Для обозначения схемы выхода с открытым коллектором в стандартном символе затвора используется специальный маркер. Здесь показан символ затвора инвертора с выходом с открытым коллектором:

Имейте в виду, что состояние «высокого» по умолчанию входа с плавающим затвором справедливо только для схем TTL и не обязательно для других типов, особенно для логических вентилей, построенных на полевых транзисторах.

Обзор

• Инвертор, или НЕ, вентиль — это вентиль, который выводит состояние, противоположное входному. То есть «низкий» вход (0) дает «высокий» выход (1), и наоборот.
Схемы затвора
• , состоящие из резисторов, диодов и биполярных транзисторов, как показано в этом разделе, называются TTL . TTL — это аббревиатура от Transistor-to-Transistor Logic . В схемах затвора используются и другие методологии проектирования, в некоторых из которых используются полевые транзисторы, а не биполярные транзисторы.
• Считается, что затвор является источником , источником тока, когда он обеспечивает путь для тока между выходным выводом и положительной стороной источника питания постоянного тока (V _cc ). Другими словами, он подключает выходную клемму к источнику питания (+ V).
• Считается, что затвор принимает ток , когда он обеспечивает путь для тока между выходным контактом и землей. Другими словами, это заземление (опускание) выходной клеммы.
Цепи затвора
• с общим полюсом Выходные каскады способны как источник , так и потреблять ток .Цепи затвора с выходными каскадами с открытым коллектором способны только потреблять ток, но не истощать ток. Затворы с открытым коллектором практичны, когда используются для управления входами затвора TTL, потому что входы TTL не требуют источника тока.

Сопутствующие рабочие листы

Разработка модульных и ортогональных генетических логических вентилей для надежной цифровой синтетической биологии

Проектирование схем и характеристика компонентов управления

Логический элемент И (Рис.1; Дополнительный Рис.S1) содержит два коактивирующих гена hrpR и hrpS и один σ ⁵⁴ -зависимый промотор hrpL и может объединять два взаимозаменяемых входных сигнала окружающей среды для генерации одного взаимозаменяемого выхода. Выходной промотор hrpL активируется только тогда, когда оба созависимых HrpR и HrpS-энхансер-связывающие белки присутствуют в гетеромерном комплексе ³⁰ , с активностью промотора hrpL по умолчанию, близкой к нулю. Из-за требований модульности и входы, и выход логического элемента AND были спроектированы как промоторы, что позволяет подключать входы к любым входным промоторам, а выход — подключать к любым генным модулям ниже по потоку для управления различными клеточными ответами.Однако выбрать правильные компоненты, такие как регулируемые промоторы и RBS (сайты связывания рибосом), чтобы управлять логическим элементом AND и продемонстрировать его функциональность в соответствующем контексте, является нетривиальной задачей. Это связано не только с тем, что многие компоненты недостаточно хорошо охарактеризованы или охарактеризованы только в их собственных конкретных контекстах, но также из-за множества факторов, которые влияют на экспрессию генов в живых клетках, таких как шасси клетки ³⁶ , среда ³⁷ (включая источник углерода), температуру и компонент встроенной последовательности контекст ^38,39 , как 5′-нетранслируемая область.Вместо использования стандартного метода проб и ошибок мы решили систематически охарактеризовать каждую часть-кандидат и подмодуль в различных контекстах (как абиотических, так и генетических), чтобы обеспечить надежный выбор компонентов для разработки функционального устройства в соответствующем контексте. .

Логический элемент И разработан на основе модуля гетерорегуляции σ ⁵⁴ hrpR / hrpS .Два реактивных промотора, P ₁ и P ₂ , действуют как входы для управления транскрипцией hrpR и hrpS и отвечают на небольшие молекулы I ₁ и I ₂ , соответственно. . Транскрипция выходного промотора hrpL включается только тогда, когда присутствуют оба белка HrpR и HrpS и связывают вышестоящую последовательность активатора для ремоделирования закрытого транскрипционного комплекса σ ⁵⁴ -RNAP- hrpL в открытый комплекс транскрипции. Гидролиз АТФ.Показанный результат — репортер gfp . RBS используется для настройки динамического диапазона входов или выходов устройства. Входы регулирующего промотора и выход gfp являются взаимозаменяемыми. Логический элемент AND ортогонален генетическому фону E. coli и не зависит от его обычно используемого σ ⁷⁰ -зависимого пути транскрипции.

Для проверки интеграционного поведения логического элемента И мы выбрали три реактивных промотора в качестве потенциальных входов и систематически охарактеризовали их: индуцируемый изопропилтиогалактозидом (IPTG) P _lac , индуцируемый арабинозой P _BAD и сигнал кворума N — (3-оксогексаноил) -L-гомосерин лактон (AHL) -индуцибельный P _lux (дополнительные рисунки S2 и S3).В качестве кандидатов-хозяев были выбраны два клеточных штамма, E. coli MC4100 и E. coli MC1061, в хромосомах которых были удалены промоторы P _lac и P _BAD . Использовали химически четко определенную среду M9, в которую в качестве источника углерода добавляли либо глюкозу (M9-глюкоза), либо глицерин (M9-глицерин). Шесть RBS, о которых сообщалось с различной эффективностью трансляции (таблица 1), использовали для характеристики каждого промотора, чтобы найти соответствующие пары промотор / RBS для ввода в логический элемент AND.Кроме того, для оценки влияния температурных колебаний использовались две температуры: 30 и 37 ° C.

Чтобы оценить поведение промотора в различных шасси и средах, три регулируемых промотора были сначала охарактеризованы в двухклеточном шасси, выращенном в двух средах при 30 ° C. Как показано на рисунке 2a, P _lac почти открыт и не дает желаемых характеристик переключения в E. coli MC4100, выращенных в M9-глицерине, что может быть связано с непреднамеренным взаимодействием P _lac с эндогенными генетический фон этого хозяина.В E. coli MC4100, выращенном в M9-глюкозе (рис. 2b), P _BAD значительно ингибируется из-за эффекта катаболизма репрессии глюкозы (0,01% мас. / Об.). P _lac не чувствителен к этому эффекту при таком уровне глюкозы и является индуцибельным (рис. 2a), тогда как P _lux слегка ингибируется (рис. 2c). В E. coli MC1061, выращенной в М9-глицерине, все три промотора давали желаемые индуцибельные характеристики переключения включения и выключения. Чтобы определить входы, которые чаще всего подвергаются цифровой индукции для логического элемента И, необходимо выполнить условия ( E.coli MC1061, M9-глицерин, 30 ° C) были выбраны в качестве стандартного контекста для последующей работы по характеризации.

( a — c ) Дозовые реакции промоторов P _lac ( a ), P _BAD ( b ) и P _lux ( c ) на восемь увеличивающихся индукций уровни в двухэлементном шасси ( E. coli, MC4100 или E.coli MC1061) в среде M9-глицерина или M9-глюкозы. Тот же самый репортер gfp с сильным RBS (rbs30- gfp ) использовали для измерения выходной флуоресценции ответа промотора. ( d — f ) Дозовые характеристики P _lac ( d ), P _BAD , ( e ) и P _lux ( f ) с использованием 6 версий RBS под различными уровни индукции (0, 3,9 × 10 ⁻⁴ , 1,6 × 10 ⁻³ , 6,3 × 10 ⁻³ , 2.5 × 10 ⁻² , 0,1, 0,4, 1,6, 6,4 и 12,8 мМ IPTG для P _lac ; 0, 3,3 × 10 ⁻⁴ , 1,3 × 10 ⁻³ , 5,2 × 10 ⁻³ , 2,1 × 10 ⁻² , 8,3 × 10 ⁻² , 0,33, 1,3, 5,3 и 10,7 мМ арабиноза для P _BAD ; и 0, 1,5 · 10 ⁻³ , 6,1 · 10 ⁻³ , 2,4 · 10 ⁻² , 9,8 · 10 ⁻² , 3,9 · 10 ⁻¹ , 1,6, 6.3, 25 и 100 нМ AHL для P _люкс ) и соответствия (сплошные линии) функции передачи промотора.( г — i ) Охарактеризованные дозовые характеристики P _lac ( г ), P _BAD , ( h ) и P _lux ( i ) при температуре ниже 30 ° C и 37 ° C соответственно, и данные совпадают (сплошные линии). Здесь rbsH был выбран для P _lac и rbs33 для P _BAD и P _lux . Используемые концентрации индукторов такие же, как в d — f . В a — i все данные (флуоресценция / OD ₆₀₀ ) представляли собой среднее значение трех независимых повторов в E.coli MC1061 в M9-глицерине при 30 ° C, если не указано иное. Планки погрешностей, s.d. ( n = 3). а.е., условные единицы.

Шесть RBS, rbs30-34 плюс rbsH, затем использовали для характеристики трех промоторов в выбранном стандартном контексте для поиска сбалансированных пар промотор / RBS. На рис. 2d – f показано, что максимальный ответ каждого промотора значительно различается при использовании разных RBS. Поразительно, но мы обнаружили, что порядок силы шести RBS у этих трех промоторов различается.Это в значительной степени связано с различными 5′-нетранслируемыми областями, следующими за каждым промотором (дополнительный рис. S4), которые могут изменять вторичную структуру и стабильность транскриптов. Очевидно, что одна и та же часть, например RBS, используемая в разных контекстах последовательности, может приводить к разному количественному поведению, как показано в другом исследовании ³⁸ . Ответы каждого промотора с использованием шести RBS становятся подобными после нормализации (дополнительный рисунок S5), что позволяет предположить, что RBS можно использовать в качестве линейного усилителя для регулирования уровня экспрессии белка в устойчивом состоянии.

Влияние изменения температуры исследовали путем определения характеристик промоторов при двух температурах 30 и 37 ° C, в других стандартных условиях культивирования. На рис. 2g – i показано, что влияние сдвига температуры на три промотора различно. Для P _BAD изменение температуры от 30 до 37 ° C имеет лишь небольшой эффект. Но P _lux становится более негерметичным при 30 ° C, чем при 37 ° C, а P _lac имеет более высокий отклик при 37 ° C, чем при 30 ° C.Различия могут быть связаны с различным влиянием температурного сдвига на аффинность связывания между факторами транскрипции и родственными им сайтами связывания ДНК этих промоторов, что позволяет предположить, что изменение абиотического контекста может иметь различное влияние на производительность различных частей организма. интегрированная система.

Таким образом, результаты характеризации (рис. 2) показывают, что три регулируемых промотора и шесть RBS ведут себя по-разному в различных абиотических (например, среда и температура) и генетических (например, контекст шасси и встроенной последовательности) контекстах.Полученные данные (рис. 2d – i) были подогнаны под модель функции Хилла для установившегося отклика ввода-вывода промотора (передаточная функция) в форме (Дополнительные методы):

, где [ I ] — концентрация индуктора; K ₁ и n ₁ — константа и коэффициент Хилла, соответственно, относящиеся к взаимодействию промотор-регулятор / индуктор; k — максимальный уровень экспрессии за счет индукции; и α является константой, относящейся к базальному уровню промотора из-за утечки (таблица 2).

Форвардное проектирование модульного логического элемента И

На основе результатов определения характеристик компонентов в различных контекстах, логический элемент И теперь систематически проектировался и строился путем выбора соответствующих частей (входных промоутеров и RBS) и их соответствующего контекста (шасси, медиа и контекст встроенной последовательности). На рис. 2d – f показано, что P _lac намного слабее по сравнению с промоторами P _BAD и P _lux .Чтобы сбалансировать два управляющих входа и избежать потенциальной избыточной экспрессии, вход пары P _lac / rbsH с максимальным уровнем около 2000 у.е. (Рис. 2d), использовался для привода hrpR и пары P _BAD / rbs33 с максимальным уровнем около 12000 у.е. (Рис. 2e), сначала использовали для управления hrpS в выбранном стандартном контексте ( E. coli, MC1061, M9-глицерин, 30 ° C). Эта спроектированная версия логического элемента И показала отклики, которые соответствуют функции логического логического элемента И после измерения с помощью флуорометрии (рис.3а). Выход включается только тогда, когда оба входа сильно индуцированы, и реакция очень резкая при переходе из выключенного состояния во включенное состояние и близка к желаемой реакции логического логического элемента AND. Затем двумерные данные использовались для параметризации модели нормализованной передаточной функции логического элемента И в виде:

Эта передаточная функция была получена на основе биохимического взаимодействия, лежащего в основе архитектуры схемы (дополнительные методы). Он описывает нормализованный выход логического элемента И как функцию уровней двух белков-активаторов ([ R ] для HrpR, [ S ] для HrpS) в устойчивом состоянии.[ G ] _max — максимальная активность, наблюдаемая для выхода. K _R , K _S и n _R , n _S — константы и коэффициенты Хилла для HrpR и HrpS, соответственно. Уровни двух активаторов были получены из параметризованных передаточных функций двух входных промоторов (таблица 2) с теми же RBS, которые использовались в логическом элементе AND. Подгонка данных с доверительной вероятностью 95% к уравнению (2) дает: K _R = 206.1 ± 32,5, K _S = 3135 ± 374, n _R = 2,381 ± 0,475 и n _S = 1,835 ± 0,286 с [ G ] _max = 7858 а.е. для этого анализа (рис. 3b; дополнительный рис. S6).

( a ) Гейт AND был сконструирован с промоторами P _lac и P _BAD в качестве двух входов для управления транскрипцией hrpR и hrpS .rbsH и rbs33 используются после P _lac и P _BAD соответственно. Флуоресцентный отклик этого устройства был измерен для 72 комбинаций входных индукций в стандартном контексте, как показано внизу. Используемые концентрации индукторов: 0, 3,9 × 10 ⁻⁴ , 1,6 × 10 ⁻³ , 6,3 × 10 ⁻³ , 2,5 × 10 ⁻² , 0,1, 0,4, 1,6 мМ IPTG (слева направо ) на 0, 3,3 × 10 ⁻⁴ , 1,3 × 10 ⁻³ , 5,2 × 10 ⁻³ , 2,1 × 10 ⁻² , 8.3 × 10 ⁻² , 0,33, 1,3, 5,3 мМ арабинозы (снизу вверх). ( b ) Корреляция между откликом, охарактеризованным вентилем И, и прогнозируемым откликом на основе подобранной передаточной функции сильная, с коэффициентом корреляции Пирсона 0,9911. Каждая точка представляет одну экспериментальную точку данных из двумерного массива в a , по сравнению с моделью, предсказанной G / G _max с использованием уравнения (2) и подобранной [ R ] и [ S ] ] значения из уравнения (1) для двух охарактеризованных входов промотора.( c ) Вверху находится вентиль И с новой конфигурацией, построенный с использованием P _люкс и P _BAD в качестве двух входов. In silico Моделирование предсказывает поведение устройства в двух разных контекстах (внизу слева), то есть в контексте 1 ( E. coli, MC1061, M9-глицерин, 30 ° C) и контексте 2 ( E. coli, MC1061, M9). -глицерин, 37 ° C). Экспериментально охарактеризованные отклики устройства в этих двух контекстах представлены в правом нижнем углу. Используемые концентрации индуктора равны 0, 2.4 × 10 ⁻² , 9,8 × 10 ⁻² , 3.9 × 10 ⁻¹ , 1,6, 6.3, 25, 100 нМ AHL на 0, 3,3 × 10 ⁻⁴ , 1,3 × 10 ⁻³ , 5,2 × 10 ⁻³ , 2,1 × 10 ⁻² , 8,3 × 10 ⁻² , 0,33, 1,3 мМ арабиноза. Для упрощения сравнения с экспериментальными данными модели построены с теми же концентрациями индуктора, которые использовались для характеристики. В a и c все характеристические данные представляют собой нормализованное среднее трех повторов в E.coli MC1061 в M9-глицерине с вариациями менее 10% между биологическими повторами.

Чтобы проверить модульность входа логического элемента И, а также правильность его передаточной функции, мы затем заменили вход P _lac на вход P _lux , реагирующий на AHL (рис. 3c). Поскольку P _lux был охарактеризован как сильный промотор (рис. 2f), вход пары P _lux / rbs33 (максимальный уровень около 2000 а.е.) использовался для управления логическим элементом AND, близко к входу P _lac / rbsH пара.Однако рисунок 2i показывает, что утечка для P _lux при 30 ° C больше, чем при 37 ° C. Такое изменение поведения входного сигнала P _люкс при этих двух температурах может привести к различным ответам собранного логического элемента И в этих двух условиях. Чтобы оценить это, мы смоделировали поведение устройства в двух контекстах, используя функции передачи компонентов, которые были параметризованы в соответствующем контексте. Прогнозы (рис. 3c) показывают, что этот вентиль AND будет вести себя по-разному в двух контекстах, и, в частности, утечка отклика появится на стороне P _люкс в контексте более низкой температуры.Чтобы подтвердить предсказания модели, собранный логический элемент И был экспериментально охарактеризован в двух контекстах, соответственно. На рисунке 3c показано, что результаты согласуются с прогнозами модели (дополнительный рисунок S6 показывает высокий коэффициент корреляции между ними) в том, что утечка на стороне P _lux действительно наблюдалась для логического элемента AND при 30 ° C. Затем были получены улучшенные характеристики логического элемента И того же устройства в контексте более высоких температур 37 ° C. Эти данные показывают, что контекст, в котором работает схема, оказывает значительное влияние на ее поведение, и поведение схемы может быть эффективно смоделировано на основе компонентов, которые были охарактеризованы в том же абиотическом и генетическом контексте, что и требовалось для их окончательной работы.Результат также показывает, что входы логического элемента И являются взаимозаменяемыми и модульными.

Комбинаторный вентиль И-НЕ

Для проверки модульности выхода логического элемента И, а также применяемого прямого инженерного подхода, мы затем соединили выход логического элемента И с модулем логического элемента НЕ, чтобы создать комбинаторный вентиль И-НЕ. Модульный гейт NOT был разработан на основе репрессорного модуля cI / P _lam , состоящего из лямбда-гена cI и его регуляторного промотора P _R (рис.4). Пять версий ворот НЕ с использованием различных RBS были сконструированы и охарактеризованы в выбранном стандартном контексте. На рисунке 4 показано, что четыре из пяти версий давали очень похожие отклики и демонстрировали требуемые характеристики логического логического элемента НЕ — с быстрым переходом между состояниями в узком диапазоне концентрации индуктора, большим динамическим диапазоном и низким уровнем выходного сигнала в выключенном состоянии. . Данные были подогнаны к передаточной функции ворот НЕ в виде:

, где [ R ₃ ] — концентрация репрессора, K ₃ и n ₃ — концентрация репрессора. Константа и коэффициент Хилла, k ₃ — это максимальный уровень экспрессии без репрессии, а α ₃ — константа, относящаяся к базальному уровню регулируемого промотора (дополнительная таблица S1).Уровни репрессора были получены из параметризованной передаточной функции (таблица 2) индуцируемого вводом промотора с тем же RBS, что и в вороте NOT.

( a ) Конструкция модульного гейта НЕ ( b ) Дозовые отклики сконструированного гейта НЕ cI / P _lam были измерены с использованием пяти версий RBS под индуцируемым IPTG промотором P _lac . Используемые концентрации индуктора — 0, 3.9 × 10 ⁻⁴ , 1,6 × 10 ⁻³ , 6,3 × 10 ⁻³ , 2,5 × 10 ⁻² , 0,1, 0,4, 1,6, 6,4 и 12,8 мМ IPTG. Данные представляют собой среднее значение трех повторов в E. coli, MC1061 в M9-глицерине при 30 ° C. Сплошные кривые — данные, соответствующие передаточной функции ворот НЕ. Планки погрешностей, s.d. ( n = 3).

Составной логический элемент И-НЕ (рис. 5a, b) систематически разрабатывался на основе охарактеризованных деталей и модулей затвора. Передаточная функция логического элемента И-НЕ была получена путем интеграции индивидуальных передаточных функций составляющих частей (индуцибельные промоторы) и модулей (логические элементы И и НЕ) в системе (дополнительные методы).Затем мы смоделировали функцию устройства, используя параметризованные передаточные функции компонентов, которые были охарактеризованы в соответствующем контексте. На рис. 5a, b показаны прогнозируемые характеристики двух версий логического элемента И-НЕ с различными входами и конфигурациями промоторов. В обоих случаях появляется желаемая логическая функция И-НЕ. На основе прогнозов модели два логических элемента NAND были сконструированы путем непосредственной сборки соответствующих частей и модулей и систематически тестировались в соответствующем контексте (рис.5в, г). Двумерные отклики ввода-вывода устройств соответствуют функции логического логического элемента И-НЕ. Выходы находятся в выключенном состоянии (точка I) только тогда, когда на обоих входах высокий уровень. Экспериментальные результаты близки к предсказаниям модели (дополнительный рис. S7), за исключением небольшой разницы в углу с низким IPTG и высокой индукцией арабинозы на двумерной карте (точка II, рис. 5c) и, аналогично , на рис. 5d, угол с индукцией низкой AHL и высокой арабинозы.Незначительное ингибирование в точке II может быть связано с небольшой утечкой экспрессии HrpR из его контрольных входных промоторов.

( a ) Первый вентиль И-НЕ включает в себя охарактеризованный модуль логического элемента И, использующий P _lac и P _BAD в качестве входов, а также модуль НЕ-затвора rbs34-cI / P _lam . In silico Моделирование предсказывает поведение устройства на основе параметризованных передаточных функций компонентных модулей в стандартном контексте.( b ) Второй логический элемент И-НЕ включает модуль логического элемента И, использующий в качестве входов P _lux и P _BAD , а также модуль НЕ-затвора rbs32-cI / P _lam NOT. In silico Моделирование предсказывает поведение устройства на основе параметризованных передаточных функций компонентов при 37 ° C в стандартном контексте. Для этого моделирования использовались подогнанные передаточные функции логического элемента И и НЕ в стандартном контексте, и предполагалось, что они незначительно изменяются при 37 ° C. ( c ) Ответ логического элемента И-НЕ как в и при 64 комбинациях входных индукций (0, 3.9 × 10 ⁻⁴ , 1,6 × 10 ⁻³ , 6.3 × 10 ⁻³ , 2,5 × 10 ⁻² , 0,1, 0,4, 1,6 мМ IPTG на 0, 3,3 × 10 ⁻⁴ , 1,3 · 10 ⁻³ , 5,2 · 10 ⁻³ , 2,1 · 10 ⁻² , 8,3 · 10 ⁻² , 0,33, 1,3 мМ арабиноза), измеренные флуорометрическим методом в стандартном контексте. ( d ) Ответ логического элемента И-НЕ как в b для 64 комбинаций входных индукций (0, 2,4 × 10 ⁻² , 9,8 × 10 ⁻² , 3,9 × 10 ⁻¹ , 1,6, 6.3, 25, 100 нМ AHL на 0, 3.3 × 10 ⁻⁴ , 1.3 × 10 ⁻³ , 5.2 × 10 ⁻³ , 2.1 × 10 ⁻² , 8.3 × 10 ⁻² , 0,33, 1,3 мМ арабинозы) при 37 ° C с помощью флуорометрического анализа. ( e ) FACS-анализ логического элемента NAND, как в a , при четырех логических комбинациях входных индукций: (I) 1,3 мМ арабинозы плюс 1,6 мМ IPTG, (II) 1,3 мМ арабинозы, (III) 1,6 мМ IPTG, ( IV) нет. ( f ) FACS-анализ логического элемента И-НЕ, как в b , при четырех входных индукциях: (I) 1.3 мМ арабинозы плюс 100 нМ AHL, (II) 1,3 мМ арабинозы, (III) 100 нМ AHL, (IV) нет. Данные в c и d представляют собой нормализованное среднее значение трех повторов в E. coli MC1061 в M9-глицерине с вариациями менее 10% между биологическими повторами.

Проточная цитометрия использовалась для подтверждения того, что вентиль NAND функционирует на индивидуальном клеточном уровне. На рис. 5e, f показано, что вся популяция выключается только тогда, когда оба входа сильно индуцированы (полоса I с низкой флуоресценцией, соответствующая точке I в анализе с помощью флуорометрии).Если какой-либо входной индуктор не добавлен, вся популяция включается (дорожки с высокой флуоресценцией II, III и IV). Высокая флуоресценция небольшой части клеток на дорожке I второго логического элемента И-НЕ (фиг. 5f) может быть связана с не полностью индуцированной популяцией клеток в используемых условиях индукции (1,3 мМ арабиноза плюс 100 нМ AHL). В частности, это может быть связано с неоднородным входным промотором P _BAD , который проявляет бимодальную активность в условиях субнасыщения арабинозы в E.coli MC1061 (ссылка 40) (дополнительный рисунок S8).

Совместимость и однородность шасси схемы

Чтобы изучить поведение логического элемента AND в шасси различных ячеек, то есть совместимость шасси схемы, мы проверили качественные отклики логического элемента AND в семи часто используемых штаммах клеток E. coli ( Рис.6). Во-первых, логический элемент И с P _lac и P _BAD в качестве управляющих входов был оценен при четырех условиях логического входа (рис. 6a).Устройство не работало должным образом в пяти из семи протестированных ячеек — E. coli, MC4100, MG1655, DH5α, BW25113 и BL21 (DE3). Устройство хорошо себя показало на штаммах E. coli, MC1061 и TOP10. Для большинства нерабочих шасси элементы имеют высокий выход не только с обоими входными индукциями, но и только с индукцией входа P _BAD . Эти аномальные ответы могут быть следствием интерференции между генетическим фоном хозяина и вводом промотора P _lac устройства.Чтобы подтвердить это, мы затем проверили отклики логического элемента И, используя P _lux и P _BAD в качестве двух входов при четырех условиях логического входа (рис. 6b). Теперь устройство хорошо себя ведет во всех шасси, за исключением штамма E. coli BL21 (DE3) с удаленным геном протеазы Lon. Функциональное улучшение логического элемента И среди этих шасси, таким образом, связано с устранением потенциальной интерференции входного промотора с генетическим фоном хозяина за счет использования P _lux вместо P _lac в качестве первого управляющего входа.Это ожидается, потому что P _lux не является эндогенным в E. coli и, вероятно, ортогонален генетическому фону этой бактерии, в то время как P _lac является эндогенным промотором E. coli и может взаимодействовать с фоном хозяина. Уровни отклика устройства на обе входные индукции различаются в семи протестированных шасси. Такое изменение, вероятно, связано с комбинированным эффектом потенциальной интерференции между промоторами входных цепей (P _lac и P _BAD ) и фоном хозяина, а также различным замедлением роста, наблюдаемым в эксперименте для семи хозяев (дополнительные таблицы S2 и S3).Комбинируя два анализа, можно сделать вывод, что сама схема логического элемента AND в целом совместима и надежно ведет себя на большинстве тестируемых шасси, но входы промоторов необходимо тщательно выбирать, чтобы избежать потенциального вмешательства в генетический фон хозяина.

 True
+ --------------- + ----------------
 | И Таблица Правды | Результат |
 A = ложь, B = ложь | А И В = Ложь |
 A = Неверно, B = Верно | А И В = Ложь |
 A = Верно, B = Неверно | А И В = Ложь |
 A = Верно, B = Верно | А И В = Истина | 

 True
+ --------------- + ----------------
 | Таблица истинности NAND | Результат |
 A = ложь, B = ложь | А И В = Истина |
 A = Неверно, B = Верно | А И В = Истина |
 A = Верно, B = Неверно | А И В = Истина |
 A = Верно, B = Верно | А И В = Ложь | 

 Ложь
+ --------------- + ---------------- +
 | ИЛИ Таблица истинности | Результат |
 A = ложь, B = ложь | A ИЛИ B = Ложь |
 A = Неверно, B = Верно | A ИЛИ B = Истина |
 A = Верно, B = Неверно | A ИЛИ B = Истина |
 A = Верно, B = Верно | A ИЛИ B = Истина | 

 0
+ --------------- + ---------------- +
 | Таблица истинности XOR | Результат |
 A = ложь, B = ложь | XOR B = 0 |
 A = Неверно, B = Верно | XOR B = 1 |
 A = Верно, B = Неверно | XOR B = 1 |
 A = Верно, B = Верно | A XOR B = 0 | 

 1
+ --------------- + ---------------- +
 | НЕ Таблица истинности | Результат |
 A = Ложь | НЕ = 1 |
 A = Верно, | НЕ = 0 | 

 1
+ --------------- + ---------------- +
 | Таблица истины NOR | Результат |
 A = ложь, B = ложь | A NOR B = 1 |
 A = Неверно, B = Верно | A NOR B = 0 |
 A = Верно, B = Неверно | A NOR B = 0 |
 A = Верно, B = Верно | A NOR B = 0 | 

 1
+ --------------- + ---------------- +
 | Таблица истинности XNOR | Результат |
 A = ложь, B = ложь | A XNOR B = 1 |
 A = Неверно, B = Верно | A XNOR B = 0 |
 A = Верно, B = Неверно | A XNOR B = 0 |
 A = Верно, B = Верно | A XNOR B = 1 | 

 A 

 Х 

 X '

 0 

 0 

 1 

 0 

 1 

 1 

 1 

 0 

 1 

 1 

 1 

 0 

  S  

 р 

 К 

 ~ К 

 0 

 0 

 К 

 ~ 

 0 

 1 

 0 

 1 

 1 

 0 

 1 

 0 

 1 

 1 

 0 

 0 

  x  

 y 

 Перенести 

 Сумма 

 0 

 0 

 0 

 0 

 0 

 1 

 0 

 1 

 1 

 0 

 0 

 1 

 1 

 1 

 1 

 0 

  x  

 y 

 в  I  

 Перенести 

 Сумма 

 0 

 0 

 0 

 0 

 0 

 0 

 0 

 1 

 0 

 1 

 0 

 1 

 0 

 0 

 1 

 0 

 1 

 1 

 1 

 0 

 1 

 0 

 0 

 0 

 1 

 1 

 0 

 1 

 1 

 0 

 1 

 1 

 0 

 1 

 0 

 1 

 1 

 1 

 1 

 1 

  25 (MULTIPLICAND или "Q")
x  13  (МНОЖИТЕЛЬ или "M")
= 25 + 25 + 25 + ... + 25 (13 раз)
= 325 (ПРОДУКТ или "P") 

  25
  х 13
  75 = 25 + 25 + 25
  25  = 250 (25 сдвинутых однозначных позиций)
 325 

  25
  х 13
  +75
   7: 5 сдвинуть частичное произведение вправо
 +  25
  32: 5 

   11001
  х  1101 
   11001 доп.
  00000 смена Q, без добавления
 11001 сдвиг Q, прибавить
  11001  смена Q, доп.
101000101 

 11001
  х  1101 
  +11001 добавить
  >> 11001 смена P
  +  00000  без добавления
    11001
  >> 11001 смена P
  +  11001  доб.
   1111101
  >> 1111101 смена
  +11001  доб.
  101000101 

00 -> 0
01 -> 1
10 -> -1
11 -> 0 

00 -> Shift
01 -> Добавить, затем Shift
10 -> Sub, затем Shift
11 -> Сдвиг 

000 -> Shift, Shift
001 -> Добавить, Shift, Shift
010 -> Добавить, Shift, Shift
011 -> Shift, Добавить, Shift
100 -> Shift, Sub, Shift
101 ->
110 ->
111 -> 

    021  R1
13) 274
      26
  14
      13
  1 

       000010101  R1
1101) 100010010
        1101
  10000
          1101
  1110
            1101
  1 

    R0 R1
0 0 0 1 | 0 1 0 0 начальный
0 0 1 0 | 1 0 0: сдвиг (1)
0 0 1 0 | 1 0 0: 0 суб / восстановление (1)
0 1 0 1 | 0 0: 0 сдвиг (2)
0 0 1 0 | 0 0: 0 1 часть / набор (2)
0 1 0 0 | 0: 0 1 смена (3)
0 0 0 1 | 0: 0 1 1 часть / набор (3)
0 0 1 0: 0 1 1 смена (4)
0 0 1 0: 0 1 1 0 суб / восстановить (4)
остаток: частное