5 репликация генома AAV, как было описано, происходит в механизме репликации с вращающейся шпилькой (RHR) со смещением цепи, инициируемой на конце 3 ’инвертированного концевого повтора (ITR) AAV. Предполагается, что тот же механизм применим к репликации генома AAV, поддерживаемой HSV-1. Используя анализ по Саузерну и секвенирование нанопор в качестве нового высокопроизводительного подхода к изучению репликации вирусного генома, мы демонстрируем образование двухцепочечных конкатемеров AAV геномов «голова к хвосту» в присутствии HSV-1, таким образом обеспечивая доказательства однозначного механизм репликации катящегося круга (RCR).Это контрастирует с учебной моделью репликации генома AAV, когда HSV-1 является вспомогательным вирусом.

Информация об авторе

Для эффективной репликации аденоассоциированного вируса (AAV) необходимо присутствие вспомогательных факторов, которые могут быть обеспечены сопутствующими вирусами-помощниками, такими как аденовирусы или герпесвирусы. Было описано, что репликация AAV происходит как механизм репликации с вращающейся шпилькой. Однако мы показываем, что во время поддерживаемой репликации вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1), образуются промежуточные звенья репликации AAV, подобные катящемуся кругу.Таким образом, данное исследование контрастирует с учебной моделью репликации генома AAV. Кроме того, мы представляем секвенирование нанопор как новый высокопроизводительный подход для беспрецедентного детального изучения репликации вирусного генома.

Образец цитирования: Meier AF, Tobler K, Leisi R, Lkharrazi A, Ros C, Fraefel C (2021) Коинфекция вируса простого герпеса облегчает репликацию генома аденоассоциированного вируса по кругу. PLoS Pathog 17 (6): e1009638. https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.1009638

Редактор: Дэвид М. Книп, Гарвардская медицинская школа, США

Поступила: 4 марта 2021 г .; Принята к печати: 13 мая 2021 г .; Опубликован: 1 июня 2021 г.

Авторские права: © 2021 Meier et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Необработанные данные секвенирования, использованные в этом исследовании, были депонированы на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации Sequence Read Archive (NCBI SRA) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) по адресу регистрационные номера PRJNA699763 и PRJNA699846.

Финансирование: Швейцарский национальный научный фонд № 310030_184766, выданный C.F. http://www.snf.ch/de/Seiten/default.aspx Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Аденоассоциированный вирус (AAV) — это небольшой непатогенный Dependoparvovirus , который в основном известен своим применением в генной терапии [1,2]. Геном AAV дикого типа состоит из одноцепочечной ДНК (ss-ДНК) длиной 4,7 т.п.н., содержащей кодирующую область rep и cap , фланкированную последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) длиной 145 нуклеотидов [3,4] .AAV может реплицироваться только в присутствии вспомогательных факторов, которые могут быть обеспечены сопутствующими вирусами-помощниками, такими как аденовирусы (AdV) или герпесвирусы [5,6]. Факторы-помощники необходимы для трансактивации транскрипции генов AAV и поддержки репликации генома AAV. Было высказано предположение, что конкатемерная ДНК AAV, выделенная из коинфицированных клеток AAV2 / AdV5, организована в виде чередующихся положительных и отрицательных цепей [7]. Однако это исследование не предоставило определенных доказательств наличия таких конкатемеров. Тем не менее, это наблюдение вместе с предыдущими исследованиями репликации автономных парвовирусов и предложением новой модели репликации линейной двухцепочечной ДНК (ds ДНК) [8] привело к широко принятой в настоящее время модели репликации вращающейся шпильки (RHR). генома AAV [8–13].Согласно этой модели RHR генома AAV инициируется на палиндромных терминальных последовательностях ITR, которые способны самоотжигаться в двойные шпильчатые структуры [3] и, таким образом, обеспечивать праймер 3’-OH. Удлинение отожженного 3 ’конца приводит к образованию дуплексной структуры, которая ковалентно закрыта с одного конца. Чтобы разрешить закрытый конец, AAV Rep68 / 78 вводит разрыв в одну цепь ковалентно закрытой последовательности ITR в сайте терминального разрешения ( trs ) [14].Вновь созданный 3’-ОН праймер затем используется для заполнения оставшегося промежутка, чтобы сформировать полноразмерную линейную открытую дуплексную конфигурацию. После денатурации концов и последующего повторного отжига с образованием двойных шпилечных структур образуется новый 3’-ОН праймер, и при смещении цепи высвобождается геном потомства.

Несколько линий доказательств предполагают, что описанная модель действительна для поддерживаемой AdV репликации генома AAV: (i) Предсказанные ковалентно замкнутые двухцепочечные (ds) мономерные структуры были выделены из AAV-инфицированных клеток [7,12].(ii) Было показано, что палиндромные ITR-последовательности ведут себя как источники репликации ДНК [12,15,16]. (iii) Были обнаружены две разные ориентации ITR (флип и флоп), и их относительная ориентация друг относительно друга оказалась независимой [3,17]. Наблюдение за двумя ориентациями ITR соответствует модели, поскольку она предсказывает, что ITR инвертируются относительно друг друга во время каждого цикла репликации. (iv) Наблюдали сайт-специфическое порезывание trs [14,18,19].(v) Было высказано предположение, что конкатемеры, выделенные из коинфицированных клеток AAV / AdV, состояли из чередующихся геномов AAV с положительной и отрицательной цепью [7]. Считается, что такие конкатемеры возникают в отсутствие trs -ника. Общепринято, что репликация генома AAV, поддерживаемая вирусом простого герпеса типа 1 (HSV-1), происходит таким же образом, как описано для репликации, поддерживаемой AdV.

Широко принятая модель репликации генома HSV-1 заключается в том, что ДНК HSV-1 циркулирует при входе с последующей зависящей от ориджина двунаправленной репликацией, которая затем переключается на механизм репликации по кругу (RCR) [20,21].Кроме того, было показано, что добавление белков HSV-1, необходимых для репликации генома, к невирусной плазмидной ДНК опосредует амплификацию плазмиды и приводит к образованию конкатемеров «голова к хвосту» [22,23]. Поскольку было обнаружено, что геном AAV циркулирует внутри клетки-хозяина [24,25], что является предпосылкой для RCR, мы оценили, происходит ли репликация генома AAV, опосредованная HSV-1, в механизме RCR. Мы исследовали промежуточные продукты репликации генома AAV с помощью секвенирования нанопор и анализа по Саузерну.Технология секвенирования нанопор обеспечивает уникальную особенность чрезвычайно длинных считываний и, следовательно, позволяет анализировать промежуточные молекулы одиночной репликации. Как и предполагалось, мы обнаружили конкатемеры «голова к хвосту», что не может быть объяснено текущей моделью репликации генома AAV. Поэтому мы предлагаем RCR в качестве новой модели репликации для амплификации генома AAV в присутствии вспомогательных факторов HSV-1. Кроме того, мы представляем секвенирование нанопор как новый высокопроизводительный подход для исследования механизма репликации вирусного генома.Секвенирование нанопор ранее применялось для анализа целостности геномов запасов рекомбинантных векторов AAV [26]. Однако нам неизвестны какие-либо исследования с использованием секвенирования нанопор для объективной идентификации продуктов репликации генома и оценки механизмов репликации вирусного генома в инфицированных клетках.

Результаты

Категории промежуточных продуктов репликации, наблюдаемые при секвенировании нанопор

Репликация генома

AAV может приводить к получению промежуточных продуктов, которые не все обнаруживаются при массовых подходах, таких как блоттинг по Саузерну.Секвенирование нанопор обеспечивает уникальные функции, которые полезны для оценки различных популяций нуклеиновых кислот. Длина секвенирования (теоретически) не ограничена, и фрагментация материала образца не требуется. Мы использовали секвенирование нанопор, чтобы идентифицировать и количественно оценить полный спектр промежуточных продуктов репликации ДНК AAV2 с высокой пропускной способностью. Для этого мы экстрагировали внехромосомную ДНК из клеток BJ, инфицированных нереплицирующимся (одиночная инфекция) или реплицирующимся AAV2 (коинфекция HSV-1), используя протокол Hirt, и секвенировали выделенную ДНК с помощью технологии нанопор ( Рис. 1A ).Примечательно, что экстрагированная ДНК не была линеаризована до секвенирования. Поскольку лигирование адаптера для секвенирования нанопор требует линейных геномов, кольцевые геномы автоматически исключаются из нашего анализа.

Рис. 1. Экспериментальная установка и определение категорий продуктов репликации ДНК AAV2.

(A) Схематическое изображение экспериментальной установки. (B) Схематическое изображение определенных категорий с предсказанной структурой ДНК AAV слева и соответствующей теоретической точечной диаграммой справа.Точечные графики использовались для визуализации последовательности AAV из изолированных геномов с считыванием (запросом) по оси x и положением в геноме AAV по оси y. Для дальнейшего пояснения последовательность считывания показана под точечной диаграммой. Показаны ITR-концы AAV (оранжевый) и кодирующие области генома rep (красный) и cap (зеленый). Следует отметить, что для каждой категории отображается только одна ориентация, хотя включены обе ориентации.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009638.g001

Чтобы облегчить сравнение гетерогенных промежуточных продуктов репликации ДНК, считывания ДНК AAV2 были изображены как функция включенных геномных доменов. На основе полученных характерных шаблонов были определены шесть категорий считываний секвенирования, как показано на рис. 1B . Показания категории 1 отображаются как одна прямая линия, пересекающая другую сторону графика снизу вверх (положительная полярность) или сверху вниз (отрицательная полярность). Такие чтения представляют собой отдельные геномы AAV2.Показания категории 2 отображаются в виде буквы «V» или «A» на точечной диаграмме. Эти считывания соответствуют дуплексной форме генома AAV2, двум геномам ss-ДНК, которые инвертированы относительно друг друга и ковалентно связаны с одной стороны, как показано ниже точечной диаграммы. Такие структуры могут возникнуть в результате преобразования одноцепочечной в двухцепочечную. Считывания категории 3 выглядят как параллельные линии, пересекающие график, которые представляют множественные прямые повторы генома (конкатемеры «голова к хвосту»), и их можно было бы ожидать от механизма репликации по катящемуся кругу (RCR).Считывания категории 4 отображаются в виде зигзагообразных линий на точечной диаграмме, которые представляют множественные копии генома AAV2 с чередующейся ориентацией, и их можно было бы ожидать от механизма репликации с вращающейся шпилькой (RHR), где trs -насечки не происходили. Считывания категории 5 выглядят как параллельные линии, разделенные структурами в форме буквы «V» или «A», которые представляют последовательности, сочетающие как «голова к хвосту», так и чередующиеся повторы. Мы предполагаем, что эти конкатемеры генерируются RCR с последующим повторным отжигом 3’-OH ITR и последующим синтезом второй цепи конкатемеров «голова к хвосту», что приводит к инверсии структуры RCR.Считывания категории 6 представляют собой множественные повторения ITR (нет последовательностей rep- и cap- ). Последовательности, которые не могли быть отнесены ни к одной из шести категорий, были сгруппированы в категорию 7. Многие из этих считываний выглядят как дефектные, неполные или укороченные геномы (см. S1 рис. , где представлены репрезентативные точечные графики считываний, отнесенных к категории 7). Неясно, как были сгенерированы такие чтения, но их образец предполагает дефектный механизм репликации.

Анализ последовательности нанопор реплицирующегося AAV2 выявляет RCR-подобные промежуточные соединения с высокой частотой

Мы секвенировали внехромосомную ДНК, выделенную из коинфицированных клеток AAV2 и HSV-1, и обнаружили широкий спектр промежуточных продуктов репликации ДНК.Эти чтения были классифицированы, как описано в разделе выше (, рис. 1B, ). Мы распределили по категориям 200 случайно выбранных считываний на выборку или все считывания выборки, если число было меньше 200. На рис. 2A – 2F мы показываем две репрезентативные точечные диаграммы отдельных считываний каждой категории; частота этих чтений показана в Таблице 1 . Согласно Oxford Nanopore Technology, наш подход к лигированию адаптеров должен исключать любую ss-ДНК для секвенирования, поскольку ds-ДНК является необходимым условием для лигирования адаптеров секвенирования.Поскольку инкапсидированные геномы AAV присутствуют как ss-ДНК положительной или отрицательной ориентации в равных количествах [27], мы предполагаем, что отжиг цепи произошел до подготовки библиотеки, и, таким образом, мы смогли обнаружить мономерные геномы AAV2. Более того, ss AAV геномы могут образовывать ds концы ДНК за счет адаптации структуры panhandle после отжига обоих ITR-концов, как предполагалось ранее [17].

Рис. 2. Промежуточные продукты репликации AAV2.

(A-F) Показаны точечные графики двух репрезентативных индивидуальных считываний для каждой категории из коинфицированных AAV2 / HSV-1 клеток BJ.Внехромосомную ДНК выделяли при 12 hpi из клеток BJ, инфицированных AAV2 (gcp / клетка = 20’000) и HSV-1 (БОЕ / клетка = 1).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009638.g002

В образцах внехромосомной ДНК, выделенных из клеток BJ, инфицированных AAV2, ДНК AAV2 в основном присутствовала в виде мономерных геномов AAV2 (категория 1) (62% при AAV2 геном, содержащий частицы (gcp) / клетка = 20’000) (, таблица 1, ). 8% прочтений AAV2 присутствовали в дуплексной форме (категория 2).Большинство остальных прочтений было отнесено к категории 6 (19%), которая содержит чтения с ITR-повторами, или к категории 7 (9%), которая содержит все другие структуры. Эти результаты соответствовали нашим ожиданиям о преобладании мономерных геномов AAV2 и случайном преобразовании ss в ds дуплексную структуру ДНК.

Напротив, считывание AAV2 из коинфицированных HSV-1 клеток показало резкое изменение наблюдаемых структур генома ( рис. 2, таблица 1 ). Отношение считываний мономерного генома AAV2 (категория 1) было снижено до 34% для AAV2 gcp / клетка = 20 000 или 17.5% для AAV2 gcp / cell = 500 (, таблица 1, рис. 2A, ). Формирование дуплексных структур (категория 2) увеличивалось до 17% или 38,5% для AAV2 gcp / cell = 20’000 или для AAV2 gcp / cell = 500, соответственно ( Таблица 1, Рис. 2B ). Наиболее примечательным результатом является то, что коинфекция HSV-1 привела к появлению конкатемеров «голова к хвосту» (категория 3) в 17% или 21,5% (для AAV2 gcp / cell = 20’000 или для AAV2 gcp / cell = 500 соответственно) (, таблица 1, рис. 2С, ). Мы также наблюдали конкатемеры с чередующейся ориентацией (категория 4; голова к голове), которые, как можно было бы ожидать, возникнут в результате механизма репликации вращающейся шпильки при отсутствии накалывания trs (3.5% или 1% для AAV2 gcp / cell = 20’000 или для AAV2 gcp / cell = 500, соответственно) ( Таблица 1, Рис 2D ). Однако этих считываний было гораздо меньше, чем конкатемеров «голова к хвосту». Интересно, что структур, предположительно образованных при синтезе второй цепи продукта RCR (категория 5), было больше, чем конкатемеров с чередующейся ориентацией генома (категория 4). 6% и 7,5% считываний из образцов с AAV2 gcp / cell = 20’000 или для AAV2 gcp / cell = 500, соответственно, были отнесены к категории 5 ( Таблица 1, Рис. 2E ).Интересно, что в присутствии и в отсутствие HSV-1 мы идентифицировали большое количество считываний, которые содержат многократные повторения последовательностей ITR, классифицированных как категория 6 ( Fig. 2F ). Эти структуры присутствовали до 19% всех чтений и, как правило, были более многочисленными в отсутствие HSV-1 (, таблица 1, ). Кроме того, мы также идентифицировали те считывания, содержащие ITR-повторы, в исходных образцах вируса с распространенностью 6,5% (, таблица 1, ). Источник этих структур еще предстоит выяснить.ДНК AAV, выделенная из клеток BJ, инфицированных компетентным к репликации вариантом AAV2 AAV201, демонстрирует сравнимое количество и распределение структур, наблюдаемых в клетках BJ, инфицированных wtAAV2 (таблица S1). Мы не наблюдали предпочтения определенной структурной ориентации ни для одной категории наших наборов данных AAV2.

Кроме того, мы проанализировали данные с помощью альтернативного подхода. Для каждого считывания подсчитывали количество повторов генома. Например, при каждом чтении в категории 2 («дуплексные структуры») было получено два счета, поскольку присутствовали две копии генома.Оценивались только чтения, отнесенные к категориям от 1 до 5. Считывания, отнесенные к категориям 6 и 7 («ITR-повторы» и «другие»), не были включены в этот анализ. Этот подход показал, что в присутствии HSV-1 около 30% всех копий генома присутствовали в виде повторов «голова к хвосту», в то время как это число было ниже 1% в отсутствие HSV-1 (таблица S2). В присутствии HSV-1 процент копий генома в категории 5 («голова к хвосту и чередующиеся повторы») увеличился до 21,9 или 16,4% для AAV2 gcp / cell = 20’000 или AAV2 gcp / cell = 500. соответственно (с 0% при отсутствии HSV-1).Эти результаты дополнительно подчеркивают важность промежуточных продуктов репликации, происходящих из RCR, в присутствии HSV-1.

Количественная оценка исходных считываний AAV2 показала, что подавляющее большинство (83 и 81%) присутствовало в виде мономерной ДНК размером примерно 4,7 т.п.н. с положительной или отрицательной полярностью (категория 1) (, таблица 1, ). Оставшаяся популяция прочтений была отнесена к категории 2 (дуплекс) (4 и 2%), категории 3 (повторы от головы к хвосту) (0,5 и 3%), категории 6 (повторы ITR) (6.5%) или категории 7 (прочие сооружения) (5,5 и 7,5%) ( Таблица 1 ). Максимальный размер большинства этих довольно неожиданных чтений составлял около 5 кб, что соответствовало максимальному размеру упаковки AAV [28]. Это указывает на то, что значительная часть около 10–15% вирусных частиц содержала дефектные геномы. В целом, эти результаты секвенирования соответствовали нашим прогнозам, поскольку мы полагали, что большинство вирусных частиц из исходного образца AAV2 содержат мономерный геном AAV2.

В заключение, мономерные геномы AAV2 были очень многочисленны во всех образцах.Полные дуплексные структуры, содержащие две полноразмерные последовательности генома, наблюдались только в образцах ДНК, выделенных из инфицированных клеток, но не из исходных образцов AAV2. Считывания из исходных образцов AAV2, классифицированных как дуплексная структура, содержали только один полноразмерный геном с несколькими сотнями дополнительных пар оснований. Более того, конкатемеры «голова к хвосту» были идентифицированы с высокой частотой в образцах из клеток, коинфицированных AAV2 и HSV-1. Конкатемеры со структурой «голова к голове», ожидаемой от механизма RHR, лишенного trs -зацепления, были обнаружены только с очень низкими показателями.Таким образом, мы заключаем, что коинфекция HSV-1 индуцирует образование RCR-подобных конкатемеров «голова к хвосту» генома AAV2.

Саузерн-анализ репликации ДНК AAV2 выявил продукты RCR

Далее мы оценили структуру геномов AAV2, выделенных из клеток BJ, инфицированных AAV2 или совместно инфицированных AAV2 и HSV-1, с помощью анализа по Саузерну. Экстракция Hirt-ДНК клеток, инфицированных AAV2, приводила только к появлению единственной полосы с миграцией, соответствующей примерно 3 т.п.н. ДНК ds (, фиг. 3B, ).Эта полоса представляет собой мономерную ss-ДНК AAV2, поскольку она исчезла после обработки нуклеазой маша (MBN), которая специфически разрушает ss-ДНК-содержащие фрагменты (фиг. 3B) . Такая же полоса была обнаружена в образцах, выделенных из коинфицированных клеток AAV2 и HSV-1, которые также исчезли после обработки MBN (, рис. 3B, ). Коинфекция HSV-1 привела к появлению устойчивой к MBN полосы 4,7 т.п.н., представляющей ds AAV2 ДНК (дуплексные) структуры. Кроме того, наблюдались полосы с более высокой молекулярной массой, которые представляют конкатемеры (, фиг. 3B, ).Следует отметить, что конкатемеры с более высокой молекулярной массой недостаточно представлены на блоте, поскольку эти молекулы гораздо менее эффективно переносятся из агарозного геля на нейлоновую мембрану, чем молекулы меньшего размера. Чтобы выявить природу этих конкатемеров, образцы обрабатывали Hin dIII, который разрезает геномы ds AAV2 в нуклеотидном положении 1882 в последовательности rep ( Fig. 3A ). Ожидается, что расщепление Hin dIII мономерной ds AAV2 ДНК даст фрагменты приблизительно 1.9 т.п.н. и 2,8 т.п.н. ( рис. 3А, ). Поскольку Саузерн-зонд гибридизуется с последовательностью rep во фрагменте 1,9 т.п.н., можно наблюдать только эту полосу. Расщепление конкатемеров Hin dIII приведет к получению фрагментов размером 4,7 т.п.н. размером с геном ( фиг. 3A, ). В результате переваривания конкатемеров «голова к голове» будут получены фрагменты размером 3,8 т.п.н. и 5,6 т.п.н., но гибридизационный зонд связывается только с фрагментом 3,8 т.п.н. Hin dIII не переваривает ss-ДНК. Обработка Hin dIII приводила к исчезновению конкатемеров, наблюдаемых в образцах клеток, коинфицированных AAV2 и HSV-1.Вместо этого появилась сильная полоса размером приблизительно 4,7 т.п.н., а также две полосы размером приблизительно 3,8 т.п.н. и 1,9 т.п.н. ( Фиг. 3B, ). Поскольку полоса 4,7 т.п.н. была намного сильнее полосы 3,8 т.п.н., это демонстрирует, что промежуточные продукты репликации генома AAV2, выделенные из клеток, коинфицированных HSV-1, присутствуют преимущественно в виде конкатемеров ds ДНК «голова к хвосту». Эти результаты соответствуют нашим результатам секвенирования, описанным выше. Сопоставимые результаты были получены, когда Саузерн-анализ выполнялся с использованием внехромосомной ДНК, экстрагированной из клеток 293T и Hela, коинфицированных AAV2 и HSV-1 (S2 фиг.).

Рис. 3. Саузерн-анализ ДНК AAV2.

(A) Схематическое изображение генома AAV2 с указанным сайтом рестрикции Hin, dIII и сайтом связывания зонда rep- . В таблице справа показаны ожидаемые размеры фрагментов после обработки Hin dIII фрагментом, содержащим подчеркнутый сайт связывания зонда rep-. (B) Саузерн-блот ДНК Hirt, экстрагированной при 12 hpi из клеток BJ, инфицированных только AAV2 (gcp / клетка = 20’000) или совместно инфицированных AAV2 (gcp / клетка = 20’000) и HSV-1 (БОЕ / cell = 1), показывающий необработанные образцы, расщепленные Hin dIII или обработанные нуклеазой маша (MBN).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009638.g003

Валидация секвенирования нанопор для обнаружения механизма RCR

Для дальнейшей проверки нашего подхода к секвенированию для определения механизмов репликации вирусного генома и подтверждения нашего вывода о том, что преобладающая структура конкатемеров репликации генома AAV2, поддерживаемая HSV-1, представляет собой конкатемеры «голова к хвосту», генерируемые RCR, мы определили продукты репликации из хорошо охарактеризованного усиление катящегося круга (RCA) [29].В частности, мы проанализировали структуры, созданные на изотермическом бактериофаге Phi29-полимеразе, опосредованном RCA плазмиды pUC19. Как показано в , Таблица 2, и S3 Фиг., Мы обнаружили такие же структуры параллельных полных плазмидных повторов, как описано выше в категории 3. Эти считывания составляют 30,5% всех проанализированных считываний pUC19. Мы также обнаружили значительное количество (64%) считываний, показывающих структуру с комбинацией конкатемеров «голова к хвосту» и чередующихся конкатемеров, как описано для категории 5. Опосредованное полимеразой Phi29 образование ds-ДНК было ранее охарактеризовано и предположено, что оно происходит на матрице. переключатель [30].Переключение шаблона продукта RCA привело бы к конкатемерам, содержащим повторы от головы к хвосту, которые изменяют полярность, чтобы продолжить с повторами от головы к хвосту, как видно в наших чтениях, отнесенных к категории 5. Таким образом, эти предыдущие результаты соответствуют наши наблюдения. Кроме того, мы обнаружили структуры, похожие на вышеупомянутые дуплексные структуры, но в меньшей степени (2%). Эти результаты ясно показывают, что RCA, поддерживаемая Phi29, приводит к образованию структур, подобных тем, которые выделены из коинфицированных клеток AAV2 и HSV-1.Кроме того, 3,5% прочтений не могут быть отнесены ни к одной из других категорий.

Анализ мельчайших вирусов продуктов репликации ДНК мышей

Для дальнейшей проверки нашего подхода мы проанализировали последовательности промежуточных продуктов репликации ДНК из автономного парвовирусного минутного вируса мышей (MVM). Репликация генома MVM была подробно охарактеризована и описана как модифицированный механизм RHR, подобный тому, который предлагается для репликации генома AAV, поддерживаемой AdV [9,10,13,31].В отличие от AAV, геном MVM фланкирован двумя неидентичными концевыми палиндромными (гетеротеломерными) последовательностями, и только одна из них подвергается сайт-специфическому разрезанию во время репликации [10,32–34]. В результате упакованные геномы MVM в основном, хотя и не исключительно, представлены в виде ss-ДНК отрицательной ориентации [1]. Более того, дуплексные структуры MVM отдают предпочтение ковалентно связанному (слева) 5’-OH-концу [31]. Экстрахромосомную ДНК, выделенную на 16 или 20 hpi из инфицированных MVM клеток A9, когда синтез вирусной ДНК максимален и до упаковки [35], секвенировали и анализировали, как описано выше.Каждое чтение было отнесено к одной из ранее определенных категорий (рис. 1B). Две репрезентативные точечные диаграммы для каждой категории показаны на Рис. 4 . Структуры мономерного генома были менее многочисленными в MVM-образцах (14,5–25,5%) по сравнению с геномами, выделенными из инфицированных AAV2 клеток (17,5–62%) ( Таблицы 1 и 3 ). Однако, как упоминалось выше, количественную оценку структур мономерного генома следует рассматривать с осторожностью, поскольку было описано, что с помощью нашего подхода можно секвенировать только ds-ДНК.Поскольку MVM-геномы преимущественно упакованы как ss-ДНК с отрицательным смыслом, только небольшая часть геномов будет отжигаться с положительной ss-ДНК и впоследствии секвенироваться. Наиболее распространенной структурой изолированной ДНК MVM была дуплексная форма (67–79,5%) (, таблица 3, ). Было описано, что MVM реплицирует свой геном через обязательную димерную репликативную форму молекулы [13] и, следовательно, наше наблюдение преобладающей дуплексной структуры согласуется с учебной моделью репликации MVM. Эти дуплексные структуры в основном присутствовали с ковалентной связью на 5’-OH-конце ( «V» структура; S3 таблица).Такое предпочтение дуплексной структуры не было обнаружено в клетках, инфицированных AAV2 (S3 Таблица ) . Эти наблюдения также согласуются с ранее описанной моделью репликации генома MVM [13,31]. Важно отметить, что считывания, содержащие конкатемеры «голова к хвосту» (категория 3), не были идентифицированы как промежуточные продукты репликации MVM. Напротив, действительно наблюдались конкатемеры чередующихся повторов, хотя и с низким содержанием (0–2.5%). Ни одно из считываний не показало комбинацию повторов «голова-к-хвосту» и чередующихся повторов или множественных концевых повторов (категории 5 и 6).Не наблюдалось четкой разницы в структуре генома между образцами, собранными при 16 или 20 hpi. Однако конкатемеры генома чередующихся повторов MVM были более многочисленны при более низкой множественности инфицирования (1’000 gcp / клетка по сравнению с 10’000 gcp / клетка). В целом, мы идентифицировали промежуточные продукты репликации, как ожидалось из ранее описанной модели репликации генома MVM [9,10,13,31], и не нашли никаких указаний для генерации RCR-подобных продуктов репликации. Этот результат дополнительно подтверждает использование секвенирования нанопор для изучения механизмов репликации вирусного генома.

Рис. 4. Промежуточные продукты репликации MVM.

Показаны точечные графики двух репрезентативных индивидуальных считываний для каждой категории из инфицированных MVM клеток A9. Внехромосомную ДНК выделяли при 16 hpi из клеток A9, инфицированных MVM (MOI = 1’000).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009638.g004

Обсуждение

Репликация генома AAV2 в присутствии AdV, как ранее описывалась, происходила в режиме амплификации с вращающейся шпилькой [1,7,9,13].Мы предоставляем доказательства из секвенирования нанопор и анализа по Саузерну для альтернативного механизма репликации генома AAV2, когда HSV-1 является вирусом-помощником. Наши результаты ясно показывают обильное присутствие конкатемеров «голова к хвосту» (категория 3), в то время как конкатемеры «голова к голове» (категория 4) присутствуют в очень низких соотношениях. Конкатемеры «голова к хвосту» не были многочисленны ни в вирусных запасах AAV2, ни в клетках, инфицированных только AAV2, и поэтому должны быть индуцированы коинфекцией HSV-1. Кроме того, мы определили чтения, которые начинаются как конкатемеры «голова к хвосту», затем меняют ориентацию и снова продолжаются как конкатемеры «голова к хвосту» (категория 5).Обе категории, 3 и 5, были обнаружены в большом количестве в образцах RCA, опосредованных Phi29-полимеразой, что подтверждает нашу гипотезу о том, что наблюдаемые конкатемеры «голова к хвосту» геномов AAV2 возникают в результате механизма RCR. Однако мы не можем исключить дополнительный RHR в присутствии HSV-1, поскольку мы наблюдаем, хотя и на очень низких уровнях, конкатемеры геномов AAV2 с чередующейся ориентацией. Кроме того, низкая распространенность таких конкатемеров может быть связана с эффективным захватом trs , который предотвращает образование конкатемеров.

Есть две возможности того, как образуются конкатемеры «голова к хвосту»: межмолекулярная рекомбинация или RCR. Мы считаем RCR более вероятным. Если бы конкатемеры «голова к хвосту» были созданы с помощью межмолекулярной рекомбинации, вероятность конкатемеров, содержащих несколько копий генома с одинаковым направлением, была бы очень низкой. Мы наблюдали конкатемеры «голова к хвосту» до 13 повторов в одном и том же направлении. Вероятность того, что такие большие конкатемеры «голова к хвосту» образовались при концевой рекомбинации, будет равна 0.5 ¹³⁻¹ = 0,02% (вероятность 0,5 для рекомбинации голова к голове или голова к хвосту на каждом из 12 соединений). Более того, если бы конкатемеры генерировались в результате рекомбинации концов генома, а не RCR, мы могли бы ожидать большего разнообразия в структуре конкатемеров и большего количества чередующихся повторов.

Предыдущие исследования идентифицировали вспомогательные факторы для репликации AAV. Основные вспомогательные факторы AdV включают генные продукты E1a , E1b55K , E2a , E4orf6 и РНК VA [36,37].Было показано, что ни полимераза AdV, ни терминальный белок не опосредуют амплификацию генома AAV2 [36,38,39]. Таким образом, вспомогательные факторы AdV обеспечивают косвенную поддержку репликации генома AAV2. Минимальный набор вспомогательных факторов HSV-1, необходимых для поддержки репликации в модели временной инфекции AAV, представляет собой комплекс геликаза-примаза (HP; UL5 / UL8 / UL52) и одноцепочечный ДНК-связывающий белок ICP8 [40]. Несмотря на то, что этого было достаточно для стимуляции репликации, только комплекс HP и ICP8 были способны восстанавливать репликацию только до 1% по сравнению с репликацией, поддерживаемой HSV-1 дикого типа [41].Добавление плазмид, кодирующих белки HSV-1 ICP0, ICP4, ICP22 и полимеразу HSV-1 (UL30 / UL42) вместе с ICP8 и плазмидами, кодирующими комплекс HP, восстанавливали уровни репликации AAV до уровней, сравнимых с уровнем HSV-1 дикого типа. инфекция [42]. Было обнаружено, что белки HSV-1 ICP0, ICP4 и ICP22 трансактивируют экспрессию AAV rep , тем самым поддерживая репликацию [42]. Хотя было обнаружено, что клеточные полимеразы опосредуют репликацию генома AAV в присутствии AdV [43,44], было показано, что полимераза HSV-1 напрямую поддерживает репликацию генома AAV [44,45].Существенными факторами репликации генома HSV-1 являются ICP8, UL9, комплекс HP и полимераза HSV-1 [46]. Было также показано, что эти факторы опосредуют амплификацию по катящемуся кругу невирусной плазмидной ДНК в отсутствие исходного связывающего белка UL9 [22,23]. Таким образом, минимальные факторы, необходимые для репликации генома AAV, — это те же факторы, которые необходимы для опосредования RCR. Поскольку было обнаружено, что геном AAV легко циркулирует даже в отсутствие вируса-помощника [25], вполне вероятно, что репликация генома AAV, опосредованная HSV-1, происходит по механизму RCR.

Механизм RCR требует круглого шаблона. Было обнаружено, что AAV циркулирует в своем геноме внутри клетки-хозяина [24,25,47,48] и, таким образом, может использоваться в качестве субстрата во время RCR. Затем во время RCR начало репликации ДНК связывается с помощью белка, связывающего ориджин, и сайт-специфический ник вводится в одну цепь. Было продемонстрировано, что большие белки Rep AAV (Rep68 / 78) сайт-специфично связываются и разрывают геном AAV на trs внутри ITR [19]. После того, как произошло рассечение, ДНК ds разматывается геликазой и реплицируется ДНК-полимеразой.Было показано, что Rep68 / 78 обладает геликазной активностью [14]. По завершении полного цикла амплификации эндонуклеаза разрезает геном в источнике, высвобождая скопированную ДНК. Во время RCR бактерий или бактериофагов, как правило, эндонуклеаза, которая опосредует образование точек в источнике, остается ковалентно прикрепленной к 5′-концу, возможно, опосредуя второй разрыв после репликации генома (например, цистрон A белка бактериофага ϕX147 [49]). . Rep68 / 78 также остается ковалентно прикрепленным к 5’-концу генома AAV [38].Таким образом, большие белки Rep AAV обладают активностями, которые являются общими для белков, опосредующих RCR, что дополнительно подтверждает нашу гипотезу о механизме RCR во время репликации AAV2. Роль Rep68 / 78 во время RCR, опосредованного HSV-1, будет оценена в будущих исследованиях.

В дополнение к раскрытию структуры не описанных ранее промежуточных продуктов репликации ДНК AAV2, мы представляем высокопроизводительный метод исследования механизмов репликации вирусов. Уникальная особенность теоретически бесконечной длины секвенирования по технологии Oxford Nanopore Technology может быть использована для беспристрастного изучения промежуточных продуктов репликации на уровне отдельных молекул.В предыдущих подходах, таких как Саузерн-анализ, образцы оценивались в целом, и поэтому гетерогенные малочисленные промежуточные продукты репликации ДНК и временные структуры не обнаруживались. Наш подход выявил образование конкатемеров «голова к хвосту», неожиданных конкатемеров, таких как длинные повторы ITR-последовательности или комбинации конкатемеров «голова к хвосту» и чередующихся геномов. Дальнейшие исследования необходимы для решения вопроса о том, могут ли конкатемеры «голова к хвосту» и каким образом приводить к упаковываемым геномам AAV2.

Материалы и методы

Клетки и вирусы

клеток BJ (фибробласты крайней плоти, человек), Vero (почка, африканская зеленая обезьяна), Hela (рак шейки матки, человек), 293T (эмбриональная почка, человек) и A9 (фибробласты, мышь) были получены из ATCC (Манассас, Вирджиния, США). СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). Все клеточные линии поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамина, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, в увлажненном инкубаторе при 37 ° C. ° C и 5% CO ₂ .HSV-1 дикого типа (штамм F) выращивали, как описано ранее [50,51]. Сливающийся слой клеток Vero инфицировали при низкой множественности инфекции (MOI) и собирали, когда клетки проявляли полный цитопатический эффект (CPE). Клетки соскребали в среду, центрифугировали, и осадок клеток трижды замораживали и оттаивали. Супернатант и осадок клеток объединяли и снова центрифугировали. Аликвоты были сделаны из супернатанта и хранили при -80 ° C. Бляшкообразующие единицы (БОЕ) определяли с помощью анализа бляшек.

Очищенный AAV2 был произведен в Viral Vector Facility (Цюрихский университет, Швейцария), как описано ранее [52,53]. Запасы AAV2 дикого типа получали с использованием плазмиды pAV2, тогда как вариант AAV2 AAV201 получали с использованием плазмиды pSub201 [54,55]. Запасы MVM (протопарвовирус грызунов 1; клон VR-1346; АТСС) получали путем инфицирования полуконфлюэнтной культуры клеток A9, как описано ранее [56]. Супернатант клеточной культуры собирали через четыре дня после инфицирования (dpi), очищали низкоскоростным центрифугированием (3000 x g) и хранили в аликвотах при -70 ° C.Вирусную нагрузку определяли с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) и анализа средней инфекционной дозы тканевой культуры (TCID50).

Подготовка исходного образца AAV2 для секвенирования

Исходные образцы AAV2 (1,5 * 10 ¹¹ содержащих геном частиц) были предварительно обработаны 10U ДНКазой I (04716728001, Roche, Швейцария) в 1x буфере для ДНКазы в течение 15 минут при 37 ° C для удаления любой ДНК за пределами частиц. . Затем ДНКазу инактивировали, а капсиды денатурировали при 95 ° C в течение 5 мин.Образец использовали либо непосредственно для секвенирования нанопор, либо перед секвенированием выполняли осаждение Phe / CHCl ₃ , как описано в разделе ниже (экстракция Hirt).

Протокол заражения

Клетки высевали за 24 ч до заражения. Клетки BJ высевали на 8 * 10 ⁵ клеток / планшет для культуры ткани (диаметр 10 см; 172958, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с 8 планшетами для культивирования тканей на каждое условие. Вирус (AAV2 в присутствии или в отсутствие HSV-1) разводили в соответствующем объеме DMEM (0% FBS).Низкие объемы заражения были выбраны для усиления инфекции, но с обеспечением полного погружения клеточного слоя. Клетки помещали в увлажненный инкубатор при 37 ° C и 5% CO ₂ . Через 1-2 часа после инфицирования (hpi) супернатант удаляли и добавляли достаточное количество DMEM, содержащего 2% FBS. Клетки инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение указанного времени. Для инфекции MVM клетки A9 инокулировали при конфлюэнтности 20–30% для обеспечения экспоненциального роста клеток во время репликации [57].По одной колбе Т-150 на каждое условие инфицировали либо 10 мл неразбавленного, либо разбавленного 1/10 исходного раствора MVM, чтобы получить 10 000 и 1 000 эквивалентов генома на клетку, соответственно. Инокулят удаляли через 1 hpi и заменяли 15 мл DMEM, 10% FBS. Инфицированные клетки инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение указанного времени.

Удаление хирта

Экстракцию внехромосомной ДНК проводили по протоколу Hirt [58]. Клетки промывали PBS и отделяли с помощью 0.05% Трипсин-ЭДТА. Осадок клеток ресуспендировали в 50 мкл TBS (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,5). Затем добавляли 500 мкл буфера Hirt (0,6% SDS, 10 мМ Tris-HCl, 10 мМ EDTA, pH 7,5) и суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После добавления 120 мкл 5 М раствора NaCl образец инкубировали при 4 ° C не менее 12 часов. Для экстракции ДНК фенолом / хлороформом образец центрифугировали при 15’500 g в течение 10 мин при 4 ° C. Супернатант переносили в свежую пробирку и добавляли 1 объем смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1, об. / Об.).Образец центрифугировали при 15’500 g в течение 5 мин при 4 ° C. Супернатант переносили в свежую пробирку и добавляли 1 объем хлороформа. Образец центрифугировали 1 мин при 15’500 g и 4 ° C. Супернатант переносили в свежую пробирку и добавляли 2,5 объема EtOH (чистого) и 0,1 объема 3 М NaAc, pH 5,5, и суспензию инкубировали при -80 ° C в течение не менее 20 минут для осаждения ДНК. Образец центрифугировали при 18000 g в течение 10 минут при 4 ° C и супернатант отбрасывали.Осадок промывали 70% EtOH. После центрифугирования при 18 000 g в течение 10 минут при 4 ° C супернатант удаляли и осадок сушили на воздухе перед ресуспендированием в 10 мМ трис-HCl, pH 8,5.

Усилитель катящегося круга pUC19

Плазмидную ДНК

(pUC19, 2 нг) амплифицировали с использованием набора для кольцевой амплификации ДНК TempliPhi (25-6400-10, Cytiva, Marlborough, MA, USA) в соответствии с протоколом производителя. Затем была проведена очистка ДНК фенолом / хлороформом, как описано в протоколе экстракции Хирта выше.

Секвенирование нанопор

Секвенирование нанопор было выполнено исследовательской группой доктора А. Раметта (Бернский университет, Швейцария). Образцы ДНК, экстрагированные Hirt, были подготовлены для секвенирования с использованием набора для секвенирования лигирования (LSK109, Oxford Nanopore Technologies, Оксфорд, Великобритания) и набора для расширения нативного штрих-кодирования (EXP-NBD104, Oxford Nanopore Technologies, Оксфорд, Великобритания) в соответствии с протоколом производителя. Затем образцы секвенировали с использованием устройства для секвенирования GridION X5 и проточной ячейки (FLO-MIN-106, Oxford Nanopore Technologies, Оксфорд, Великобритания).

Анализ данных

Последовательности в формате fastq были преобразованы в формат fasta с помощью seqkit [59]. Считанные данные подвергали анализу blastn [60] против геномной последовательности AAV2 или MVM (Genbank # NC_001401 или NC_001510) или против последовательности плазмиды pUC19 (Genbank # M77789). Строки без совпадений и строки с комментариями были удалены (grep -v ‘#’), а таблицы считаны в R 4.0 (The R Foundation for Statistical Computing). Хиты с e-values> 0,1 были удалены. Для каждого чтения подсчитывались суммы всех совпадений.Считывания с суммой совпадений <3000 были удалены. Были нарисованы точечные графики оставшихся прочтений. Точечные графики были вручную распределены по категориям. Код для биоинформатического анализа можно найти в коде S1 Bioinformatic.

Саузерн-блот

Для анализа по Саузерну экстрахромосомную ДНК экстрагировали с использованием протокола Hirt. Обработку Hin dIII проводили при 37 ° C в течение 1 ч в 1х реакционном буфере B с 10 ед. Фермента Hin dIII на реакцию ( Hin dIII, 10656321001, Roche, Швейцария).Обработку нуклеазой бобов мунг проводили при 30 ° C в течение 30 мин в 1x буфере для реакции с нуклеазой бобов маш с 1 ед. На реакцию (нуклеаза бобов мунг, M0250S, New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США). ДНК (40 нг на образец) разделяли на 0,8% агарозном геле и переносили на нейлоновые мембраны (Hybond-N +, RPN119B, Amersham, Little Chalfont, UK). В качестве ссылки использовали DIG-меченный маркер (маркер молекулярной массы ДНК III, 11218602910, Roche). Гибридизацию с меченным дигоксигенином (DIG) зондом, специфичным для AAV2 rep , последующее обнаружение антителом против DIG, конъюгированным с щелочной фосфатазой, и активацию субстратом хемилюминесценции CDP Star (Roche) проводили в соответствии с протоколом производителя.Зонд, меченный DIG, был синтезирован с использованием набора для синтеза зонда PCR DIG ( 116360, Roche, Switzerland) и следующих праймеров: 5′-gaa cgc gat atc gca gcc gcc atg ccg gg-3 ‘и 5’-gga tcc gaa ttc act gct tct ccg agg taa tc-3 ‘. Хемилюминесценцию визуализировали с использованием системы визуализации LI-COR Odyssey Fc (LI-COR Biosciences, Линкольн, Северная Каролина, США).

Дополнительная информация

S1 Рис. Промежуточные продукты репликации ДНК AAV2.

Показаны точечные графики отдельных считываний, отнесенных к категории 7 (другие структуры) из коинфицированных AAV2 / HSV-1 клеток BJ.Внехромосомную ДНК выделяли при 12 hpi из клеток BJ, инфицированных AAV2 (gcp / клетка = 20’000) и HSV-1 (БОЕ / клетка = 1).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009638.s001

(TIF)

S2 Рис. Саузерн-анализ ДНК AAV2.

Саузерн-блот ДНК Hirt, экстрагированной при 15 hpi из клеток 293T (A) или при 20 hpi из клеток Hela (B), коинфицированных AAV2 (gcp / клетка = 20’000) и HSV-1 (БОЕ / клетка = 1) показаны необработанные (а) образцы, расщепленные Hin, dIII (b) или обработанные нуклеазой маша (с).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009638.s002

(TIF)

S3 Таблица. Далее считайте данные анализа внехромосомных последовательностей MVM, выделенных из инфицированных MVM клеток A9, или последовательностей AAV2 из одно- или инфицированных HSV-1 клеток BJ категории 2.

«A» и «V» указывают ориентацию, наблюдаемую в точечные графики. Для AAV-последовательностей «A» указывает на присутствие ковалентной связи на 5’-конце (сторона кэпа), тогда как «V» указывает на присутствие ковалентной связи на 3’-конце (сторона реплика).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009638.s006

(DOCX)

Благодарности

Благодарим Матиаса Аккермана за научные обсуждения. Мы благодарим Албана Раметта и Стефана Нойеншвандера за их поддержку в секвенировании нанопор. Мы благодарим Диниса Мейера за его поддержку в создании дизайна фигур. Мы благодарим Тобиаса Майланда за вычитку рукописи.

Список литературы

1. 1. Книп Д.М., Хоули П.М..Области вирусологии. 6-е изд. Филадельфия, Пенсильвания, 19103 США: Wolters Kluwer Health / Lippincott Williams & Wilkins; 2013.
2. 2. Самульски Р.Дж., Музыка Н. Опосредованная AAV генная терапия для исследовательских и терапевтических целей. Ежегодный обзор вирусологии. 2014; 1: 427–451. pmid: 26958729
3. 3. Lusby EW, Файф KH, Бернс KI. Нуклеотидная последовательность инвертированного концевого повторения в ДНК аденоассоциированного вируса. Журнал вирусологии. 1980; 34: 402-409. pmid: 6246271
4. 4.Шривастава А, Лусби Э.В., Бернс К.И. Нуклеотидная последовательность и организация генома аденоассоциированного вируса 2. Журнал вирусологии. 1983; 45: 555–564. pmid: 6300419
5. 5. Атчисон Р. В., Касто, Британская Колумбия, Хэммон, WMcD. Дефектные вирусные частицы, ассоциированные с аденовирусом. Наука. 1965; 754–755. pmid: 14325163
6. 6. Буллер Р.М., Яник Дж. Э., Себринг Е. Д., Роуз Дж. А. Вирус простого герпеса 1 и 2 типов полностью способствует репликации вируса, ассоциированного с аденовирусом. Журнал вирусологии.1981; 40: 241–247. pmid: 6270377
7. 7. Straus SE, Sebring ED, Rose JA. Конкатемеры чередующихся положительных и отрицательных цепей являются промежуточными продуктами синтеза ДНК вируса, ассоциированного с аденовирусом. Труды Национальной академии наук. 1976; 73: 742–746. pmid: 1062784
8. 8. Кавалье-Смит Т. Последовательности палиндромных оснований и репликация концов хромосом эукариот. Природа. 1974; 250: 467–470. pmid: 4469597
9. 9. Таттерсолл П., Уорд, округ Колумбия.Модель «катящаяся шпилька» для репликации парвовируса и линейной хромосомной ДНК. Природа. 1976; 263: 106–109. pmid: 967244
10. 10. Astell CR, Chow MB, Ward DC. Анализ последовательности концов вириона и репликативных форм миниатюрного вируса ДНК мышей предполагает модифицированную модель катящейся шпильки для автономной репликации ДНК парвовируса. Журнал вирусологии. 1985; 54: 171–177. pmid: 3973977
11. 11. Таттерсолл П., Кроуфорд Л.В., Шаткин А.Дж. Репликация парвовируса MVM II.Выделение и характеристика промежуточных продуктов при репликации вирусной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Журнал вирусологии. 1973; 12: 1446–1456. pmid: 4586779
12. 12. Hauswirth WW, Berns KI. Возникновение и прекращение репликации ДНК аденоассоциированного вируса. Вирусология. 1977; 78: 488–499. pmid: 867815
13. 13. Бернс К.И. Репликация парвовирусов. Микробиологические обзоры. 1990; 54: 316–329. pmid: 2215424
14. 14. Im D-S, Muzyczka N. Связывающий белок Rep68, являющийся источником AAV, представляет собой АТФ-зависимую сайт-специфичную эндонуклеазу с ДНК-геликазной активностью.Клетка. 1990; 61: 447–457. pmid: 2159383
15. 15. Самульски Р.Дж., Шривастава А., Бернс К.И., Музычка Н. Спасение аденоассоциированного вируса из рекомбинантных плазмид: коррекция генов в концевых повторах AAV. Клетка. 1983; 33: 135–143. pmid: 6088052
16. 16. Senapathy P, Tratschin JD, Carter BJ. Репликация ДНК аденоассоциированного вируса. Журнал молекулярной биологии. 1984; 178: 1–20. pmid: 60
17. 17. Lusby E, Bohenzky R, Berns KI. Инвертированное концевое повторение в ДНК аденоассоциированного вируса: независимость ориентации на обоих концах генома.Журнал вирусологии. 1981; 37: 1083–1086. pmid: 6262528
18. 18. Снайдер Р.О., Самульски Р.Дж., Музычка Н. Разрешение ковалентно соединенных концов хромосомы AAV in vitro. Клетка. 1990; 60: 105–113. pmid: 2153052
19. 19. Brister JR, Muzyczka N. Механизм Rep-опосредованного распространения аденоассоциированного вируса. Журнал вирусологии. 2000; 74: 7762–7771. pmid: 10933682
20. 20. Boehmer PE, Lehman IR. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК СИМПЛЕКС ВИРУСА ГЕРПЕС. Анну Рев Биохим.1997. 66: 347–384. pmid: 9242911
21. 21. Бёмер П., Нимонкар А. Репликация вируса герпеса. IUBMB Life (Международный союз биохимии и молекулярной биологии: Life). 2003; 55: 13–22. pmid: 12716057
22. 22. Скалитер Р., Махов А.М., Гриффит Дж. Д., Lehman IR. Репликация ДНК по катящемуся кругу экстрактами человеческих клеток, инфицированных вирусом простого герпеса 1 типа. Журнал вирусологии. 1996; 70: 1132–1136. pmid: 8551573
23. 23. Скалитер Р., Леман ИР.Репликация ДНК по катящемуся кругу in vitro с помощью комплекса ферментов, кодируемых вирусом простого герпеса типа 1. Труды Национальной академии наук. 1994; 91: 10665–10669. pmid: 7938010
24. 24. Дуан Д., Шарма П., Ян Дж., Юэ И, Дудус Л., Чжан Ю. и др. Циркулярные промежуточные соединения рекомбинантного аденоассоциированного вируса имеют определенные структурные характеристики, ответственные за долговременную эпидемическую персистентность в мышечной ткани. ДЖ ВИРОЛ. 1998; 72: 11. Pmid: 9765395
25. 25. Сунь X, Лу И, Биш LT, Кальседо Р., Уилсон Дж. М., Гао Г.Молекулярный анализ векторных структур генома после трансдукции в печени с помощью обычных и самокомплементарных векторов аденоассоциированных вирусных серотипов в моделях мышей и нечеловеческих приматов. Генная терапия человека. 2010. 21: 750–761. pmid: 20113166
26. 26. Радукич М.Т., Брандт Д., Хаак М., Мюллер К.М., Калиновски Дж. Нанопорное секвенирование одноцепочечной ДНК нативного аденоассоциированного вируса (AAV) с использованием быстрого протокола на основе транспозаз. НАР Геномика и биоинформатика. 2020; 2. pmid: 33575623
27. 27.Бернс К.И., Адлер С. Разделение двух типов аденоассоциированных вирусных частиц, содержащих комплементарные полинуклеотидные цепи. Журнал вирусологии. 1972; 9: 394–396. pmid: 5014934
28. 28. Донг Джи Йи, Фан Пи Ди, Фриззелл РА. Количественный анализ упаковочной способности рекомбинантного аденоассоциированного вируса. Генная терапия человека. 1996; 7: 2101–2112. pmid: 8934224
29. 29. Дин ФБ. Быстрая амплификация плазмидной и фаговой ДНК с использованием ДНК-полимеразы Phi29 и многократной амплификации с вращающимся кругом.Геномные исследования. 2001; 11: 1095–1099. pmid: 11381035
30. 30. Ducani C, Bernardinelli G, Högberg B. Для репликации по катящемуся кругу требуется одноцепочечный ДНК-связывающий белок, чтобы избежать терминации и образования двухцепочечной ДНК. Исследования нуклеиновых кислот. 2014; 42: 10596–10604. pmid: 25120268
31. 31. Туллис Дж., Шоборг Р.В., Пинтель Диджей. Характеристика временного накопления мельчайших вирусов в репликативных промежуточных продуктах мышей. Журнал общей вирусологии.1994; 75: 1633–1646. pmid: 8021594
32. 32. Astell CR, Thomson M, Merchlinsky M, Ward DC. Полная последовательность ДНК мелкого вируса мышей, автономного парвовируса. Исследования нуклеиновых кислот. 1983; 11: 999–1018. pmid: 6298737
33. 33. Astell CR, Gardiner EM, Tattersall P. Последовательность ДНК лимфотропного варианта минутного вируса мышей, MVM (i), и сравнение с последовательностью ДНК штамма фибротропного прототипа. Журнал вирусологии. 1986; 57: 656–669. pmid: 3502703
34. 34.Willwand K, Baldauf AQ, Deleu L, Mumtsidu E, Costello E, Beard P и др. Неструктурный белок NS1 крошечного вируса мышей (MVM) индуцирует образование ДНК MVM в уникальном участке теломеры правого конца как в шпильке, так и в дуплексной конформации in vitro. Журнал общей вирусологии. 1997; 2647–2655. pmid: 9349487
35. 35. Вольфисберг Р., Кемпф С., Рос С. Этапы позднего созревания, предшествующие селективному ядерному экспорту и выходу потомства парвовируса. Макфадден Дж., Редактор. J Virol.2016; 90: 5462–5474. pmid: 27009963
36. 36. Weitzman MD, Linden RM. Биология аденоассоциированного вируса. В: Снайдер Р.О., Мулье П., редакторы. Аденоассоциированный вирус. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press; 2012. С. 1–23. Доступно: http://link.springer.com/10.1007/978-1-61779-370-7_1
37. 37. Мейер А.Ф., Фрефель С., Сейфферт М. Взаимодействие между адено-ассоциированным вирусом и его вспомогательными вирусами. Вирусы. 2020; 12:32 pmid: 32575422
38. 38. Снайдер Р.О., Им Д.С., Музыка Н.Доказательства ковалентного прикрепления реп-белка аденоассоциированного вируса (AAV) к концам генома AAV. Журнал вирусологии. 1990; 64: 6204–6213. pmid: 2173787
39. 39. Straus SE, Ginsberg HS, Rose JA. Мутанты аденовируса типа 5, чувствительные к температуре без ДНК, способствуют репликации вируса, ассоциированного с аденовирусом. Журнал вирусологии. 1976; 17: 140–148.
40. 40. Weindler FW, Heilbronn R. Подмножество генов репликации вируса простого герпеса обеспечивает вспомогательные функции для продуктивной репликации аденоассоциированного вируса.Журнал вирусологии. 1991; 65: 2476–2483. pmid: 1850024
41. 41. Сланина Х., Вегер С., Стоу Н.Д., Кухрс А., Хейлбронн Р. Роль комплекса геликаза-примаза вируса простого герпеса во время репликации ДНК аденоассоциированного вируса. Журнал вирусологии. 2006; 80: 5241–5250. pmid: 16699004
42. 42. Алазард-Дэни Н., Николас А., Плокин А., Штрассер Р., Греко А., Эпштейн А. Л. и др. Определение вспомогательных действий вируса простого герпеса типа 1 для случаев ранней репликации аденоассоциированного вируса.О’Хара П., редактор. PLoS Патогены. 2009; 5: e1000340. pmid: 19282980
43. 43. Нэш К., Чен В., Музычка Н. Полная реконструкция in vitro аденоассоциированной вирусной ДНК для репликации требует белков комплекса поддержания минихромосом. Журнал вирусологии. 2008. 82: 1458–1464. pmid: 18057257
44. 44. Ханда Х, Картер Б.Дж. Комплексы репликации ДНК аденоассоциированного вируса в клетках, инфицированных вирусом простого герпеса или аденовирусом. Журнал биологической химии.1979; 254: 6603–6610. pmid: 221504
45. 45. Уорд П., Фалькенберг М., Элиас П., Вайцман М., Линден Р.М. Реп-зависимая инициация репликации ДНК адено-ассоциированного вируса типа 2 комплексом репликации вируса простого герпеса типа 1 в восстановленной системе. Журнал вирусологии. 2001; 75: 10250–10258. pmid: 11581393
46. 46. Ву, Калифорния, Нельсон, штат Нью-Джерси, МакГеоч, Д.Д., Чалберг, Мэриленд. Идентификация генов вируса простого герпеса типа 1, необходимых для синтеза ДНК в зависимости от происхождения. Журнал вирусологии.1988. 62: 435–443. pmid: 2826806
47. 47. Мусатов С.А., Скалли Т.А., Дудус Л., Фишер К.Дж. Индукция циркулярных эписом во время спасения и репликации аденоассоциированного вируса в экспериментальных моделях латентности вируса. Вирусология. 2000; 275: 411–432. pmid: 10998340
48. 48. Накаи Х., Янт С.Р., Сторм Т.А., Фьюсс С., Мёз Л., Кей М.А. Геномы внехромосомных рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов в первую очередь ответственны за стабильную трансдукцию в печени in vivo. J Virol.2001; 75: 6969–6976. pmid: 11435577
49. 49. Айзенберг С., Гриффит Дж., Корнберг А. Цистрон 4X174 Белок представляет собой многофункциональный фермент репликации ДНК. Proc Natl Acad Sci USA. 1977; 74: 3198–3202. pmid: 269383
50. 50. Саттер С.О., Маркони П., Мейер А.Ф. Рост, подготовка и анализ вируса простого герпеса. В: Diefenbach RJ, Fraefel C, editors. Вирус простого герпеса: методы и протоколы. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer Нью-Йорк; 2020. С. 57–72. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9814-2_3 pmid: 31617172
51. 51.де Оливейра А.П., Глаузер Д.Л., Лаймбахер А.С., Штрассер Р., Шранер Э.М., Уайлд П. и др. Живая визуализация динамики компартмента вируса простого герпеса 1 типа. Журнал вирусологии. 2008; 82: 4974–4990. pmid: 18337577
52. 52. Фогель Р., Сейфферт М., Штрассер Р., де Оливейра А. П., Дреш С., Глаузер Д. Л. и др. Аденоассоциированный вирус типа 2 модулирует реакцию на повреждение ДНК хозяина, вызванную вирусом простого герпеса 1 во время коинфекции. Журнал вирусологии. 2012; 86: 143–155. pmid: 22013059
53. 53.Золотухин С., Бирн Б.Дж., Мейсон Э., Золотухин И., Поттер М., Чеснут К. и др. Очистка рекомбинантного аденоассоциированного вируса с использованием новых методов улучшает инфекционный титр и урожайность. Gene Ther. 1999; 6: 973–985. pmid: 10455399
54. 54. Самульски Р.Дж., Чанг Л.С., Шенк Т. Рекомбинантная плазмида, из которой in vitro может быть вырезан геном инфекционного аденоассоциированного вируса, и ее использование для изучения репликации вируса. Журнал вирусологии. 1987. 61: 3096–3101. pmid: 3041032
55. 55.Лафлин С, Трачин Джей-Ди, Енот Х, Картер Би Джей. Клонирование геномов инфекционных аденоассоциированных вирусов в бактериальных плазмидах. Ген. 1983; 65–73. pmid: 6352411
56. 56. Лейзи Р., Вольфисберг Р., Новак Т., Калиаро О., Хеммерле А., Рот Н. Дж. И др. Влияние изоэлектрической точки модельных парвовирусов на задержку вируса в анионообменной хроматографии. Биотехнология Биоинженерия. 2020; 1–14. pmid: 32886351
57. 57. Таттерсолл П. Репликация парвовируса MVM I.Зависимость размножения вирусов и образования бляшек от роста клеток. Журнал вирусологии. 1972; 10: 586–590. pmid: 4673484
58. 58. Хирт Б. Селективная экстракция ДНК полиомы из инфицированных культур клеток мыши. Журнал молекулярной биологии. 1967. 26: 365–369. pmid: 4291934
59. 59. Шен В., Ле С, Ли И, Ху Ф. SeqKit: кроссплатформенный и сверхбыстрый инструментарий для работы с файлами FASTA / Q. Zou Q, редактор. PLoS ONE. 2016; 11: e0163962. pmid: 27706213
60. 60.Альтшул С.Ф., Гиш В., Миллер В., Майерс Е. В., Липман Д. Д.. Базовый инструмент поиска местного выравнивания. J Mol Biol. 1990; 215: 403–410. pmid: 2231712

Метод нелинейной оптимизации для извлечения сводной статистики из графиков выживаемости Каплана-Мейера с использованием опубликованного значения P | BMC Medical Research Methodology

Вывод основных уравнений и описание алгоритма

При сборе данных о выживаемости участники исследования либо переживают измеренное событие, либо подвергаются цензуре в определенный момент времени.Оценка выживаемости Каплана-Мейера (уравнение 1), используемая для построения графика Каплана-Мейера, представляет собой просто вероятность выживания от одного интервала до следующего, умноженную вместе, чтобы получить кумулятивную вероятность выживания [1].

— Оценка выживаемости Каплана-Мейера

$$ S \ left ({t} _j \ right) = S \ left ({t} _ {j-1} \ right) \ left (1- \ frac {e_j} {n_j} \ right) $$

(1)

Где S ( t _j ) — вероятность быть живым в данный момент t _j , e _j — количество событий при t _j и n _j — количество пациентов, живущих непосредственно перед t _j .

Если исследование проводится и все участники переживают событие так, что цензура не происходит, эта оценка выживаемости представляет собой просто отношение количества людей, свободных от событий в момент времени t , деленное на количество людей, принявших участие в исследовании. Таким образом, в случаях, когда есть цензура, комбинация вероятности выживания и точной оценки числа подвергнутых цензуре участников позволит восстановить полную таблицу выживаемости Каплана-Мейера. В оценке выживаемости Каплана-Мейера число подвергнутых цензуре участников на уровне t _j формально не определено, но входит в число подверженных риску и может быть выделено путем определения n _j ( экв.2).

— Определить n _j

$$ {n} _j = {n} _ {j-1} — \ left ({censor} _ {j-1} + {e} _ {j -1} \ вправо) $$

(2)

Теперь, когда цензорное значение выделено, оценка выживаемости Каплана-Мейера может быть преобразована для расчета количества событий при t _j на основе вероятности выживания, извлеченной из графика KM.

— Переставьте (1), чтобы найти e _j

$$ {e} _j = {n} _j- \ left \ {{n} _j \ left [\ frac {S \ left ( {t} _j \ right)} {S \ left ({t} _ {j-1} \ right)} \ right] \ right \} $$

(3)

Наконец, замените (ур.2) в (уравнение 3), чтобы вывести уравнение, которое вычисляет количество событий на основе вероятности выживания и уровня цензуры на t _j .

— Замените n _j на (2) в (3), чтобы переопределить e _j

$$ {e} _j = \ left [{n} _ {j-1} — \ left ({censor} _ {j-1} + {e} _ {j-1} \ right) \ right] — \ left \ {\ left [{n} _ {j-1} — \ left ({ цензор} _ {j-1} + {e} _ {j-1} \ right) \ right] \ left (\ frac {S \ left ({t} _j \ right)} {S \ left ({t} _ {j-1} \ right)} \ right) \ right \} $$

(4)

С помощью приведенного выше уравнения теперь можно создать таблицу с подробным описанием количества событий, степени цензуры, количества подверженных риску, а также ожидаемого количества событий для каждой временной точки.Это позволяет рассчитать HR с использованием (уравнение 5), а также вычислить степень значимости с помощью лог-рангового теста, широко используемого метода генерации значения P , которое обычно публикуется вместе с графиком KM.

Функция отношения рисков

$$ HR = \ frac {O_1 / {E} _1} {O_2 / {E} _2} $$

(5)

Где O _1/2 и E _1/2 — наблюдаемое и ожидаемое общее количество событий для группы 1 и 2, соответственно.2} {E_i} $$

(6)

Где O _i и E _i — наблюдаемое и ожидаемое общее количество событий для группы i , соответственно, с g количеством групп.

Проработка вышеизложенного представлена ​​в Дополнительном файле 1, чтобы проиллюстрировать метод.

На данный момент шаблон цензуры еще неизвестен, но есть фиксированная точка, т.е.статистика критерия хи-квадрат, которая напрямую связана с этими значениями через полную таблицу выживаемости, рассчитанную для теста логарифмического ранга. Таким образом, каждое значение цензуры становится неизвестным числом, которое необходимо решить, чтобы удовлетворить статистике критерия хи-квадрат для расчета оптимального решения. Такие проблемы можно решить с помощью нелинейной оптимизации (nlopt). Nlopt решает общие проблемы нелинейной оптимизации вида:

минимизировать f ( x ) x в R ⁿ

Так что

$$ g (x) \ le 0, \ kern0.50em h (x) = 0, \ kern0.50em lb \ le x \ le ub $$

, где f — целевая функция, которую нужно минимизировать, а x — n параметров оптимизации. Lb и ub представляют нижний и верхний пределы для x. g ( x ) представляет собой ограничение (я) неравенства, а h ( x ) представляет ограничение (я) равенства.

В случае использования nlopt для решения этой проблемы, нашим объективным значением, которое необходимо решить, является статистика критерия хи-квадрат, рассчитанная как в (уравнение 6).2} {Ei} — \ mathrm {известное} \ \ mathrm {chi} \ \ mathrm {в квадрате} \ \ mathrm {test} \ \ mathrm {statistic} \ le 0 $$

(8)

В случае, когда значение P выражено как более 0,05 или незначимо, мы меняем знак для статистики хи-квадрат, чтобы установить минимальное значение для правостороннего значения P как p = 0,05 ( X ² = 3,841), при этом мы также установили максимальный предел p = 0,95 ( X ² = 3.nC2j + E2j- \ mathrm {N} {2} _0 $$

(10)

Где C1 и C2 — цензорные значения в момент времени j в плечах 1 и 2 соответственно; E1 и E2 — это события в момент времени j в плечах 1 и 2 соответственно, а N1 ₀ и N2 ₀ — начальные числа в группе риска в плечах 1 и 2. Где n — количество моментов времени.

Для решения этой проблемы существует множество программных пакетов, но интерфейс R для NLopt (библиотека с открытым исходным кодом для алгоритмов нелинейной оптимизации [17]) прост в использовании и может быть написан с использованием R (версия 3.5.2, Вена, Австрия). В оболочке NLopt доступно несколько процедур оптимизации, но slsqp был выбран алгоритм последовательного (наименьших квадратов) квадратичного программирования (SQP), поскольку он поддерживает ограничения как равенства, так и неравенства. Скрипты R можно найти в следующем онлайн-репозитории: https://gitlab.com/EdGreen21/irvinekm

Допущения модели

Поскольку тесты (лог-ранг и пропорциональные опасности Кокса) использовались для получения требуемых значений P поскольку этот метод основан на пропорциональных опасностях (PH) [18], следует предположить, что этот метод будет работать наиболее оптимально при допущении пропорциональных опасностей.Однако, если предположение о PH не сильно нарушено, мы считаем, что метод nlopt по-прежнему будет работать хорошо. См. Обсуждение для более подробной информации.

Извлечение координат X, Y из опубликованных графиков КМ

Точки были извлечены с использованием дистрибутива ImageJ для Фиджи (версия 1.52p; NIH, США). График KM сначала загружается в ImageJ, и на рисунке рисуется прямоугольник, соответствующий известной области X, Y, для калибровки осей с помощью подключаемого модуля калибровки фигуры (Фредерик В. Хессман, Геттингенский университет).Чтобы облегчить чтение точек на графике, вертикальные линии, соответствующие заданному времени, были автоматически нарисованы на фигуре с использованием специального сценария, написанного на Фиджи. Из-за конструкции метода каждое значение времени должно иметь соответствующее значение y из плеча 1 и 2. Соответствующие данные должны храниться в трех столбцах: Время (t), Рука 1 (y ₁ ) Рука 2 (y ₂ ). По определению t ₀ должно быть 0, а соответствующая вероятность выживания — 1 для каждой руки. Значения времени не должны дублироваться i.е. они должны увеличиваться в количестве на каждой итерации, хотя значения y1 / y2 могут оставаться такими же, но, очевидно, не увеличиваться (функция уменьшения монотонности). Учитывая это, в сценарий R и онлайн-версию метода была включена функция проверки ввода данных пользователем в соответствии с этими правилами, чтобы гарантировать, что ложные результаты не выводятся методом nlopt в случае, если пользователь случайно вводит данные, которые аннулируют приведенные выше правила. Это похоже на проверки ввода, включенные при написании метода Гайо как функции Stata [19].

Извлечение ln (HR) и var. ln (HR) из статьи Parmar

Рисунки 2 и 3 из статьи, опубликованной Parmar [4], представляют собой графики X, Y, отображающие ln (HR) и var. Значения ln (HR), полученные в результате сравнения метода кривой выживаемости и прямой или косвенной оценки этих значений. На оси X нанесены графики ((кривая выживаемости + прямая / косвенная) / 2), а на оси Y (кривая выживаемости — прямая / косвенная). Тот же метод, описанный для извлечения значений из графиков КМ, был использован для извлечения координат X, Y для этих фигур.Чтобы извлечь эти значения из приведенного выше, уравнения были перегруппированы следующим образом: кривая выживаемости ln (HR) или var ln (HR) = \ (x + \ frac {y} {2} \); Прямое / косвенное ln (HR) или var = \ (x- \ frac {y} {2} \)

Где x и y представляют значения, извлеченные из фиг. 2 и 3 из Parmar et al. [8].

Затем рассчитывалась средняя абсолютная ошибка (MAE), как показано ниже.

Расчет средней абсолютной ошибки и анализ статистической значимости

MAE для ln (HR) и var.ln (HR) рассчитывались путем вычитания рассчитанных значений из известных опубликованных значений и взятого абсолютного значения. Аналогичным образом рассчитывались средние абсолютные значения в процентах. Для оценки статистической значимости в Prism (GraphPad, версия 8) использовали односторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Краскела-Уоллиса.

Оценка количества и положения точек, необходимых для оптимального решения

Для оценки количества точек, необходимых для оптимального решения с использованием nlopt, были использованы индивидуальные данные пациента (IPD) из трех исследований [20,21,22,22 ].Таблица вероятности выживания Каплана-Мейера была сначала построена с использованием пакета « Survival » в R и фактического времени и вероятностей выживания каждый раз, когда происходило событие или цензура (то есть таблица выживаемости KM) для каждой руки, сохраненной в виде векторов. Затем случайное значение времени было взято из одной из кривых выживаемости и выбрано соответствующее значение выживаемости для этого конкретного значения времени. Если на другой кривой не было идентичного значения (что иногда имело место, поскольку разные группы часто переживают события в несколько разное время), было выбрано максимальное значение по обе стороны от этого значения X.По сути, это отражает процесс, необходимый для считывания вероятности выживания с графика КМ в разные моменты времени. Это повторялось с 5-точечными интервалами, и было выполнено 100 симуляций Монте-Карло с использованием метода nlopt для определения ln (HR) и var. ln (HR), как описано. В целом, 50 точек были использованы для двух исследований [20, 22] и 30 для оставшегося исследования, что представляло максимальное количество временных точек в фактическом наборе данных [21]. Затем были рассчитаны сводные статистические данные по этим результатам и построены средние значения и стандартные отклонения с использованием Prism (GraphPad, версия 8).

Эксперименты по взвешенному моделированию проводились с использованием в общей сложности 30 точек, распределенных в соответствии с определенными весами на графике КМ, разделенном на три равных сектора по времени в соответствии с таблицей 3.

Бенчмаркинг метода nlopt

Бенчмаркинг nlopt Метод с использованием точного и неточного значения P был проведен на портативном компьютере с процессором Intel® Core ™ i5–6200 @ 2,30 ГГц с 8 ГБ установленной оперативной памяти. Бенчмаркинг рассчитывался как разница во времени между «Sys.time () ”в R в начале и в конце выполнения 100 итераций каждого из 13 графиков КМ, описанных для проверки метода nlopt на рис. 1. Среднее значение этих времен было взято и нанесено на график для каждого графика КМ.

Рис. 1

Сравнение абсолютной ошибки, связанной с ln (HR) и var. ln (HR) рассчитано с использованием метода Parmar и nlopt (точное и неточное значение P ). Ln (HR) и var. ln (HR) оценивали по графикам 13 км с использованием метода Parmar и nlopt (точное и неточное значение P ).Затем абсолютная ошибка была рассчитана на основе известных фактических значений, опубликованных в каждой статье. График представляет ln (HR) ( a ) и var. ln (HR) ( b ) каждого отдельного исследования, рассчитанное с использованием каждого метода с горизонтальной линией в каждом столбце, равной среднему значению. Статистическая значимость оценивалась с использованием однофакторного дисперсионного анализа с тестом множественных сравнений Краскела-Уоллиса. ** = P <0,01, ns = P > 0,05

Биологические инструменты для 4D клеточной физиологии

Органайзеры

Люк Лавис, Исследовательский кампус Джанелии / HHMI
Элисон Тебо, Исследовательский кампус Джанелии / HHMI
Джордан Мейер, NCI / NIH

Динамики

Полина Аникеева, Массачусетский технологический институт
Эрик Анслин, Техасский университет в Остине
Бернд Боденмиллер, Цюрихский университет
Эд Бойден, HHMI / Массачусетский технологический институт Донахер 9028 Кейтлин Дама
Дуг Фаулер, Вашингтонский университет
Джеймс Франк, Орегонский университет здоровья и науки
Бенедикт Гейер, Институт морской микробиологии Макса Планка
Шуо Хан, Стэнфордский университет
Элизабет Хиллман, Колумбийский университет 9028
Клаудиа Хёбартнер, Вюрцбургский университет
Лаура Кисслинг, Массачусетский технологический институт
Эмма Лундберг, TH Королевский технологический институт
Zhuoran Ma, Stanford University
Qunxiang Ounxiang Европейский Лаборатория молекулярной биологии (EMBL)
Schraga Schwartz, Weizmann Institute
Lixue Shi, Columbia University
Aaron Streets, University of California
Winston Timp, Johns Hopkins University California University,
2 Технологический институт Лю Вей
Peng Wu, Scripps Research Institute
Tian Zeng, California Institute of Technology

Лидеры обсуждения

Abraham Beyene, Janelia Research Campus / HHMI
Raj Chari, Frederick National Laboratory for Cancer Research,
Teng-Leong Chew, Janelia Research Campus / HHMI
Claire Deo, The European Molecular Biology Laboratory (European Molecular Biology Laboratory)
Эйлин Ферлонг, Европейская лаборатория молекулярной биологии (EMBL)
Тим Харрис, Исследовательский кампус Джанелии / HHMI
Эми Палмер, Университет Колорадо, Боулдер
Кайвон Педрам, Исследовательский кампус Джанелии Роуэн / Сара , Northeastern University
Hari Shroff, NIBIB / NIH
David Stern, Janelia Research Campus / HHMI

.