Site Loader

Содержание

Заправка картриджа Canon iR 1435

ЗАПРАВКА КАРТРИДЖЕЙ
РЕМОНТ ОРГТЕХНИКИ

+7(495) 739 58 52

10:00 — 18:00

Заказать обратный звонок

Производитель: Модель: Форма поиска:

Марка: Canon

Цвет: черный

Ресурс: 17600 (500гр.)

Замена чипа: не требуется ? Чип — это счетчик копий в виде микросхемы, установленной в картридже. В вашем аппарате замена чипа не обязательна, так как чип не блокирует аппарат

После заправки он будет писать, что тонера нет, но аппарат при этом будет спокойно печатать дальше.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 …

2600р.

2340р.

2210р.

2080р.

В корзину

Марка: Canon

Цвет: черный

Ресурс: 35500

Замена чипа: для экономии ?
Чип
— это счетчик копий в виде микросхемы, установленной в картридже. Когда счетчик доходит до 0, чип блокирует картридж и не дает печатать.

Вместо покупки нового драм-картриджа Вы можете поменять в нем чип. Драм-картридж прослужит еще один срок.

1800р.

Драм-картридж не заправляется.

УСЛОВИЯ ЗАПРАВКИ

Если заказ сделан до 14:00, мы можем приехать в этот же день. Заправка осуществляется при Вас, картриджи мы обычно не забираем. Так удобнее как нам (не нужно ездить лишний раз), так и Вам (после заправки можно сразу проверить работу). Ну и, естественно, такая система работы быстрее — не придется долго ждать, пока аппарат снова заработает. Закончился картридж, вы его потрясли, позвонили нам и через максимум 4 часа у Вас уже все работает.

Оплата.

Мы принимаем оплату как наличными, так и по безналичному расчету. Предоплату вносить не нужно, мы доверяем своим клиентам. Просто звоните, мы приезжаем, делаем работу и уезжаем, оставив квитанцию. После наш оператор свяжется с Вами, возьмет реквизиты. Мы сделаем полный комплект документов и привезем его с курьером.

Страница не найдена — Радиодетали ПОЧТОЙ!

Поиск компонентов

Всего в наличии: 6145
наименований компонентов

Категории

    Антенны
    Батарейные отсеки, батарейки
    Блоки питания, трансформаторы
    Варикапы
    Варисторы
    Вентиляторы
    Газоразрядники
    Динамики малые
    Диодные мосты, столбы
    Диоды
    Диоды защитные
    Диоды СВЧ
    Дроссели, индуктивности
    Звуковые излучатели, микрофоны
    Индикаторы
    Инструмент
    Кабельная продукция
    Кварцы, резонаторы, фильтры
    Конденсаторы SMD0402
    Конденсаторы SMD0603
    Конденсаторы SMD0805
    Конденсаторы SMD1206
    Конденсаторы SMD1210
    Конденсаторы аудио К73-11
    Конденсаторы высоковольтные
    Конденсаторы ионисторы
    Конденсаторы керамические
    Конденсаторы пленочные
    Конденсаторы полистирольные
    Конденсаторы помехоподавляющие
    Конденсаторы пусковые
    Конденсаторы ЧИП-танталовые
    Конденсаторы электролит разные
    Конденсаторы электролитические
    Корпуса для РЭА
    Лампы
    Микросхемы импортные
    Микросхемы отечественные
    Наборы компонентов
    Оптопары (оптроны)
    Панельки для микросхем
    Переключатели, кнопки
    Предохранители, держатели
    Припои, флюсы
    Радиаторы охлаждения
    Разъемы высокочастотные
    Разъемы герметичные
    Разъемы соединительные авто
    Разъемы, клеммники
    Резисторы 0,25 (0,125) Вт
    Резисторы 0,5 Вт
    Резисторы 1 Вт
    Резисторы 2 Вт
    Резисторы 5-200 Вт
    Резисторы SMD0402
    Резисторы SMD0603
    Резисторы SMD0603 точные
    Резисторы SMD0805
    Резисторы SMD0805 точные
    Резисторы SMD1206
    Резисторы SMD1206 точные
    Резисторы SMD2010
    Резисторы SMD2512
    Резисторы переменные
    Реле твердотельные
    Реле, герконы
    Ручки приборные
    Светодиоды
    Стабилизаторы напряжения
    Стабилитроны
    Стеклотекстолит
    Стойки для плат
    Термопредохранители
    Терморезисторы (термисторы)
    Термостаты
    Тиристоры и симисторы
    Транзисторы импортные
    Транзисторы отечественные
    Установочные изделия
    Ферритовые изделия
    Фотодиоды
    Фотоприемники
    Фоторезисторы
    Щётки для электродвигателей
    Электродвигатели
404 ошибка
Такой страницы не существует…

Вверх

Наглядное пособие по устройству микросхемы / Хабр

Автора всегда восхищала работа микросхем. Как пластина, некоторые участки которой преднамеренно загрязнены, управляет электронами? И тут внезапно кто-то придумывает наглядное пособие, которое делает принцип действия микросхемы максимально понятным. Именно это произошло на ярмарке самодельщиков в области залива Сан-Франциско.

На стенде «Приоткрываем кремний» Windell Oskay, Lenore Edman, Eric Schlepfer, John McMaster и Ken Shirriff взяли 50-летнюю микросхему и вскрыли её корпус, чтобы любой проходящий мимо и заметивший необычный экспонат мог спросить, что это такое. Микросхема μL914 фирмы Fairchild содержит два элемента ИЛИ-НЕ, и она очень проста, а участки её структуры просто огромны. John McMaster давно занимается вскрытием микросхем и выкладывает результаты на свой сайт. В этот раз, помимо μL914, он вскрыл ещё и ATmega328, и на стенде микроконтроллер мигал светодиодами в таком виде. Посетители могли рассмотреть кристаллы обеих микросхем в микроскоп, но увидеть — это одно, а понять — другое. И вот что помогало им разобраться, на что же они смотрят:

Многослойная структура из нарезанного лазером оргстекла изображает электроды единичного транзистора. По условным цветовым обозначениям и геометрическим формам легко найти шесть транзисторов в полной модели микросхемы μL914. Теперь по проводникам можно понять, что с чем соединено.

Автору в устройстве этой микросхемы особенно понравились резисторы. Один из видов примесей превращает соответствующий участок кристалла в резистор, но что определяет его сопротивление? Оказывается, не концентрация примеси (она тоже влияет, но так регулировать сопротивление непрактично), а толщина и ширина. Поэтому резисторы в микросхеме отличаются друг от друга шириной, и снизу справа на модели показан очень широкий резистор. Наконец, ещё один экспонат на стенде представляет собой огромную действующую модель микросхемы на дискретных транзисторах, где все элементы расположены так же, как на оригинальной топологии. И всё работает, что доказывает правильность проведённого реверс-инжиниринга.

Разработчики наглядного пособия сняли о нём видео, которое не только интересно посмотреть. Оно вдохновляет на изготовление подобных пособий по устройству несложных микросхем.

От переводчика: некоторые аналоговые микросхемы, в первую очередь — УНЧ, до сих пор устроены несложно, фотографии их кристаллов в сети есть, а внутренние схемы известны по справочникам. Так что в первую очередь подобные наглядные пособия целесообразно изготавливать по ним.

МИКРОСХЕМА по ВАШЕМУ ЖЕЛАНИЮ | Дмитрий Компанец

Микросхема по заказу Очень Дешево!

Микросхема по заказу Очень Дешево!

Вы можете создать свою микросхему !? Это не вопрос Это Утверждение!
Да! Вы можете создавать свои собственные микросхемы не выходя из дома и по почте получать килограммы готовых чипов с заранее заданными по вашему желанию свойствами.

Сделать микросхему которая по мимо Микро ЭВМ управляющей её поведением содержит в себе еще и кучу Тиристоров, на кухне нельзя, А вот заказать можно ! Эта микросхема прямо перед вами

ЭВМ и 6 тиристоров в одном корпусе

ЭВМ и 6 тиристоров в одном корпусе

Даже не верится, что командный чип с питанием 5 вольт соседствует с ключами на 220 вольт при этом не внешними а внутренними.
Вы думаете , чтобы создать этот чип или описать его потребовалось много знаний и чертежей ? Вовсе нет, современные наработки позволяют в считанные минут описать желаемый результат на странице заказа и получить за небольшие деньги партию готовых микросхем, к примеру вот таких

Заказ на микроконтроллер для световых эффектов

Заказ на микроконтроллер для световых эффектов

ЗАКАЗНАЯ микросхема по вашему желанию !? Вот мы и дожились до времен когда Транзисторы, Резисторы и Микросхемы с готовыми компьютерами можно уже изготовить самому или заказать партию чипов с Желаемыми свойствами и поведением.

Нет надобности делать схемы и рассчитывать параметры с множеством неизвестных — это удел фанатов одиночек собирающих по старинке на «рассыпухе» подобия и пародии на современные устройства и гаджеты.

Как динозавры отмирают библиотеки хранившие описания всех радиоэлементов по их маркировке и номиналам. Теперь почти невозможно найти по буквенно численным обозначениям параметры и распиновку увиденной на плате детали и уж тем более почти не реально выяснить полную подноготную чипов создаваемых по заказам , ранее корпораций, затем производственных монополий, а теперь просто индивидуалов штампующих свои электронные самоделки на мини предприятиях.

Уже давно я столкнулся с тем, что выяснить что за чип в схеме попался мне практически невозможно. Только проводя сравнительный анализ и поиск попутных данных, я смог несколько раз расследовать и раскрыть «тайну» попавшего мне в руки элемента (не пятого).

Теперь когда электронный прогрес достиг высот частного компьютерного производства , каждый желающий может приобрести линию по производству чипов с заранее заложенными функциями — будь то мигалка, гуделка, приемник или передатчик или чип со светоэффектами для елочной гирлянды.

Диктофон и звуковой звонок уже давно объединились в одной микросхеме выполненной в виде капли или традиционной многоножки.

Да подключать и проверять такие микросхемы забавно и интересно, но , по сути своей , такое творчество походит на распаковывание коробочек с посылками из магазина — Не более!

Что касается Заказа Микросхем, то его сделать можно прямо на сайте производителя, в произвольной форме написав желаемые параметры и эффекты. Килограммы чипов изготовят для вас за небольшие , очень небольшие деньги и в дальнейшем вы сможете похвастать всем — Я СДЕЛАЛ СВОЮ СОБСТВЕННУЮ МИКРОСХЕМУ ! и это будет реальностью.

#СделатьСвоюМикросхему

УНИВЕРСАЛЬНАЯ МИКРОСХЕМА ДЛЯ ПОСТРОЙКИ РОБОТОВ | Дмитрий Компанец

Интегральная схема L293 и L293D

Интегральная схема L293 и L293D

Для управления двигателями робота необходимо устройство, которое бы преобразовывало управляющие сигналы малой мощности в токи, достаточные для управления моторами. Такое устройство называют драйвером двигателей.

Существует достаточно много самых различных схем для управления электродвигателями. Они различаются как мощностью, так и элементной базой, на основе которой они выполнены.
Микросхемы L293
L293B — не имеет встроенных защитных диодов, максимальный ток равен 1000 мА
L293D — имеет встроенные защитные диоды, но максимальный ток равен 600 мА
L293E — не имеет встроенных защитных диодов, но имеются отдельные выводы
SENSE L293DWP — устаревший тип в 28-ми выводном корпусе

Интегральная схема L293 и L293D – это сильноточный четырехканальный H-мостовой драйвер. L293 предназначена для обеспечения двунаправленных токов привода до 1 А при напряжениях от 4,5 В до 36 В. L293D предназначена для обеспечения двунаправленных токов привода до 600 мА при напряжениях от 4,5 В до 36 В.

Оба устройства предназначены для управления индуктивными нагрузками, такими как реле, соленоиды, двигатели постоянного тока и биполярные шаговые двигатели, а также других сильноточных/высоковольтных нагрузок с применением положительного питания. Каждый выход представляет собой полную бестрансформаторную схему двухтактного усилителя со стоком на транзисторе Дарлингтона и истоком на комплементарном транзисторе Дарлингтона.

Драйверы включаются парами, для входов драйверов 1 и 2 активируется вход 1,2EN, а для входов драйверов 3 и 4 активируется вход 3,4EN. L293D содержит сразу два драйвера для управления электродвигателями небольшой мощности (четыре независимых канала, объединенных в две пары). Имеет две пары входов для управляющих сигналов и две пары выходов для подключения электромоторов.

Кроме того, у L293D есть два входа для включения каждого из драйверов. Эти входы используются для управления скоростью вращения электромоторов с помощью широтно модулированного сигнала (ШИМ). L293D обеспечивает разделение электропитания для микросхемы и для управляемых ею двигателей, что позволяет подключить электродвигатели с большим напряжением питания, чем у микросхемы.

Разделение электропитания микросхем и электродвигателей может быть также необходимо для уменьшения помех, вызванных бросками напряжения, связанными с работой моторов.

Характеристики микросхемы L293D
*напряжение питания двигателей (Vs) — 4,5…36V
*напряжение питания микросхемы (Vss) — 5V
*допустимый ток нагрузки — 600mA (на каждый канал)
*пиковый (максимальный) ток на выходе — 1,2A (на каждый канал) *логический «0» входного напряжения — до 1,5V
*логическая «1» входного напряжения — 2,3…7V
*скорость переключений до 5 kHz.
*защита от перегрева

А вот такой робот следующий в направлении света, не требует ни микросхем ни транзисторов!

для Canon Ir 1435 тонер чип поставщиков, все качество для Canon Ir 1435 тонер чип поставщиков на Alibaba.com

Страна/регион: Китай Основные продукты:

Запчасти для копировальных аппаратов, Детали для принтеров, Продукты для прижигания, Метизы, Изделия из пластика

Общий доход:

1 миллион долларов США — 2 доллара США.5 миллионов

Топ-3 рынка:

Юго-Восточная Азия 15% , Южная Америка 10 % , Северная Америка 10 %

Страна/регион: Китай Основные продукты:

Тонер Чип , Картридж Чип , Барабан OPC, Детали принтера/копира, Тонер Детали картриджа

Общий доход:

10 миллионов долларов США — 50 миллионов долларов США

Топ-3 рынка:

Южная Америка 11% , Восточная Европа 11% , Океания 11%

Страна/регион: Китай Основные продукты:

Запчасти для копировальных аппаратов, Детали для принтеров, Продукты для прижигания, Метизы, Изделия из пластика

Общий доход:

1 миллион долларов США — 2 доллара США.5 миллионов

Топ-3 рынка:

Юго-Восточная Азия 15% , Южная Америка 10 % , Северная Америка 10 %

Страна/регион: Китай Основные продукты:

Тонер Чип , Картридж Чип , Барабан OPC, Детали принтера/копира, Тонер Детали картриджа

Общий доход:

10 миллионов долларов США — 50 миллионов долларов США

Топ-3 рынка:

Юго-Восточная Азия 11% , Южная Америка 11 % , Северная Америка 11%

41 Chip Ct, Kissimmee, FL 34759

Отличный уютный дом с доступом ко всем местным удобствам.В доме четыре спальни, две ванные комнаты и просторная семейная комната, в центре которой находится декоративный камин. Пол, полностью выложенный плиткой, упрощает уход за домом. Огороженный двор обеспечивает уединение и место, где ваш питомец может размять ноги. Крыша совершенно новая, законченная в январе 2022 года, и около трех лет назад был заменен весь водопровод дома. Расположенный в красивом районе Poinciana делает этот дом прекрасным местом для проживания. Популярный парк Вэнс Хармон и ультрасовременный бассейн с тренажерным залом находятся всего в нескольких минутах ходьбы.Живя здесь, вы будете иметь легкий доступ к магазинам, ресторанам и основным автомагистралям. Дом имеет хорошую ценность на этом очень горячем рынке и будет быстро продаваться. Позвоните нам сегодня, чтобы запланировать свой частный тур.

Особенности недвижимости

Спальни
Спальни
  • Спальни: 4
  • Спальня Спальня Размеры: 14 x 10
  • Спальня 2 Размеры: 10 x 10
  • Спальня 3 Размеры: 10 x 11
  • Спальня 4 Размеры: 10 x 12
  • Основная спальня, уровень: первый
  • Спальня 2, уровень: первый
  • Спальня 3, уровень: первый
  • Спальня 4, уровень: первый
Другие комнаты
  • Всего комнат: 7 9005 Balan/Laicon2
1
  • Балкон / крыльцо / Lanai Уровень: Первый
  • Семейный номер Размеры: 15 x 11
  • Семейный номер Уровень: Первый
  • Упражнение: Да
  • Упражнение: Да
  • Ванные комнаты
    • Всего Ванные комнаты: 2
    • Полная ванная комната: 2
    Элементы интерьера
    • Потолочные вентиляторы
    • Главная спальня на первом этаже
    • Спальня с раздельными стенами
    • Термостат
    • Сводчатый потолок
    • Меблированная Описание: Бесплатированные
    • настил: керамическая плитка
    30052
    диапазон
  • Range Hood
  • Range
  • Отопление и охлаждение
    • Отопление и охлаждение
      • Охлаждение Охлаждение: Central Air
      • Камин Особенности: декоративный, семейный номер
      • Отопление Особенности: Центральный, Электрический
      Кухня и столовая
      • Размеры столовой: 10 x 12
      • Уровень столовой: Первый
      Информация о земле
      • Размер участка Акров: 0.18
      • Лот размер квадратных футов: 7841
      Гараж и парковка
      Гараж и парковка
    • Размеры гаража: 1
    • Характеристики гаража: Гараж Размеры: 10×20
    • Парковка: Доходы, Отличная улица
    Экстерьер и Лот 40049
    • Дорожная ответственность: Дорога общего пользования
    • Тип дорожного покрытия: Асфальт
    Товарищество собственников жилья
    • Товарищество: Да
    • Инфраструктура товарищества: Баскетбольная площадка, Клуб, Фитнес-центр, Детская площадка, Теннисный корт(ы)
    • Членский взнос:
    • Плата за ассоциацию Периодичность: Ежемесячно
    • Плата за ассоциацию включает: Кабельное телевидение, Интернет
    • Рассчитанная общая ежемесячная плата за ассоциацию: 81
    • Название ассоциации: Association of Poinciana Villages
    • Домашние животные разрешены: Да см. документы ТСЖ об ограничениях на содержание домашних животных.
    • Разрешены кошки: Да
    • Разрешены собаки: Да
    Информация об аренде
    • Срок аренды: Минимальный срок аренды: 8-12 месяцев Пул
    Прочая информация об имуществе
    • Разное 2: «Как есть», в настоящее время сдано в аренду
    • Сумма годового налога: 2185,00
    • Статус исходного листинга: Ожидается
    • Округ: Саут-он-Плюмов на Сайпрессовер,

      2 Адреса:

      2 , направо на Country Club, налево на Chip Ct., дом справа.
    • Доверие!
    • Почтовый индекс плюс 4: 3306
    • подразделение: деревня Пункана 01 район 03 Юг
    • Управляющая: Опуд
    • Управляющая компания: OPUD
    • Управляющая компания: полный рабочий день
    • Недвижимость Подтип: Одноместный семейный резиденция
    • Имя источника системы: C2C
    Строительство и строительство
    • Общие квадратные ноги Living: 1435
    • год Построен: 1973
    • Область здания: 16352
    • Область здания: 1635
    • Строительные материалы: блок, штукатурка
    • Направление лица: East
    • Детали Фонда: SLAB
    • Подробнее Возраст: 49
    • Состояние объекта: Завершено
    • Крыша: Черепица
    • Архитектурный стиль: Традиционный
    Коммуникации
    • Канализация: Общественная канализация
    • BB/HS Доступ в Интернет
    • Кабель подключен
    • Электричество подключено
    • Канализация подключена
    • Источник воды: Общественный

    Узнайте больше об этом объекте.Контактный агент

    ЧИП ЙОРКГИТИС — Kelley Drye & Warren LLP

    Чип Йоркгитис является одним из основателей коммуникационной группы Келли Драй и сопредседателем Комитета фирмы по иностранным инвестициям в США (CFIUS).

    Chip представляет широкий круг поставщиков услуг, таких как передовые поставщики услуг связи, местные конкурентоспособные операторы связи, международные операторы связи и операторы подводного кабеля, во всех аспектах федерального законодательства и законов штата о связи.Он регулярно представляет этих клиентов в вопросах входа и лицензирования; разработка и интерпретация Федеральной комиссии по связи (FCC) и исполнительных нормативных актов штата; проверки национальной безопасности и правоохранительных органов перед Team Telecom и CFIUS; ведение переговоров, арбитраж и обеспечение соблюдения соглашений о присоединении и контрактов на обслуживание; соответствие нормативным требованиям; ведомственные расследования и правоприменение по таким разнообразным вопросам, как обязательства по взносам в универсальное обслуживание, отчетность о сбоях, плата за доступ, разрешение на использование оборудования; частные судебные решения; и нормативные вопросы, связанные со слияниями, поглощениями и другими сделками в сегодняшней быстро меняющейся среде.Он представляет ряд поставщиков и коммунальных услуг по вопросам, связанным с креплением к столбам, правами на использование кабелепроводов, местными франшизами и общественными правами проезда во многих муниципалитетах, округах и населенных пунктах по всей территории Соединенных Штатов.

    Чип также представляет интересы клиентов и проблемы, связанные с управлением использованием спектра. Он выступал в качестве советника пользователей спектра в различных отраслях по вопросам, связанным с распределением спектра, устранением помех, частной и NTIA координацией станций и совместным использованием спектра, Регламентом радиосвязи Международного союза электросвязи, управлением станциями, соблюдением эксплуатационных и технических регламентов, взаимосвязью. , лицензирование радиостанции FCC, иностранное владение, требования к маркировке и освещению конструкции антенны, а также оценки препятствий FAA.Он консультирует многочисленных производителей оборудования, импортеров и розничных продавцов по вопросам испытаний оборудования на радиочастотное излучение, авторизации оборудования (сертификация и поставщики, декларации соответствия), ограничений на воздействие радиочастотного излучения на человека и других вопросов электромагнитной совместимости, охватывающих как лицензированные, так и нелицензированные устройства. Он представлял спутниковых операторов и их клиентов в переговорах о транспондерах, пропускной способности и других коммерческих договоренностях, а также в соблюдении всех аспектов федерального регулирования.

    Представляет несколько международных перевозчиков и операторов подводного кабеля в вопросах постоянного соблюдения требований Федеральной комиссии по связи и обязательств по соглашениям о национальной безопасности или письмам-гарантиям в Комитете по оценке иностранного участия в секторе телекоммуникационных услуг США.

    Представляет глобального поставщика услуг с инфраструктурным бизнесом, охватывающим Северную и Южную Америку, Европу и Азию, в связи с его продажей новым инвесторам в заявках, поданных в FCC и рассмотренных Комитетом по оценке иностранного участия в США.S. Сектор телекоммуникационных услуг.

    Оказание помощи аляскинской компании в получении лицензии на прокладку подводного кабеля и проведении проверки национальной безопасности и правоохранительных органов для первой североамериканской кабельной системы к северу от Полярного круга, а также в заключении соответствующих соглашений о поставках, оптоволокне и других соглашениях.

    На протяжении более десяти лет работал в качестве глобального координирующего советника по регулированию для крупного американского подрядчика, которому было поручено внедрение всемирного наземного сегмента полярно-орбитальной метеорологической и экологической спутниковой системы следующего поколения, координируя вспомогательную работу дюжины фирм, расположенных по всему миру. .

    Представляет интересы нескольких клиентов из аэрокосмической отрасли в разбирательстве Федеральной комиссии связи США по совместному использованию спектра для летных испытаний в 1435–1525 МГц и 2360–2390 МГц, а также по возможному распределению спектра для летных испытаний в других диапазонах.

    Представлять представителей авиационной отрасли по вопросам доступа к спектру и совместимости в нескольких диапазонах спектра, включая, среди прочего, ОВЧ, L-диапазон и C-диапазон.

    Член делегации США на Всемирной конференции радиосвязи Международного союза электросвязи 2019 года в Шарм-эль-Шейхе, Египет, октябрь и ноябрь 2019 года (и активный участник собраний USWP5C, CITEL и WP5C в рамках подготовки к ВКР).

    Выступает в качестве федерального советника по регулированию в совете по управлению использованием спектра крупного подрядчика федерального правительства США.

    Представление интересов крупного конкурирующего оператора связи в судебном процессе о праве проезда с муниципальными властями в суде штата на юго-востоке США, который недавно был успешно разрешен после многолетнего судебного разбирательства.

    Представление интересов крупного конкурирующего оператора связи в федеральном суде на юго-востоке США по поводу тарифов на крепление опор и доступа к оптоволокну муниципальной коммунальной службы, которое завершилось после многолетнего судебного разбирательства.

    Представлял многочисленных конкурирующих операторов связи в переговорах, арбитраже и судебных делах в различных спорах о компенсациях между операторами как с операторами межсетевого обмена, так и с действующими операторами местной телефонной связи.

    В рейтинге Chambers USA как ведущий специалист в области телекоммуникаций, радиовещания и спутниковой связи, 2021 г.

    Рекомендован в US Legal 500 за его работу в области регулирования телекоммуникаций и вещания, 2017–2021 гг.

    Признан ведущим юристом в области коммуникационных услуг организацией Washington DC Super Lawyers , 2017-2021.

    S.1435 — 117-й Конгресс (2021–2022 гг.): Закон о доступных рецептах для пациентов от 2021 г. | Конгресс.гов

    Раздел протокола Конгресса Ежедневный дайджест Сенат жилой дом Расширения замечаний

    Замечания участников Автор Any House MemberАдамс, Алма С.[D-NC] Адерхольт, Роберт Б. [R-AL] Агилар, Пит [D-CA] Аллен, Рик В. [R-GA] Оллред, Колин З. [D-TX] Амодеи, Марк Э. [R -NV] Армстронг, Келли [R-ND] Аррингтон, Джоди С. [R-TX] Окинклосс, Джейк [D-MA] Эксн, Синтия [D-IA] Бабин, Брайан [R-TX] Бэкон, Дон [R -NE] Бэрд, Джеймс Р. [R-IN] Балдерсон, Трой [R-OH] Бэнкс, Джим [R-IN] Барр, Энди [R-KY] Барраган, Нанетт Диас [D-CA] Басс, Карен [ D-CA] Битти, Джойс [D-OH] Бенц, Клифф [R-OR] Бера, Ами [D-CA] Бергман, Джек [R-MI] Бейер, Дональд С.-младший [D-VA] Байс , Стефани И. [R-OK] Биггс, Энди [R-AZ] Билиракис, Гас М.[R-FL] Бишоп, Дэн [R-NC] Бишоп, Сэнфорд Д., младший [D-GA] Блюменауэр, Эрл [D-OR] Блант Рочестер, Лиза [D-DE] Боберт, Лорен [R-CO ] Бонамичи, Сюзанна [D-OR] Бост, Майк [R-IL] Бурдо, Кэролайн [D-GA] Боуман, Джамаал [D-NY] Бойл, Брендан Ф. [D-PA] Брэди, Кевин [R-TX ] Брукс, Мо [R-AL] Браун, Энтони Г. [D-MD] Браун, Шонтел М. [D-OH] Браунли, Джулия [D-CA] Бьюкенен, Верн [R-FL] Бак, Кен [R -CO] Бакшон, Ларри [R-IN] Бадд, Тед [R-NC] Берчетт, Тим [R-TN] Берджесс, Майкл С. [R-TX] Буш, Кори [D-MO] Бустос, Чери [D -ИЛ] Баттерфилд, Г.К. [D-NC] Калверт, Кен [R-CA] Каммак, Кэт [R-FL] Карбахал, Салуд О. [D-CA] Карденас, Тони [D-CA] Кэри, Майк [R-OH] Карл , Джерри Л. [R-AL] Карсон, Андре [D-IN] Картер, Эрл Л. «Бадди» [R-GA] Картер, Джон Р. [R-TX] Картер, Трой [D-LA] Картрайт, Мэтт [D-PA] Кейс, Эд [D-HI] Кастен, Шон [D-IL] Кастор, Кэти [D-FL] Кастро, Хоакин [D-TX] Коуторн, Мэдисон [R-NC] Шабо, Стив [ R-OH] Чейни, Лиз [R-WY] Черфилус-МакКормик, Шейла [D-FL] Чу, Джуди [D-CA] Чичиллин, Дэвид Н. [D-RI] Кларк, Кэтрин М. [D-MA] Кларк, Иветт Д.[D-NY] Кливер, Эмануэль [D-MO] Клайн, Бен [R-VA] Клауд, Майкл [R-TX] Клайберн, Джеймс Э. [D-SC] Клайд, Эндрю С. [R-GA] Коэн , Стив [D-TN] Коул, Том [R-OK] Комер, Джеймс [R-KY] Коннолли, Джеральд Э. [D-VA] Купер, Джим [D-TN] Корреа, Дж. Луис [D-CA ] Коста, Джим [D-CA] Кортни, Джо [D-CT] Крейг, Энджи [D-MN] Кроуфорд, Эрик А. «Рик» [R-AR] Креншоу, Дэн [R-TX] Крист, Чарли [ D-FL] Кроу, Джейсон [D-CO] Куэльяр, Генри [D-TX] Кертис, Джон Р. [R-UT] Дэвидс, Шарис [D-KS] Дэвидсон, Уоррен [R-OH] Дэвис, Дэнни К. [D-IL] Дэвис, Родни [R-IL] Дин, Мадлен [D-PA] ДеФацио, Питер А.[D-OR] ДеГетт, Диана [D-CO] ДеЛауро, Роза Л. [D-CT] ДельБене, Сьюзан К. [D-WA] Дельгадо, Антонио [D-NY] Демингс, Вэл Батлер [D-FL] ДеСолнье, Марк [D-CA] ДеЖарле, Скотт [R-TN] Дойч, Теодор Э. [D-FL] Диас-Баларт, Марио [R-FL] Дингелл, Дебби [D-MI] Доггетт, Ллойд [D- TX] Дональдс, Байрон [R-FL] Дойл, Майкл Ф. [D-PA] Дункан, Джефф [R-SC] Данн, Нил П. [R-FL] Эллзи, Джейк [R-TX] Эммер, Том [ R-MN] Эскобар, Вероника [D-TX] Эшу, Анна Г. [D-CA] Эспайлат, Адриано [D-NY] Эстес, Рон [R-KS] Эванс, Дуайт [D-PA] Фэллон, Пэт [ R-TX] Финстра, Рэнди [R-IA] Фергюсон, А.Дрю, IV [R-GA] Фишбах, Мишель [R-MN] Фицджеральд, Скотт [R-WI] Фицпатрик, Брайан К. [R-PA] Флейшманн, Чарльз Дж. «Чак» [R-TN] Флетчер, Лиззи [D-TX] Фортенберри, Джефф [R-NE] Фостер, Билл [D-IL] Фокс, Вирджиния [R-NC] Франкель, Лоис [D-FL] Франклин, К. Скотт [R-FL] Фадж, Марсия Л. [D-OH] Фулчер, Расс [R-ID] Гаетц, Мэтт [R-FL] Галлахер, Майк [R-WI] Галлего, Рубен [D-AZ] Гараменди, Джон [D-CA] Гарбарино, Эндрю Р. [R-NY] Гарсия, Хесус Г. «Чуй» [D-IL] Гарсия, Майк [R-CA] Гарсия, Сильвия Р. [D-TX] Гиббс, Боб [R-OH] Хименес, Карлос А. .[R-FL] Гомерт, Луи [R-TX] Голден, Джаред Ф. [D-ME] Гомес, Джимми [D-CA] Гонсалес, Тони [R-TX] Гонсалес, Энтони [R-OH] Гонсалес, Висенте [D-TX] Гонсалес-Колон, Дженниффер [R-PR] Гуд, Боб [R-VA] Гуден, Лэнс [R-TX] Госар, Пол А. [R-AZ] Готхаймер, Джош [D-NJ] Грейнджер , Кей [R-TX] Грейвс, Гаррет [R-LA] Грейвс, Сэм [R-MO] Грин, Эл [D-TX] Грин, Марк Э. [R-TN] Грин, Марджори Тейлор [R-GA] Гриффит, Х. Морган [R-VA] Грихальва, Рауль М. [D-AZ] Гротман, Гленн [R-WI] Гест, Майкл [R-MS] Гатри, Бретт [R-KY] Хааланд, Дебра А.[D-NM] Хагедорн, Джим [R-MN] Хардер, Джош [D-CA] Харрис, Энди [R-MD] Харшбаргер, Диана [R-TN] Харцлер, Вики [R-MO] Гастингс, Элси Л. [D-FL] Хейс, Джахана [D-CT] Херн, Кевин [R-OK] Херрелл, Иветт [R-NM] Эррера Бейтлер, Хайме [R-WA] Хайс, Джоди Б. [R-GA] Хиггинс, Брайан [D-NY] Хиггинс, Клэй [R-LA] Хилл, Дж. Френч [R-AR] Хаймс, Джеймс А. [D-CT] Хинсон, Эшли [R-IA] Холлингсворт, Трей [R-IN] Хорсфорд, Стивен [D-NV] Хулахан, Крисси [D-PA] Хойер, Стени Х. [D-MD] Хадсон, Ричард [R-NC] Хаффман, Джаред [D-CA] Хьюзенга, Билл [R-MI] Исса, Даррелл Э.[R-CA] Джексон Ли, Шейла [D-TX] Джексон, Ронни [R-TX] Джейкобс, Крис [R-NY] Джейкобс, Сара [D-CA] Джаяпал, Прамила [D-WA] Джеффрис, Хаким С. [D-NY] Джонсон, Билл [R-OH] Джонсон, Дасти [R-SD] Джонсон, Эдди Бернис [D-TX] Джонсон, Генри С. «Хэнк» младший [D-GA] Джонсон, Майк [R-LA] Джонс, Мондер [D-NY] Джордан, Джим [R-OH] Джойс, Дэвид П. [R-OH] Джойс, Джон [R-PA] Кахеле, Кайалии [D-HI] Каптур , Марси [D-OH] Катко, Джон [R-NY] Китинг, Уильям Р. [D-MA] Келлер, Фред [R-PA] Келли, Майк [R-PA] Келли, Робин Л. [D-IL ] Келли, Трент [R-MS] Ханна, Ро [D-CA] Килди, Дэниел Т.[D-MI]Килмер, Дерек [D-WA]Ким, Энди [D-NJ]Ким, Янг [R-CA]Кинд, Рон [D-WI]Кинзингер, Адам [R-IL]Киркпатрик, Энн [D -AZ] Кришнамурти, Раджа [D-IL] Кастер, Энн М. [D-NH] Кустофф, Дэвид [R-TN] ЛаХуд, Дарин [R-IL] ЛаМальфа, Дуг [R-CA] Лэмб, Конор [D -PA] Ламборн, Дуг [R-CO] Ланжевен, Джеймс Р. [D-RI] Ларсен, Рик [D-WA] Ларсон, Джон Б. [D-CT] Латта, Роберт Э. [R-OH] ЛаТернер , Джейк [R-KS] Лоуренс, Бренда Л. [D-MI] Лоусон, Эл, младший [D-FL] Ли, Барбара [D-CA] Ли, Сьюзи [D-NV] Леже Фернандес, Тереза ​​[D -NM] Леско, Дебби [R-AZ] Летлоу, Джулия [R-LA] Левин, Энди [D-MI] Левин, Майк [D-CA] Лью, Тед [D-CA] Лофгрен, Зои [D-CA] ] Лонг, Билли [R-MO] Лоудермилк, Барри [R-GA] Ловенталь, Алан С.[D-CA] Лукас, Фрэнк Д. [R-OK] Люткемейер, Блейн [R-MO] Лурия, Элейн Г. [D-VA] Линч, Стивен Ф. [D-MA] Мейс, Нэнси [R-SC ] Малиновски, Том [D-NJ] Маллиотакис, Николь [R-NY] Мэлони, Кэролин Б. [D-NY] Мэлони, Шон Патрик [D-NY] Манн, Трейси [R-KS] Мэннинг, Кэти Э. [ D-NC] Мэсси, Томас [R-KY] Маст, Брайан Дж. [R-FL] Мацуи, Дорис О. [D-CA] МакБат, Люси [D-GA] Маккарти, Кевин [R-CA] Маккол, Майкл Т. [R-TX] Макклейн, Лиза К. [R-MI] МакКлинток, Том [R-CA] МакКоллум, Бетти [D-MN] МакИчин, А. Дональд [D-VA] Макговерн, Джеймс П.[D-MA] МакГенри, Патрик Т. [R-NC] МакКинли, Дэвид Б. [R-WV] МакМоррис Роджерс, Кэти [R-WA] МакНерни, Джерри [D-CA] Микс, Грегори В. [D- Нью-Йорк] Мейер, Питер [R-MI] Менг, Грейс [D-NY] Мейзер, Дэниел [R-PA] Мфуме, Квейси [D-MD] Миллер, Кэрол Д. [R-WV] Миллер, Мэри Э. [ R-IL] Миллер-Микс, Марианнетт [R-IA] Муленаар, Джон Р. [R-MI] Муни, Александр X. [R-WV] Мур, Барри [R-AL] Мур, Блейк Д. [R- UT] Мур, Гвен [D-WI] Морелл, Джозеф Д. [D-NY] Моултон, Сет [D-MA] Мрван, Фрэнк Дж. [D-IN] Маллин, Маркуэйн [R-OK] Мерфи, Грегори [ R-NC] Мерфи, Стефани Н.[D-FL] Надлер, Джеррольд [D-NY] Наполитано, Грейс Ф. [D-CA] Нил, Ричард Э. [D-MA] Негус, Джо [D-CO] Нельс, Трой Э. [R-TX ] Ньюхаус, Дэн [R-WA] Ньюман, Мари [D-IL] Норкросс, Дональд [D-NJ] Норман, Ральф [R-SC] Нортон, Элеонора Холмс [D-DC] Нуньес, Девин [R-CA] О’Халлеран, Том [D-AZ] Обернольте, Джей [R-CA] Окасио-Кортес, Александрия [D-NY] Омар, Ильхан [D-MN] Оуэнс, Берджесс [R-UT] Палаццо, Стивен М. [ R-MS] Паллоне, Фрэнк-младший [D-NJ] Палмер, Гэри Дж. [R-AL] Панетта, Джимми [D-CA] Паппас, Крис [D-NH] Паскрелл, Билл-младший [D- Нью-Джерси] Пейн, Дональд М., младший [D-NJ] Пелоси, Нэнси [D-CA] Пенс, Грег [R-IN] Перлмуттер, Эд [D-CO] Перри, Скотт [R-PA] Питерс, Скотт Х. [D-CA] Пфлюгер, Август [R-TX] Филлипс, Дин [D-MN] Пингри, Челли [D-ME] Пласкетт, Стейси Э. [D-VI] Покан, Марк [D-WI] Портер, Кэти [D-CA] Поузи, Билл [R-FL] Прессли, Аянна [D-MA] Прайс, Дэвид Э. [D-NC] Куигли, Майк [D-IL] Радеваген, Аумуа Амата Коулман [R-AS] Раскин, Джейми [D- MD] Рид, Том [R-NY] Решенталер, Гай [R-PA] Райс, Кэтлин М. [D-NY] Райс, Том [R-SC] Ричмонд, Седрик Л. [D-LA] Роджерс, Гарольд [ R-KY] Роджерс, Майк Д.[R-AL] Роуз, Джон В. [R-TN] Розендейл-старший, Мэтью М. [R-MT] Росс, Дебора К. [D-NC] Роузер, Дэвид [R-NC] Рой, Чип [R -TX] Ройбал-Аллард, Люсиль [D-CA]Руис, Рауль [D-CA]Рупперсбергер, CA Датч [D-MD]Раш, Бобби Л. [D-IL]Резерфорд, Джон Х. [R-FL] Райан, Тим [D-OH] Саблан, Грегорио Килили Камачо [D-MP] Салазар, Мария Эльвира [R-FL] Сан-Николас, Майкл FQ [D-GU] Санчес, Линда Т. [D-CA] Сарбейнс, Джон П. [D-MD] Скализ, Стив [R-LA] Скэнлон, Мэри Гей [D-PA] Шаковски, Дженис Д. [D-IL] Шифф, Адам Б. [D-CA] Шнайдер, Брэдли Скотт [D -IL] Шредер, Курт [D-OR] Шриер, Ким [D-WA] Швайкерт, Дэвид [R-AZ] Скотт, Остин [R-GA] Скотт, Дэвид [D-GA] Скотт, Роберт С.«Бобби» [D-VA] Сешнс, Пит [R-TX] Сьюэлл, Терри А. [D-AL] Шерман, Брэд [D-CA] Шеррилл, Мики [D-NJ] Симпсон, Майкл К. [R- ID] Сиры, Альбио [D-NJ] Слоткин, Элисса [D-MI] Смит, Адам [D-WA] Смит, Адриан [R-NE] Смит, Кристофер Х. [R-NJ] Смит, Джейсон [R- MO] Смакер, Ллойд [R-PA] Сото, Даррен [D-FL] Спанбергер, Эбигейл Дэвис [D-VA] Спартц, Виктория [R-IN] Спейер, Джеки [D-CA] Стэнсбери, Мелани Энн [D- NM] Стэнтон, Грег [D-AZ] Штаубер, Пит [R-MN] Стил, Мишель [R-CA] Стефаник, Элиз М. [R-NY] Стайл, Брайан [R-WI] Штойбе, В.Грегори [R-FL] Стивенс, Хейли М. [D-MI] Стюарт, Крис [R-UT] Стиверс, Стив [R-OH] Стрикленд, Мэрилин [D-WA] Суоцци, Томас Р. [D-NY] Суолвелл, Эрик [D-CA] Такано, Марк [D-CA] Тейлор, Ван [R-TX] Тенни, Клаудия [R-NY] Томпсон, Бенни Г. [D-MS] Томпсон, Гленн [R-PA] Томпсон, Майк [D-CA] Тиффани, Томас П. [R-WI] Тиммонс, Уильям Р. IV [R-SC] Титус, Дина [D-NV] Тлайб, Рашида [D-MI] Тонко, Пол [D -NY] Торрес, Норма Дж. [D-CA] Торрес, Ричи [D-NY] Трэхан, Лори [D-MA] Троун, Дэвид Дж. [D-MD] Тернер, Майкл Р. [R-OH] Андервуд , Лорен [D-IL] Аптон, Фред [R-MI] Валадао, Дэвид Г.[R-CA] Ван Дрю, Джефферсон [R-NJ] Ван Дайн, Бет [R-TX] Варгас, Хуан [D-CA] Визи, Марк А. [D-TX] Вела, Филемон [D-TX] Веласкес , Нидия М. [D-NY] Вагнер, Энн [R-MO] Уолберг, Тим [R-MI] Валорски, Джеки [R-IN] Вальц, Майкл [R-FL] Вассерман Шульц, Дебби [D-FL] Уотерс, Максин [D-CA] Уотсон Коулман, Бонни [D-NJ] Вебер, Рэнди К. старший [R-TX] Вебстер, Дэниел [R-FL] Уэлч, Питер [D-VT] Венструп, Брэд Р. [R-OH] Вестерман, Брюс [R-AR] Векстон, Дженнифер [D-VA] Уайлд, Сьюзен [D-PA] Уильямс, Никема [D-GA] Уильямс, Роджер [R-TX] Уилсон, Фредерика С. .[D-FL] Уилсон, Джо [R-SC] Виттман, Роберт Дж. [R-VA] Вомак, Стив [R-AR] Райт, Рон [R-TX] Ярмут, Джон А. [D-KY] Янг , Дон [R-AK] Зелдин, Ли М. [R-NY] Любой член Сената Болдуин, Тэмми [D-WI] Баррассо, Джон [R-WY] Беннет, Майкл Ф. [D-CO] Блэкберн, Марша [ R-TN] Блюменталь, Ричард [D-CT] Блант, Рой [R-MO] Букер, Кори А. [D-NJ] Бузман, Джон [R-AR] Браун, Майк [R-IN] Браун, Шеррод [ D-OH] Берр, Ричард [R-NC] Кантвелл, Мария [D-WA] Капито, Шелли Мур [R-WV] Кардин, Бенджамин Л. [D-MD] Карпер, Томас Р. [D-DE] Кейси , Роберт П., младший [D-PA] Кэссиди, Билл [R-LA] Коллинз, Сьюзен М. [R-ME] Кунс, Кристофер А. [D-DE] Корнин, Джон [R-TX] Кортес Масто, Кэтрин [D -NV] Коттон, Том [R-AR] Крамер, Кевин [R-ND] Крапо, Майк [R-ID] Круз, Тед [R-TX] Дейнс, Стив [R-MT] Дакворт, Тэмми [D-IL ] Дурбин, Ричард Дж. [D-IL] Эрнст, Джони [R-IA] Файнштейн, Дайэнн [D-CA] Фишер, Деб [R-NE] Гиллибранд, Кирстен Э. [D-NY] Грэм, Линдси [R -SC] Грассли, Чак [R-IA] Хагерти, Билл [R-TN] Харрис, Камала Д. [D-CA] Хассан, Маргарет Вуд [D-NH] Хоули, Джош [R-MO] Генрих, Мартин [ D-NM] Хикенлупер, Джон У.[D-CO] Хироно, Мэйзи К. [D-HI] Хувен, Джон [R-ND] Хайд-Смит, Синди [R-MS] Инхоф, Джеймс М. [R-OK] Джонсон, Рон [R-WI ] Кейн, Тим [D-VA] Келли, Марк [D-AZ] Кеннеди, Джон [R-LA] Кинг, Ангус С.-младший [I-ME] Клобучар, Эми [D-MN] Лэнкфорд, Джеймс [ R-OK] Лихи, Патрик Дж. [D-VT] Ли, Майк [R-UT] Леффлер, Келли [R-GA] Лухан, Бен Рэй [D-NM] Ламмис, Синтия М. [R-WY] Манчин , Джо, III [D-WV] Марки, Эдвард Дж. [D-MA] Маршалл, Роджер [R-KS] МакКоннелл, Митч [R-KY] Менендес, Роберт [D-NJ] Меркли, Джефф [D-OR ] Моран, Джерри [R-KS] Мурковски, Лиза [R-AK] Мерфи, Кристофер [D-CT] Мюррей, Пэтти [D-WA] Оссофф, Джон [D-GA] Падилья, Алекс [D-CA] Пол , Рэнд [R-KY] Питерс, Гэри С.[D-MI] Портман, Роб [R-OH] Рид, Джек [D-RI] Риш, Джеймс Э. [R-ID] Ромни, Митт [R-UT] Розен, Джеки [D-NV] Раундс, Майк [R-SD] Рубио, Марко [R-FL] Сандерс, Бернард [I-VT] Сассе, Бен [R-NE] Шац, Брайан [D-HI] Шумер, Чарльз Э. [D-NY] Скотт, Рик [R-FL] Скотт, Тим [R-SC] Шахин, Жанна [D-NH] Шелби, Ричард С. [R-AL] Синема, Кирстен [D-AZ] Смит, Тина [D-MN] Стабеноу, Дебби [D-MI] Салливан, Дэн [R-AK] Тестер, Джон [D-MT] Тьюн, Джон [R-SD] Тиллис, Томас [R-NC] Туми, Патрик [R-PA] Тубервиль, Томми [R -AL] Ван Холлен, Крис [D-MD] Уорнер, Марк Р.[D-VA] Уорнок, Рафаэль Г. [D-GA] Уоррен, Элизабет [D-MA] Уайтхаус, Шелдон [D-RI] Уикер, Роджер Ф. [R-MS] Уайден, Рон [D-OR] Янг , Тодд [R-IN]

    Чип zliczający Canon IR 1435 [Canon IR 1435] Номер оригинала: C-EXV50 / 9436B002 Цвет: черный Выходной / Цена: 17.600 копий

    Ogólne opisy — kartridże Laserowe i znajdujące się w nich komponenty.

    Нижнеечне вшисткие понизить элементы muszą występować w każdym kartridżu laserowym (понижей ужите nazwy drukarek są przypadkowe).

    Тонер (прощек) — дробный прощек stosowany w drukarkach laserowych i kserocopiarkach np. Canon IR 1435 делает двустороннюю печать на бумаге. Тонер с другим лазерным принтером IR1435 umieszczony со специальной пастой, предназначенной для карточек с помощью ładunków elektrycznych, a następnie utrwalany na papierze pod wpływem wysokiej Temperaturey. Toner w proszku musi być dostosowany do wymagań danego productenta drukarki, w tym przypadku imageRUNNER 1435. Nie bez znaczenia jest węc jego jakość i pełna compatybilność с загруженным лазерным изображением RUNNER1435.Substancja ta musi spełniać wiele różnorodnych wymagań, z których najistotniejsze jest dostosowanie do założeń danego productenta drukarki image RUNNER 1435.

    Bęben OPC — центральным элементом лазерного картриджа Canon IR 1435. На wydrukowanie jednej strony w IR1435 potrzeba często wielu obrotów bębna. Друкарка imageRUNNER 1435 по otrzymaniu polecenia drukowania, tworzy na początku w swej pamięci obraz strony przeznaczonej do wydruku. Стеровник urządzenia imageRUNNER1435 odkłada na obracający się wałek światłoczuly (lub inaczej bęben fotostatyczny), błyskami promienia laserowego kolejność impulsów logicznych (subobnie jak w drukarkach igłowyc) tworzęąz miejsc aktywnych i nieaktywnych elektrostatycznie na tym bębnie.Его активная компания приобрела дробины для чистки и удаления тонера image RUNNER 1435 przenoszone są na uprzednio naładowaną elektrostatycznie kartkę papieru. Ниодзвоним элементам bębna OPC Canon IR 1435 с змеевиками, который выдвигается в форме простых угловых (винтовых/вертикальных). Uszkodzenia bębna są zazwyczaj mechanicznej natury i powstają na skutek zużycia w wyniku kontaktu z innymi elementami, a zwłaszcza z listwą czyszczącą (Щетка стеклоочистителя) ИР1435.

    Чип zliczający — wielu obecnie modelach kartridży są instalowane chipy zliczające, bez których drukarka np.imageRUNNER 1435 nie będzie współpracować z kartridżem. Сам чип для хранения электронных ключей wykonaną ilość kopii (wydruków) w drukarce imageRUNNER1435. Do Niektórych Modeli Drukarek Dostępne Są z Kolei Chipy AutoResetujące, Więc Wirokrotnego Użytku W Kartridżu Image Runner 1435. Дземки Темулия Możliwe Jest Zasypanie Kasety Canon IR 1435 Większą ilością pszzku bez konieczności częstej jej regeneracji. Вт zależności od modelu drukarki (np. IR1435) resetowanie chipu autoresetującego następuje po wykonaniu określonej czynności.

    Trzy Niby Proste, jednak Skomplikowane Компоненнти, О.Д. Кторич Zależy dzialanie Całej Kasety ImageRunner 1435. Nie Zapominajmy, że W Całym Kartridżu Imagerunner1435 Tych Częsci jest Mnóstwo, Każda Z Nich Stanowi Integralny Składnik Całości. Tylko pełne ich poznanie становой рецепт на уданную регенерацию image RUNNER 1435.

    проявитель прошивка — с копировальным аппаратом Canon IR 1435 был умищзоне нестандартные питательные средства на тонер и проявитель.W drukarkach laserowych проявитель znalazł zastosowanie jako dodatek «uszlachetniający» zwykły toner IR1435, gdzie obie substancje są zazwyczaj ze sobą zmieszane.

    Listwa czyszcząca (Щетка стеклоочистителя) — Jest to listwa zbierająca z wałka światłoczułego imageRUNNER 1435 drobinek pozostałego proszku zwanego tonerem. Bęben światłoczuły obracając się w kasecie imageRUNNER1435 wchodzi wchodzi w kontakt z listwą czyszczącą, która usuwa z powierzchni bębna pozostałe na nim jeszcze resztki tonera.Resztki te gromadzone są w «śmietniku» (Мусорное ведро) image RUNNER 1435, a zgromadzony tam proszek nie nadaje się do powtórnego użycia, gdyż utracił swoje właściwości elektrostatyczne. Chcąc dbać или dobrą jakość wydruku w Canon IR 1435 zaleca się, aby zbierak był wymieniany razem z beębnem OPC.

    Listwa podająca (Доктор Блейд) — Listwa podająca Doctor Blade odpowiada za równomierne rozprowadzenie tonera IR1435 po powierzchni wałka magnetycznego. Развертывание со значным стопниу для процесса загрузки wydruku imageRUNNER 1435.Валек магнитный (Mag Roller) przejmuje toner ze zbiornika w kasecie imageRUNNER1435 oraz nadaje mu odpowiedni ładunek elektrostatyczny, dzięki czemu przylega on do odpowiednich miejsc na bębnie światłoczulym. Na styku pomiędzy zbiornikiem тонера image RUNNER 1435, с магнитным покрытием znajduje się listwa podająca (Doctor Blade) zakończona często wymienną końcówką – Chargelink, od której zależy ilość toner podawanego na wałek magnetyczny oraz jego równomierne rozprowadzanie.

    Listwa zbierająca (Восстановление лезвия) — Jest to listwa uszczelniająca komorę śmietnika Canon IR 1435 przed wydostawaniem się drobinek toner, usuniętych z bebna OPC przez listwę Wiper Blade, a pozostałego na kudrowaniu po wy. Лезвие для восстановления Jest listwą zabezpieczającą w postaci cienkiego paska przyklejonego do części kasety zwanej komorą resztkową, śmietnikiem (Мусорное ведро) kasety IR1435. Jest to bardzo ważny element często pomijany podczas regeneracji, mający wpływa na jakość druku na kasetach imageRUNNER 1435.

    Zgarniak filcowy (Жезл) — обычная взрослая zanieczyszczenia osadzające się na wałku grzewczym (potocznie zwanym grzałką) imageRUNNER1435. Zanieczyszczenia te pochodzą od tonera (proszku) i powstają na skutek procesu drukowania w image RUNNER 1435. Nie jest standardem wyposażenia każdej drukarki laserowej.

    Elektroda ladująca PCR — ładuje elektrostatycznie powierzchnie bębna światłoczułego (Ролик первичного заряда) с Canon IR 1435.

    Валек магнитный (Mag Roller) — przejmuje toner ze zbiornika, oraz nadaje mu odpowiedni ladunek elektrostatyczny, dzięki czemu przylega on do odpowiednich (odwrotnie naładowanocych przez laser) miejsc zu 1świbnie zu 14yłm na bębnie

    Wałek dociskowy (прижимной ролик) — wspólnie z wałkiem grzewczym, zwanym również potocznie grzałką, bierze udział w utrwaleniu (zafixowaniu) тонер на бумажной подкладке с imageRUNNER 1435.Następuje to poprzez obróbkę termiczną i dzieje się to zazwyczaj w drodze przejścia kartki podczas drukowania w imageRUNNER1435 pomiędzy wałkiem grzewczym a wałkiem dociskowym.

    Wałek grzewczy (Fuser Roller) — с другой обработкой (копирование) с изображением RUNNER 1435конечное удаление тонера на бумаге. Następuje to poprzez obróbkę termiczną, zazwyczaj w drodze przejścia kartki pomiędzy wałkiem grzewczym, a wałkiem dociskowym w Canon IR 1435.Z wałkiem grzewczym w IR1435 należy obchodzić się bardzo ostrożnie, gdyż jego powierzchnia ulega uszkodzeniom mechanicznym (w przypadku zacięcia się kartki niekiedy jest ona usuwana za pomocnieproczy ostrych narzędędzi Ушкодзения).

    Валек олеева с копией — Валек олеева шутка с изображением RUNNER 1435 przy zespole utrwalania тонера (конкретные przy wałku grzewczym). Powoduje zbieranie resztek tonera, które osadzają się na powierzchni wałka grzewczego w imageRUNNER1435.Валек olejowy powinien być wymieniany co określoną ilosć wykonanych kopii w image RUNNER 1435 (najczęściej operację wymiany przeprowadzamy przy serwisowaniu kopiarki).

    Mag Connection (magnetyczny styk) — styk, который имеет значение с kasecie Canon IR 1435 с wałkiem magnetycznym и powoduje его dokładne ustawienie (regulację). Zastosowanie magnetycznych styków polepsza kontakt z wałkiem przez co zyskuje się na wydajności tonera IR1435 oraz lepszym zabezpieczeniem przed wyciekem.

    Заряд звено (paseczki) — paseczki poprawiające właściwości ładujące wałka magnetycznego Mag ролика, stosowane ш CEĻU uzyskania lepszego zaczernienia wydruków ш Imagerunner 1435. Stosując JE Разем г wałkami magnetycznymi przedłuża się żywotność Tych elementów, tym samym zmniejszamy koszty regeneracji kartridża imageRUNNER1435.

    Zaślepka otworu wsypowego — Крышка заливной горловины — często podczas regeneracji image RUNNER 1435 przy wyjmowaniu korka zasypowego dochodzi do uszkodzenia jego budowy.Wyniku этот тонер ze zbiornika Canon IR 1435 ze świeżym proszkiem zacznie wyciekać. W таким przypadku w kasecie IR1435 należy wymienic korek na nowy.

    Пружинная блокировка (LockSpring) — Пружинная блокировка, приводящая в действие док-станцию ​​(регулируемая) вала магнитного магнитного ролика с кейсом imageRUNNER 1435 или поправкой контакта с электрическими насадками для проверки.

    Laser — встроенный микропроцессор drukarki imageRUNNER1435 naświetla w zaprogramowanych miejscach naładowaną elektrostatycznie powierzchnię światłoczułą bebna, powodując zmianę ladunku.W efekcie w image RUNNER 1435 powstaje obraz drukowanej strony na bębnie — wstępnie tylko w formie elektrostatycznej.

    Śmietnik (Мусорное ведро) — Zbiornik на тонер resztkowy ж kartridżu Canon IR 1435 Bęben światłoczuły OPC obracając się ж kasecie IR1435 wchodzi ш Kontakt г listwą czyszczącą (Wiper Blade), która usuwa г powierzchni bębna Pozostałe cząsteczki tonera, które to gromadzone są w «śmietniku» (Мусорное ведро). Из-за того, что тонер там не нужен, он делает зарядку с imageRUNNER 1435, отключив свое электростатическое питание.

    Seal (plomba) — plomby samoprzylepne w postaci naklejanego paska są zabezpieczeniem wszędzie tam, gdzie brak jest zamknięcia mechanicznego kasety imageRUNNER1435. Plomba ta posiada warstwę kleju oraz tasiemkę, którą usuwamy przed włożeniem tonera do drukarki image RUNNER 1435. W drukarkach laserowych Canon IR 1435 plomba samoprzylepna jest używana głównie w celu zapewnienia bezpiecznego transportu kartridża po jego zregenerowaniu oraz przed zawilgoceniem tonera.

    Dell PowerEdge SC1435 Обновления микросхем памяти и оперативной памяти

    Системы памяти данных

    содержат полную линейку обновлений памяти Dell, включая память для Dell PowerEdge SC1435. Обновления памяти Dell PowerEdge SC1435 от Data Memory Systems гарантированно совместимы на 100 %. Наши обновления памяти Dell PowerEdge SC1435 производятся в соответствии с исходной спецификацией Dell для обеспечения совместимости. Все обновления памяти Dell PowerEdge SC1435 проходят испытания в нашей тестовой лаборатории и имеют пожизненную гарантию.

    Поиск подходящего модуля памяти для Dell PowerEdge SC1435 никогда не был таким простым. Вы можете использовать поле поиска по номеру модели и ввести «PowerEdge SC1435» или воспользоваться нашим очень простым средством поиска памяти, чтобы выбрать правильное обновление памяти Dell PowerEdge SC1435 для вашей системы. Сначала выберите Dell в качестве производителя, а затем выберите правильный тип продукта Dell (настольный компьютер, ноутбук и т. д.) из следующих вариантов. Затем найдите нужную линейку продуктов, в данном случае это будет память Dell PowerEdge.На странице памяти Dell PowerEdge теперь можно выбрать модель памяти Dell PowerEdge SC1435. Средство поиска памяти Data Memory Systems поможет вам сделать правильный выбор. Если вы все еще не уверены, вы можете использовать наш онлайн-чат для получения помощи или позвонить в нашу команду по продажам по телефону (800) 662-7466.

    Модернизация памяти — это самый простой и недорогой способ продлить срок службы вашего Dell PowerEdge SC1435. Прежде чем покупать дорогой новый компьютер, инвестируйте в обновление памяти Dell, которое вдохнет новую жизнь в ваш Dell.Ваш Dell PowerEdge SC1435 будет работать быстрее и эффективнее, если вы добавите новую модернизацию памяти Dell от Data Memory Systems.

    Data Memory Systems продает обновления памяти уже более двадцати лет. Мы стремимся иметь самые низкие цены на обновления памяти самого высокого качества. Но покупки в Интернете — это больше, чем просто цены. Речь идет о том, чтобы чувствовать себя комфортно и безопасно и знать, что вы делаете покупки в магазине, которому можно доверять. Системы памяти данных устанавливают стандарт обслуживания клиентов в первую очередь с 1987 года.

    Эффективность платформы ДНК-чипов на полимерной основе при обнаружении и генотипировании вируса папилломы человека в клинических образцах

    J Clin Microbiol. 2009 май; 47 (5): 1428–1435.

    T. Schenk

    Отделение вирусологии Университетского медицинского центра Фрайбурга, Hermann-Herder-Str. 11, D-79104 Фрайбург, Германия, 1 Лаборатория химии и физики интерфейсов, факультет микросистемной инженерии (IMTEK), Фрайбургский университет, Georges-Köhler-Allee 103, D-79110 Фрайбург, Германия, 2 Институт Патологии, Университетский медицинский центр Фрайбурга, Breisacher Strasse 115a, D-79106 Freiburg, Germany, 3 Лаборатория ДНК-анализа, Klarastrasse 63, D-79106 Freiburg, Germany 4

    T.Brandstetter

    Отделение вирусологии Университетского медицинского центра Фрайбурга, Hermann-Herder-Str. 11, D-79104 Фрайбург, Германия, 1 Лаборатория химии и физики интерфейсов, факультет микросистемной инженерии (IMTEK), Университет Фрайбурга, Georges-Köhler-Allee 103, D-79110 Фрайбург, Германия, 2 Институт Патологии, Университетский медицинский центр Фрайбурга, Breisacher Strasse 115a, D-79106 Freiburg, Germany, 3 Лаборатория ДНК-анализа, Klarastrasse 63, D-79106 Freiburg, Germany 4

    A.zur Hausen

    Отделение вирусологии Университетского медицинского центра Фрайбурга, Hermann-Herder-Str. 11, D-79104 Фрайбург, Германия, 1 Лаборатория химии и физики интерфейсов, факультет микросистемной инженерии (IMTEK), Университет Фрайбурга, Georges-Köhler-Allee 103, D-79110 Фрайбург, Германия, 2 Институт Патологии, Университетский медицинский центр Фрайбурга, Breisacher Strasse 115a, D-79106 Freiburg, Germany, 3 Лаборатория ДНК-анализа, Klarastrasse 63, D-79106 Freiburg, Germany 4

    J.Alt-Mörbe

    Отделение вирусологии Университетского медицинского центра Фрайбурга, Hermann-Herder-Str. 11, D-79104 Фрайбург, Германия, 1 Лаборатория химии и физики интерфейсов, факультет микросистемной инженерии (IMTEK), Фрайбургский университет, Georges-Köhler-Allee 103, D-79110 Фрайбург, Германия, 2 Институт Патологии, университетский медицинский центр Фрайбурга, Breisacher Strasse 115a, D-79106 Freiburg, Germany, 3 Лаборатория ДНК-анализа, Klarastrasse 63, D-79106 Freiburg, Germany 4

    D.Huzly

    Отделение вирусологии Университетского медицинского центра Фрайбурга, Hermann-Herder-Str. 11, D-79104 Фрайбург, Германия, 1 Лаборатория химии и физики интерфейсов, факультет микросистемной инженерии (IMTEK), Университет Фрайбурга, Georges-Köhler-Allee 103, D-79110 Фрайбург, Германия, 2 Институт Патологии, Университетский медицинский центр Фрайбурга, Breisacher Strasse 115a, D-79106 Freiburg, Germany, 3 Лаборатория ДНК-анализа, Klarastrasse 63, D-79106 Freiburg, Germany 4

    J.Rühe

    Отделение вирусологии Университетской медицины Фрайбурга, Hermann-Herder-Str. 11, D-79104 Фрайбург, Германия, 1 Лаборатория химии и физики интерфейсов, факультет микросистемной инженерии (IMTEK), Фрайбургский университет, Georges-Köhler-Allee 103, D-79110 Фрайбург, Германия, 2 Институт Патологии, Университетский медицинский центр Фрайбурга, Breisacher Strasse 115a, D-79106 Freiburg, Germany, 3 Лаборатория ДНК-анализа, Klarastrasse 63, D-79106 Freiburg, Germany 4

    Отделение вирусологии Университетского медицинского центра Фрайбурга , Герман-Хердер-ул.11, D-79104 Фрайбург, Германия, 1 Лаборатория химии и физики интерфейсов, факультет микросистемной инженерии (IMTEK), Фрайбургский университет, Georges-Köhler-Allee 103, D-79110 Фрайбург, Германия, 2 Институт Патологии, университетский медицинский центр Фрайбурга, Breisacher Strasse 115a, D-79106 Freiburg, Germany, 3 Лаборатория ДНК-анализа, Klarastrasse 63, D-79106 Freiburg, Germany 4

    * Автор, ответственный за переписку. Почтовый адрес: Лаборатория химии и физики интерфейсов, кафедра инженерии микросистем (IMTEK), Фрайбургский университет, Georges-Köhler-Allee 103, D-79110 Freiburg, Germany.Телефон: 49 761 203 7160. Факс: 49 761 203 7162. Электронная почта: [email protected]

    Текущий адрес: LADR GmbH, MVZ Baden-Baden, Lange Str. 65, D-76530 Баден-Баден, Германия.

    Поступила в редакцию 28 октября 2008 г .; Пересмотрено 22 декабря 2008 г .; Принято 2 марта 2009 г.

    Copyright © 2009, Американское общество микробиологии

    Резюме

    Вирус папилломы человека (ВПЧ) играет ключевую роль в развитии рака шейки матки и гортани. Цель нашего исследования состояла в том, чтобы сравнить эффективность нового биочипа для генотипирования ВПЧ на основе гидрогеля (Biochip) с коммерчески доступной и CE-маркированной традиционной ПЦР с последующей обратной гибридизацией (GenID-PCR).Для исследования были доступны 123 образца. Из этих образцов 101/123 были гинекологическими мазками, 8/123 были мазками или образцами биопсии генитальных бородавок, 7/123 были образцами биопсии оториноларингеальных поражений, 5/123 были образцами кожных бородавок и 2/123 были образцами ротогубных бородавок. аномалии. Эти молекулярные методы генотипирования ВПЧ показали сопоставимую чувствительность и специфичность. Однако 19 из 123 результатов оказались противоречивыми. В частности, Biochip продемонстрировал лучшую эффективность при обнаружении множественных инфекций, особенно при наличии более одного генотипа высокого риска.Из-за различных конфигураций зондов, используемых в двух анализах, GenID-PCR обеспечивает только групповое обнаружение многих генотипов ВПЧ, тогда как Biochip позволяет проводить специфическую идентификацию. В целом недавно разработанная система чипов ВПЧ (Биочип) оказалась подходящим инструментом для обнаружения и генотипирования ВПЧ; он также оказался превосходным для установления методов генотипирования ВПЧ.

    В настоящее время хорошо известно, что персистирующая инфекция вирусом папилломы человека (ВПЧ) играет ключевую роль в развитии карциномы шейки матки, которая является вторым наиболее распространенным злокачественным новообразованием у женщин во всем мире.Было показано, что некоторые генотипы ВПЧ связаны с высоким риском канцерогенеза. ВПЧ типа 16 (ВПЧ-16) и ВПЧ-18 ответственны за более чем 70% карцином шейки матки, в то время как другие генотипы высокого риска (ВПЧ-31, -33, -45, -52, -58 и другие) встречаются реже (34, 38, 39).

    Из-за высокой отрицательной прогностической ценности отрицательного результата теста на ВПЧ в сочетании с отрицательными результатами цитологического исследования ожидается, что в будущем тестирование ДНК дополнит цитологию в рутинном гинекологическом скрининге, что позволит разработать более экономичный программа скрининга с увеличенными интервалами между посещениями пациентов (11).Для женщин с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями низкой степени тяжести или атипичными плоскоклеточными клетками неопределенного значения тестирование на ВПЧ является важным требованием для стратегии сортировки (3, 32). Поскольку значительная часть инфекций ВПЧ, включая генотипы ВПЧ-16 и -18 высокого риска, устраняется иммунной системой в течение нескольких месяцев, однократного обнаружения ДНК ВПЧ недостаточно для прогнозирования развития рака, особенно у молодых женщин (5). ). Следовательно, способность генотипировать, по крайней мере, наиболее распространенные штаммы ВПЧ высокого риска, т.е.e., HPV-16 и -18, чтобы отличить персистирующие инфекции с тем же генотипом от последующих инфекций с другими генотипами HPV, является важной особенностью современных анализов HPV (16, 33).

    За последние 2 года мы стали свидетелями прорыва в профилактике ВПЧ-инфекций. Большая часть прогресса является результатом иммунологических исследований, которые проложили путь к разработке первых эффективных профилактических вакцин (9, 25, 35, 37). Поскольку вакцины, представленные в настоящее время на рынке, считаются эффективными только в профилактических, а не в терапевтических условиях, необходим высокочувствительный и специфичный диагностический инструмент для генотипирования ВПЧ, чтобы исключить активную ВПЧ-инфекцию перед вакцинацией (10).

    Кроме того, универсальный инструмент для генотипирования ВПЧ будет полезен для мониторинга эпидемиологических последствий после широкого клинического применения вакцинации против ВПЧ, т. е. долгосрочной защиты от генотипов, включенных в вакцину, перекрестной защиты от некоторых других генотипов и потенциального сдвига в преобладании генотипов, не охваченных прямой или перекрестной защитой.

    Традиционные методы обнаружения ВПЧ, например цитологические и иммунологические методы, обладают низкой специфичностью и чувствительностью.В настоящее время для обнаружения ВПЧ чаще всего используются молекулярные методы, включая гибридизацию нуклеиновых кислот и ПЦР (18, 30). Однако существует неотъемлемая опасность ложноположительных результатов из-за неспецифической амплификации, а также ложноотрицательных результатов из-за различий в сайтах связывания праймеров в области-мишени вируса, которые снижают эффективность амплификации некоторых последовательностей генотипа ВПЧ. . Кроме того, для генотипирования ВПЧ требуется либо специфическая для генотипа ПЦР, либо последующие трудоемкие процедуры, такие как секвенирование и гибридизация.Эти методы проявляют трудности в идентификации всех генотипов ВПЧ, присутствующих при множественных инфекциях (36).

    Недавно появились сообщения о первых исследованиях, включающих генотипирование ВПЧ с использованием генотип-специфических олигонуклеотидов и анализ ДНК на микрочипах (1, 2, 7, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 22, 23, 24, 27). , 28, 31). Технология чипов ВПЧ дает преимущества как в обнаружении множественных инфекций, так и в чувствительности (T. Brandstetter, S. Böhmer, O. Prucker, E. Bissé, A. zur Hausen, J. Alt-Mörbe, J.Рюэ, представленный для публикации).

    В этом исследовании мы сравнили новый полимерный ДНК-биочип (Biochip) для обнаружения и генотипирования ВПЧ (Brandstetter et al., представлено) с имеющимся в продаже набором для ПЦР с маркировкой СЕ, который включает обратную гибридизацию ампликонов ПЦР на нитроцеллюлозе. мембранные полоски (GenID-PCR) с использованием клинических образцов (цервикальные мазки, образцы биопсии тканей и др.). Генетическое секвенирование служило эталонным стандартом в случае расхождения результатов двух методов.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Сбор проб и выделение нуклеиновых кислот.

    В исследование были проспективно включены 123 неотобранных клинических образца, отправленных в отделение вирусологии Университетского медицинского центра Фрайбурга для плановой диагностики ВПЧ. Все образцы немедленно хранились при 4°C до дальнейшей обработки и подвергались процедурам выделения нуклеиновых кислот в течение 1–2 рабочих дней.

    Цервикальные мазки брали специальными щеточками (Duo-Brush; Laboratoire C.C.D., Париж, Франция), а головку щетки освобождали и погружали в 2 мл метанола, содержащего среду для фиксации образца (Laboratoire C.C.D., Париж, Франция) для транспортировки в лабораторию при температуре окружающей среды. Для высвобождения прикрепленных клеток перед выделением нуклеиновой кислоты пробирку, содержащую фиксирующую среду, и головку щетки тщательно встряхивали. 2 мл клеточной суспензии переносили в 2-мл реакционную пробирку и дважды промывали по 2 мин центрифугированием при 14000 об/мин с последующим удалением надосадочной жидкости и ресуспендированием осадка в 1 мл фосфатно-солевого буфера.После второго этапа промывки осадок ресуспендировали в 200 мкл фосфатно-солевого буфера и использовали для выделения ДНК с помощью мини-набора ДНК крови Qiagen (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя (протокол для вирусной ДНК с элюированием в 60 мкл предварительно нагретого буфера АЕ).

    Образцы биопсии ткани были отправлены в лабораторию в стерильном изотоническом растворе NaCl. Максимум 5 мм ткани 3 разрезали на мелкие кусочки одноразовым скальпелем в стерильной чашке Петри.Фрагменты переносили в реакционную пробирку объемом 1,5 мл и добавляли 180 мкл лизирующего буфера ATL (Qiagen, Hilden, Германия) и 20 мкл протеиназы К (Qiagen, Hilden, Германия) перед тем, как реакционную смесь инкубировали при 60°C в течение ночи. или до полного лизиса. Затем раствор использовали для выделения ДНК с помощью мини-набора ДНК крови Qiagen, как описано выше, но без добавления протеазы во время процедуры.

    Поверхностные кожные мазки переносили в стерильном изотоническом растворе NaCl.Прикрепленные клетки энергично ресуспендировали встряхиванием перед выделением нуклеиновой кислоты. В общей сложности 200 мкл клеточной суспензии обрабатывали мини-набором ДНК крови Qiagen (протокол для вирусной ДНК) в соответствии с инструкциями производителя.

    Очищенную вирусную и клеточную ДНК сразу же замораживали в двух аликвотах по 30 мкл каждая и хранили при -20°C до ПЦР-амплификации. Одну из этих аликвот использовали для рутинной диагностики ВПЧ с помощью коммерчески доступного GenID-PCR.

    Процедура амплификации для биочипа.

    Все образцы ДНК, использованные в настоящем исследовании, были подготовлены в отделении вирусологии Университетского медицинского центра Фрайбурга. Для генотипирования ВПЧ использовали минимум 200 нг общей ДНК. Была применена пара олигонуклеотидных праймеров, специфичных для консенсусных последовательностей в конце 1 (L1) областей всех известных ВПЧ. Последовательность смыслового праймера была 5′-TRT TTG TTA CTG TKG TWG ATA C-3′ (TAGAT 5.2, собственный праймер), а последовательность антисмыслового праймера была 5′-CptGptTpt CptCptH ARR GGW AYT GAT C-3. ′ (MY09) (31), дающий продукт ПЦР длиной около 405 п.н. (генотип-специфичная вариация длины).Антисмысловой праймер имел модификации фосфотионатного праймера (обозначенные строчными буквами) первых пяти нуклеотидов на 5′-конце, защищая антисмысловую цепь ПЦР от расщепления экзонуклеазой.

    ПЦР проводили во флаконе объемом 0,2 мл (Biozym, Hessisch Oldendorf, Германия) с использованием усовершенствованной системы Primus 25 (MWG Biotech, Эберсберг, Германия), содержащей 1× буфер (Qiagen, Hilden, Германия), 4 мМ MgCl 2 (Qiagen, Hilden, Germany), смесь нуклеотидов (dATP, dCTP и dGTP, по 300 мкМ; Amersham, Нью-Джерси), биотин-11-dUTP (30 мкМ; Fermentas, St.Leon-Rot, Германия), dTTP (80 мкМ; Amersham, Нью-Джерси), праймеры (1 мкМ) и полимераза HotStarTaq (0,1 ед/мкл; Qiagen, Hilden, Германия). Общий использованный реакционный объем составлял 50 мкл. После активации полимеразы инкубацией в течение 15 мин при 95°С проводили 50 циклов по 1 мин при 95°С с последующим отжигом при 53°С в течение 1 мин и элонгацией при 72°С в течение 1 мин. Окончательную элонгацию проводили в течение 10 мин при 72°С перед охлаждением до 4°С.

    Для получения одноцепочечных продуктов ПЦР на чипе продукты ПЦР расщепляли экзонуклеазой гена 6 Т7 (70025Z; USB).Поэтому образец смешивали с 5-кратным буфером для расщепления и 50 ЕД экзонуклеазы гена 6 Т7 (USB, Огайо), затем инкубировали в течение 15 минут при 37°С и, наконец, денатурировали при 95°С. После немедленного охлаждения образца предварительно охлажденным до -20°С этанолом его смешивали в равных частях с 200 мМ буфером NaPi (смесь динатрийгидрофосфата и натрия дигидрофосфата, рН 7.0). Затем образец, содержащий не менее 30% одноцепочечного антисмыслового продукта ПЦР, использовали для анализа с помощью Biochip.

    Биочип: описание анализа.

    В общей сложности 63 последовательности зондов с 5′-модификациями 15-мерных тиминовых хвостов (очищенные высокоэффективной жидкостной хроматографией; TIB Molbiol, Берлин, Германия) были напечатаны в четырех равных субматрицах (два на два) с использованием sciFlexarrayer S5 (Scienion AG, Берлин, Германия). Олигозонды наносили в концентрации 20 мкМ в растворе для пятен, состоящем из 400 мМ NaPi, на имеющиеся в продаже поверхности. Раствор для пятен содержал, помимо буферной соли и ДНК, 1 мг/мл полимера.Используемая температура печати составляла 22°C при влажности от 60 до 65%. Используемый объем пятна составлял около 0,8 нл на точку, в результате чего диаметр пятна составлял около 175 мкм. Расстояние между точками было выбрано равным 350 мкм, а расстояние между подрешетками в 500 мкм составляло 500 мкм. Процедура печати проводилась на 384-луночном планшете. Отпечатанные матрицы отжигали в течение 1 ч при 70°С с последующей фотосшивкой при 254 нм с энергией 1,25 Дж. После подготовки образцы хранили при комнатной температуре. Схема подрешетки показана ниже (см.). Три олигозонда нацелены на один генотип ВПЧ. Продукт ПЦР ВПЧ длиной около 405 п.н., длина которого зависит от генотипа ВПЧ, несет три гетерогенных домена в области L1 генома ВПЧ. Эти домены можно использовать для идентификации генотипов ВПЧ. Двенадцать генотипов ВПЧ были выбраны для анализа с помощью этого чипа ВПЧ. Зонды были окружены методическими контролями, такими как отрицательный контроль, содержащий только пятнистый раствор, который позволяет нам измерять фон, один отрицательный контроль, содержащий последовательность гена лейкоцитарного антигена человека DRB1 (NCHL), один контроль для обнаружения, содержащий 3′ -биотинилированный олигонуклеотидный зонд, линия разведения гибридизационного контроля для ВПЧ-положительного контроля, который состоял из универсальной антисмысловой последовательности ВПЧ области L1, линия разведения связующего контроля (олигозонд с 3′ Су5; максимальная концентрация, 0.25 мкМ) и, наконец, повторная калибровка чипа (последовательность β-глобина). Все олигонуклеотидные зонды, используемые Biochip, перечислены в таблице. Основные этапы обработки способа показаны на рис.

    Процедура обращения с биочипом. После подготовки ДНК из различных образцов проводят меченую специфическую ПЦР для области L1 генома ВПЧ. Для оптимизации условий гибридизации ампликон ПЦР восстанавливается до одной нити с помощью расщепления экзонуклеазой. За гибридизацией меченого ампликона и окрашиванием гибридизованного ПЦР-ампликона в разведении 1:200 стрептавидином-Cy5 в проточной кювете следует считывание флуоресценции.

    Репрезентативные примеры результатов Biochip и GenID-PCR. (A) Конструкция подмассива проиллюстрирована подробно, со всеми конкретными зондами в центре подмассива и системными и методическими элементами управления, окружающими конкретные зонды. (B) Показан типичный результат генотипирования ВПЧ-6 после экспозиции 60 с. Кроме того, прилагаются изображение ампликона ПЦР после гель-электрофореза и типичная полоска блота GenID-PCR образца. (C) Обнаружение и генотипирование образца с множественными инфекциями ВПЧ, указанными Biochip, выявило три генотипа ВПЧ (ВПЧ-6, -18 и -31) после времени воздействия 60 с, тогда как GenID-ПЦР обнаруживает только ВПЧ-6. и -18.

    Таблица 1.

    Список всех конкретных последовательностей зондов HPV, с тремя датчиками для каждого генотипа

    999-7019 9 9 3 3 2 9 3 3 9 9 43 2 9 9 3 9064-6986 D.1
    HPV зонд

    A

    последовательность (5′-3 ‘) B Позиция Номер доступа Для индивидуальных генотипов
    6 1 9 1 9 1 AAC AAC AAT TCT GAT TAT AAA GAG 6841-6859 x00203,1
    6 2 CCC CAA ATG GTA Cat Tag AAG 6999-7019
    6 3 9 3 AGA ACC CAG ATC CCT ATA AGA ACC TT 7086-7105
    11 1 AAT AAT TCA GAT TAT AAG GAA 6824- 6844 М14119.1
    11 2 9 2 CAC CAA ATG GTA CAC TGG AGG 6984-7004 6984-7004
    9 3 AAC AGG ATC CCT ATA AGG ATA TG 7068-7090 70626
    16
    16 1 1 AAA AAT AAC AAC TTT AAG GAG 6702-6722 6702-6722 K027181
    16 2 CCC CAG GAG GCA CAC Tag AAG 6862-6882
    16
    16 3 3 AAG AAP ATC ATC CCC TTA AAA AAT AC 6946-6968
    9 1 Gat GTC ACC AAA TTT AAG CAG 6681-6701 AY262282.1
    18 2 9 2 CCC CAA CTA CTA GTT TGG TGG 6843-6861
    9 3 ATA AGG ATC CCT ATG ATA AGT TA 6925-6947
    31
    31 1 1 AAA AGT AGT AAT TTT AAA GAG 6620-6640 J04353.1
    31 2 CTC CCT CCT GTT CTT TGG AGG 6780-6800
    31
    AGG AAG AAG ATC Cat TTA AAG ATT на 6864-6886
    33 1 AAA AAA AAT Gaa AAT TTT AAA GAA 6656-6676 M12732.1
    33 2 2 CTC Cat CTG CTA GTT TAC AGG 6816-6836 6816-6836 60626
    AGG AG AG ACC Tag GTA AAT на 6900-6922 6

    35
    35 1 1 AAA AAT GAC AAT TTT AAG GAA 6642-6662 M74117.1
    CGC CTT CTG GTA CCT Tag AGG 6802-6822
    35
    AAG ATG ATC Cat Taa AAA ATT на 6886-6908
    43 1 GAC AAT GCA AAG TTT AAG Gaa 6819-6839 AJ620205.1
    43
    CTG CCT CCT CTG CTT CTT TGG AAG 6979-6999 6979-6999
    3 GGG AGG ATC CCT ATA AAA AGT на 7063-7085
    52
    52 1 9 AAA AAT Gaa AAT TTT AAG Gaa 6720-6740 X74481.1
    52 2 CAC CGT CTG CAT CTT TGG AGG 6880-6900
    52
    AGG AAG ATC CTT TAA AGG ACT на 6964-6986
    56 1 GAT GCA CGA AAA ATT AAT CAG 6656-6676
    56 2 CAg Tgg CCA CCA gCC ​​TAg AAg 6816-6836 X74483.1
    56 3 3 AAC AGG ACC Cat Cat CTA AAT на 6900-6922
    58 1 CTG AAG Taa CTA AGG AAG GTA CA 66712-6701
    58 2 2 CTC CGT CTG CCA GTT TAC AGG 6865-6885 6865-6885 60626
    58 3 AGG AAG ATC Cat Taa Ata AAT на 6949-6971
    73 1 gCC AAC TCT AAT TTT AAg gAA 6559-6579 X94165.1
    73 2 73 2 93 2 CAC CGT CGT GTA CTT Tag AGG 6719-6739 6719-6739 6719-6739 9 93 3 CAG AGG ACC Cat ATG CCA AGC TA 6803-6825
    HC CGT CCV ARR GGA Way TGA TC
    βG CAC GCC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT β-GlobIn NM000518.4
    CY5 AS βG CY5 -CAG ggC gTg AgA CTT CTC CTC Agg AgT β-глобин NM000518.4
    DRB1 ТТТ TTG TGA GGG AGT
    DC GTT GGT AAA GTC TgC Bio
    CC TTTACA CAATC gAACy5 CTA TgC TTC AAG CAG

    Работа с биочипами и их обнаружение.

    Чипы были помещены в устройство для считывания чипов, состоящее из лазера, камеры проточной ячейки и камеры с зарядовой связью (ПЗС) (рис. ) (21). В проточной ячейке можно наблюдать процесс гибридизации молекул от жидкой фазы до иммобилизованных олигонуклеотидов на поверхности преобразователя.Возбуждение флуорохромов осуществляется полупроводниковым лазером. Флуоресцентное излучение регистрировалось охлаждаемой ПЗС-камерой. Чип устанавливался таким образом, чтобы была достигнута однородная эфемерная засветка активной области поверхности сенсора. Перед гибридизацией ДНК на чипе с меченой ДНК анализируемого вещества (меченые одноцепочечные ПЦР-ампликоны) измеряли флуоресценцию чипа через 30, 60 и 90 с в сухих условиях. После заполнения проточной кюветы ридера образец гибридизовали на массиве в течение 20 мин.Далее образец был удален. Чип промывали 3 мл 100 мМ NaPi, который медленно пропускали через ячейку. После сушки воздухом/азотом чип инкубировали со стрептавидином-Cy5 (PA 45001, разбавленный 1:200 в 100 мМ NaPi; GE Healthcare, Мюнхен, Германия), выявляя меченный биотином ПЦР-ампликон. На следующем этапе чип промывали 3 мл буферного раствора NaPi для удаления несвязавшегося стрептавидина-Cy5. Для считывания было выбрано время экспозиции от 30 до 90 с. Использовался программный пакет собственной разработки для определения генотипов ВПЧ.

    Технические детали считывателя биочипов. Монохроматический свет (4) направляется на пластиковую подложку микрочипа (1), так что происходит полное внутреннее отражение. Эванесцентное поле распространяется вдоль поверхности, позволяя возникнуть возбуждению флуоресценции. Подложка служит волноводом, позволяющим детектировать взаимодействие между иммобилизованными зондами (2) и меченой ДНК в проточной кювете (3). ПЗС-камера (7) с фильтром (8) регистрирует интенсивность флуоресценции. Система охлаждения (5) с элементом Пельтье (6) за ней регулирует температуру раствора для гибридизации.

    Обнаружение ВПЧ и генотипирование с помощью GenID-PCR.

    Вкратце, набор для амплификации и обнаружения ВПЧ (GenID, Штрассберг, Германия) содержит две пары биотинилированных праймеров (PN-I и PN-II), нацеленных на фрагмент гена L1 ВПЧ длиной 145 п.н., для двух отдельных стандартных ПЦР. Кроме того, пара праймеров, специфичных для человеческого гена домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), включена в реакционную смесь PN-I для контроля адекватного содержания клеточной ДНК.После ПЦР-амплификации продукты реакции из PN-I и PN-II смешивают и используют для гибридизации со специфическими для ВПЧ олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на нитроцеллюлозной полоске в наборе для генотипирования ВПЧ. Щелочная фосфатаза, связанная со стрептавидином, связывается с захваченными, меченными биотином продуктами амплификации. После добавления BCIP-NBT (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат-нитросиний тетразолий) в качестве колоригенного субстрата можно проанализировать структуру полос.

    Каждая полоска содержит контрольные полосы для добавления конъюгатов и выделения нуклеиновых кислот, а также для амплификации (GAPDH).Полоса полиспецифического ВПЧ указывает на присутствие ДНК ВПЧ любого из охватываемых генотипов, тогда как полоса ВПЧ высокого риска включает генотипы высокого риска (ВПЧ-16, -18, -31, -33, -35, -39, — 45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -66, -68, -73 и -82), а полоса ВПЧ низкого риска представляет генотипы низкого риска (ВПЧ-6 , -11, -40, -42 и -44). Односпецифичные полосы включены для HPV-16 и -18 как наиболее частых причин карциномы шейки матки, а также для HPV-45, -6 и -11, два последних из которых вызывают генитальные бородавки (остроконечные кондиломы).Групповые полосы представляют генотипы ВПЧ высокого риска 31, 33, 35 и 39 (3X) и генотипы ВПЧ высокого риска 51, 52, 53, 56, 58 и 59 (5X).

    Секвенирование.

    ПЦР разделяли на 1,8% (масса/объем) агарозном геле, фрагменты вырезали в УФ-свете с длиной волны 365 нм и очищали с помощью набора для гель-экстракции Qiagen MinElute (Qiagen, Hilden, Germany). Фрагменты элюировали 12 мкл H 2 O и 6 мкл подвергали анализу последовательности с использованием меченного флуоресцеином прямого праймера с набором для секвенирования SequiTherm Excel II от Epicenter Biotechnologies (Madison, Wisconsin) на секвенаторе ALF (Pharmacia, Uppsala). , Швеция).

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Всего обоими методами было проанализировано 123 невыбранных образца. Большинство образцов (82,1% [101/123]) состояло из гинекологических мазков (99 цервикальных мазков и 2 вагинальных мазка). Из них 25,7% (26/101) были взяты после предшествующей терапии (например, конизации шейки матки, лазерного лечения и т. д.) из-за цитологических или гистологических отклонений. Для 5,0% (5/101) положительный результат на ВПЧ был задокументирован в предыдущих тестах.

    Сопутствующие цитологические данные (со следующими классами: Пап II, 1 образец; Пап IIIA, 1 образец; Пап IIID, 13 образцов; Пап IVA, 1 образец; Пап V, 1 образец) и/или гистологические данные (цервикальная интраэпителиальная неоплазия степень 1 [CIN1], 3 образца; CIN2, 6 образцов; CIN3, 3 образца; внутриэпителиальная неоплазия вульвы 3, 1 образец; аденокарцинома, 1 образец) были доступны для 91.1% образцов (92/101). Из них 67 показали нормальные цитологические и/или гистологические результаты. Из 16 образцов с цитологией Pap III или выше 14 дали положительный результат на ВПЧ (9 с генотипами высокого риска). В девяти образцах с гистологическими данными CIN2 или выше семь были положительными на ВПЧ (шесть с генотипами высокого риска).

    Из оставшихся образцов 6,5% (8/123) были образцами биопсии или мазками от пациентов с диагностированными или подозреваемыми остроконечными кондиломами (остроконечными кондиломами), 5,7% (7/123) были образцами биопсии из оториноларингеальных источников (три из гортани, два небных, один надгортанный и один неизвестный), 4.1% (5/123) были образцами кожной биопсии или мазками из кожных бородавок, а 1,6% (2/123) были ротогубными мазками или образцами биопсии (таблица).

    Таблица 2.

    Таблица 2.

    Характеристики образцов включены перспективно в исследование

    Источник Изосчет Количество образцов / мазков (%) Тип образца на одного источника (NO.)
    Гинекологический образцы 101 (82,1%) Мазки с шейки матки (99)
    Мазки из влагалища (2)
    Генитальные бородавки9 906 (6,18 906,1 8 906)5%) образцы биопсии / тампоны (8)
    Оториноларингеальная биопсия 7 (5,7%) Образцы гортани (3)
    Palatal образцы (2)
    Эпиглоттейные образцы (1)
    Неизвестный (1)
    Образцы бородавок кожи 5 (4,1%) Образцы биопсии / тампоны (5)
    Оролабиальные аномалии Образцы 2 (1 .6%) Биоптаты/мазки (2)
    Всего 123 (100%)

    инфицирование ВПЧ-18, -31 и -6 (рис. ). В последнем случае ВПЧ-31 выявлял только биочип. В общей сложности 33,3% (41/123) всех образцов дали положительный результат по крайней мере одним из двух методов. Для 18,7% (23/123) образцов результаты были идентичны для двух анализов, но 14.6% (18/123) положительных образцов дали противоречивые результаты. В общей сложности 6,5% (8/123) образцов были положительными в Biochip, но отрицательными в GenID-PCR, а в 2,4% (3/123) коинфекции были обнаружены только с помощью Biochip. Противоположное созвездие было обнаружено в 4,1% (5/123) и 0,8% (1/123) образцов соответственно. Всего было секвенировано 6,5% (8/123) образцов, шесть образцов соответствовали результату Biochip и только один соответствовал результату GenID-PCR.

    Серьезные ошибки, определяемые как неспособность обнаружить инфекцию генотипами ВПЧ высокого риска, наблюдались с одинаково низкой частотой при использовании двух методов.В 4 из 123 случаев (3,3%) инфекция генотипа высокого риска была выявлена ​​только методом GenID-PCR. Три (2,4%) инфекции генотипами ВПЧ высокого риска были обнаружены только с помощью Biochip, а Biochip выявил коинфекцию двух генотипов высокого риска в двух (1,6%) образцах, тогда как только один генотип высокого риска был обнаружен с помощью GenID-PCR. (Стол ).

    ТАБЛИЦА 3.

    Образцы с расходящимися результатами анализов


    16 16 + LR
    Тип образца (диагноз)
    Biochip Genid-Pcr
    16
    02
    16
    Swab после удаления рака шейки (HPV-18 положительный) 33
    6 6
    57 57 B
    шейный матки (PAP PAP IIID) 62 B 9
    шейный тампон после лазерной обработки (PAP IIID / CIN3) 84 B
    90 b
    Мазок из шейки матки, аденокарцинома (Пап V) 16 + 52 90 609 16
    шейное масло (PAP IIID) 18 + 31 + 6 18 + 6
    2
    Swab (PAP IIID) 53 + 43 5x
    31 3x + LR
    шейки матки LR
    LR
    HR
    шейный тампон (CIN1) 6 3x
    Мазок с шейки матки, ранее положительный на ВПЧ-HR (CIN2) 5X
    Мазок с шейки матки 18

    Всего 60.1% (74/123) образцов дали отрицательный результат при использовании обоих методов. В общей сложности 5,7% (7/123) образцов не показали полосы GAPDH на GenID-PCR, что привело к недействительному результату теста, но дал положительный сигнал β-глобина на Biochip. Только один образец, поверхностный мазок, взятый из генитальной бородавки, не дал ни полосы GAPDH, ни сигнала β-глобина.

    Для расчета общей согласованности анализа было использовано в общей сложности 115 образцов, которые можно было оценить обоими методами. Обнаружение генотипа ВПЧ в одном анализе, который не охватывался другим анализом, не расценивалось как дискордантное.Следовательно, 87,8% (101/115) образцов дали одинаковые результаты в двух анализах.

    Генотипы ВПЧ высокого риска были обнаружены в 30 образцах (24,3%), т. е. в 29 цервикальных мазках и 1 мазке кожи. Выявлено шесть случаев двойной инфекции и один случай тройной инфекции с разными генотипами, пять из которых связаны с комбинацией двух разных генотипов высокого риска. Наиболее часто встречающимся генотипом высокого риска был ВПЧ-16, который был обнаружен в 12 образцах (10 с предыдущей терапией, аномальными результатами цитологии или патологии), за которым следовали ВПЧ-45 (3 образца) и ВПЧ-18 (2 образца). .Генотипы из группы ВПЧ 3Х (генотипы 31, 33, 35 и 39) были обнаружены в семи образцах, а из группы ВПЧ 5Х (51, 52, 53, 56, 58 и 59) – в пяти образцах. В мазке кожи был обнаружен один генотип высокого риска, который не поддавался дальнейшей типизации с помощью GenID-PCR.

    Генотипы низкого риска выявлены в 20 образцах (16,2%). Наиболее часто выявляемым генотипом низкого риска был ВПЧ-6, он был обнаружен в 11 образцах (7 цервикальных мазков, 1 образец остроконечных кондилом, 3 образца папилломатоза гортани).Другими генотипами низкого риска с идентификацией генотипа были ВПЧ-11 (образец генитальной бородавки), ВПЧ-43 (мазок из шейки матки, пап IIID; коинфекция с ВПЧ 53), ВПЧ-57 (образец бородавки на коже), ВПЧ-62 (мазок из шейки матки, Пап IIID), ВПЧ-84 (Пап IIID/CIN3 после лазерной обработки) и ВПЧ-90 (мазок из шейки матки, Пап IIID). Три инфекции ВПЧ низкого риска были обнаружены с помощью GenID-PCR без определения специфического генотипа (таблица).

    ТАБЛИЦА 4.

    Обзор генотипов ВПЧ, обнаруженных в различных материалах образцов

    /высокий риск (высокий риск) 21604 6 [24.3])
    Генотип ВПЧ (номер/всего [%]) a Кол-во проб b Тип(ы) проб(ы) (количество)
    12 12
    45 3 9
    18 2 шейные тампоны
    3x 7 шейные тампоны
    5X 5 5 5
    HR 1 1 Swab
    Низкий риск (20/123 [16.3])
    6 11 11
    Образец Genital Wart (1)
    Papilloma Papilloma Papilloma (3)
    11 1
    1 1 1 1
    57 1 Skin (рука) Wart образец
    62 1
    84 84 1
    1 1
    LR 3 шейные тампоны

    Обсуждение

    в современных лабораториях, важно, чтобы анализ методы совместимы с рутинным рабочим процессом.Процедуры, используемые для выделения вирусной ДНК, были идентичны в двух исследуемых здесь методах. Кроме того, время и усилия, необходимые для пипетирования для обычной ПЦР, для амплификации ДНК-мишени и для ручного генотипирования, сопоставимы. В случае Biochip процедура генотипирования ВПЧ требует 60 минут после амплификации, включая этапы одноцепочечного расщепления, гибридизации, промывки и окрашивания. За исключением расщепления экзонуклеазой, все этапы обработки и инкубации происходят в ридере Biochip, который состоит из проточной кюветы для гибридизации (рис.). Специально разработанный программный модуль HPV, адаптированный к программному пакету ATR версии 2.1, был запрограммирован, чтобы сделать его инструментом для автоматической идентификации генотипов HPV с помощью Biochip. Поскольку гибридизация образцов происходит при комнатной температуре, другие образцы можно манипулировать последовательно, используя герметизирующие рамки для гибридизации образцов. Один биочип может быть обработан в течение 15 минут; следовательно, 12 образцов могут быть проанализированы в течение 3 часов. В GenID-PCR используется обратная гибридизация меченных биотином продуктов амплификации с генотип-специфическими ДНК-зондами, иммобилизованными на нитроцеллюлозной полоске, с последующим обнаружением захваченных ампликонов с помощью хромогенной реакции, опосредованной щелочной фосфатазой, связанной со стрептавидином.Эта процедура требует этапов ручного пипетирования, периодов инкубации в водяной бане с нагревателем/шейкером и нескольких этапов промывки на шейкере. В общей сложности для обработки 12 образцов также требуется около 3 часов. Однако автоматизация реакции генотипирования для GenID-PCR возможна с использованием программируемого робота для блоттинга, например, Tecan ProfiBlot (Tecan, Майнц, Германия). Поскольку температура гибридизации должна поддерживаться строго на уровне 47°С с максимальным отклонением всего 0,5°С в соответствии с инструкциями производителя, необходим обогреваемый блок с точным контролем температуры.

    В этом исследовании мы сравнили результаты, полученные с помощью недавно разработанного мультиплексного биочипа, с результатами, полученными с помощью GenID-PCR, имеющегося в продаже набора для обнаружения и генотипирования ВПЧ с маркировкой CE. В общей сложности для сравнения было доступно 123 проспективно собранных образца, представляющих неотобранную популяцию образцов, отправленных в нашу обычную лабораторию.

    Таким образом, два метода показали хорошее согласование между анализами, с идентичными результатами на 87,8%. Основные ошибки, определяемые неспособностью обнаружить генотип ВПЧ высокого риска, происходили с одинаково низкой частотой в обоих методах без явного предпочтения определенных генотипов или исходных материалов.Принимая во внимание несколько различающиеся панели генотипов с низким уровнем риска, общее небольшое количество расходящихся результатов указывает на сравнимую аналитическую чувствительность двух тестов (таблица). Однако генетическое секвенирование, используемое в качестве золотого стандарта для определения генотипа, показало более высокую аналитическую специфичность Biochip.

    Аналогичным образом, оба метода показали одинаковую эффективность при обнаружении двойного заражения (таблица). Мы обнаружили один случай предполагаемого тройного заражения, который был обнаружен только с помощью биочипа.Таким образом, можно предположить, что из-за технически отличающегося характера обнаружения чипов Biochip может иметь преимущество в идентификации множественных инфекций, затрагивающих более двух разных генотипов. Интересно, что в предыдущем исследовании, сравнивавшем GenID-PCR с набором INNO-LiPA (анализ линейных зондов) (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Леверкузен, Германия), который также основан на принципе обратной гибридизации, набор INNO-LiPA обнаружил больше инфекции высокого риска, чем анализ GenID-PCR (17, 29).

    Биочип покрыт наборами зондов, специфичных для ряда отдельных генотипов ВПЧ. Напротив, из-за ограниченного места на полосках для гибридизации GenID-PCR объединяет несколько разных генотипов в групповые полосы для обнаружения групп ВПЧ высокого риска 3X и 5X. Эта стратегия может вызвать проблемы при последующих транзиторных инфекциях с генотипами высокого риска той же группы, поскольку, например, инфекция ВПЧ-31, которая исчезла и за которой следует ВПЧ-33, будет интерпретирована GenID-ПЦР как персистирующая. .Хорошо известно, что только персистирующие инфекции с одним и тем же генотипом высокого риска подвержены риску развития рака (16). В этом отношении биочип предлагает техническое преимущество за счет меньшего количества ограничений на абсолютное количество точек для индивидуальной идентификации генотипа.

    В соответствии с опубликованными данными, в нашем исследовании ВПЧ-16 был наиболее часто выявляемым генотипом высокого риска, за которым следовали ВПЧ-45 и ВПЧ-18. ВПЧ-18 обычно называют вторым наиболее распространенным генотипом при тяжелых поражениях шейки матки (34).Относительно низкая распространенность ВПЧ-18 в нашем исследовании может быть объяснена не только ограниченным числом образцов, но и дополнительным смещением выборки. В Германии тестирование на ВПЧ с помощью цервикальных мазков в основном используется для сортировки атипичных плоскоклеточных клеток неопределенного значения или низкодифференцированных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (4), в то время как высокодифференцированные поражения удаляются хирургическим путем путем конизации шейки матки, а последующее тестирование на ВПЧ проводится затем выполняется с иссеченной тканью в лаборатории патологии.Следовательно, в нашей когорте исследований недавние поражения высокой степени могут быть недопредставлены.

    Специфичность Biochip была достигнута с использованием синтезированных олигонуклеотидов длиной от 35 до 38 пар оснований, специфичных для 12 изученных генотипов ВПЧ (Brandstetter et al., представлено). Чтобы улучшить процесс ПЦР, проводимый перед анализом биочипов, мы разработали новый смысловой праймер под названием TAGAT 5.2, который выявлял все 12 генотипов ВПЧ без потери специфичности или чувствительности по сравнению с MY11 (данные не показаны). Для достижения наилучшей способности дифференцировки среди этих 12 генотипов ВПЧ все выбранные олигонуклеотиды содержали более четырех несовпадений в пределах соответствующих гетерогенных локусов генов.Продукт ПЦР области L1 захватывает три из этих гетерогенных генных локусов с одним олигонуклеотидом для каждого генотипа ВПЧ. При множественных инфекциях количество типоспецифических продуктов ПЦР может быть ниже из-за конкурирующих реакций амплификации. Вместе с различиями в аффинности связывания детектирующих зондов это иногда приводит к паттернам флуоресценции только с двумя из трех генотип-специфических пятен, показывающих положительные сигналы (HPV-6, -18 и -31) (Fig. 1). По статистике, для идентификации различных генотипов необходимо как минимум два специфических зонда, чтобы избежать ложноположительных результатов.Следовательно, в случае биочипа обеспечивается успешное генотипирование ВПЧ даже при наличии множественных инфекций близкородственными генотипами ВПЧ. Кроме того, высокие выходы продуктов ПЦР-амплификации ВПЧ из клинических образцов, которые потенциально приводят к неспецифическим связываниям, не вызывают перекрестной гибридизации в Biochip (данные не показаны).

    Согласно исследованию географической изменчивости распространенности генотипов ВПЧ при раке шейки матки, генотипы ВПЧ 16 и 18 являются причиной 71% случаев рака шейки матки во всем мире (8, 26).15 наиболее частых генотипов CIN и/или рака шейки матки, в порядке убывания частоты: 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58, 35, 59, 56, 39, 51, 73, 68 и 66. (4). Основываясь на этом исследовании распространенности, Biochip может выявить примерно 85% инфекций высокого риска во всем мире. Согласно исследованию Castellsagué et al. (6), зонды, напечатанные на биочипе, охватывают последовательности более 95% всех связанных с раком инфекций во всем мире.

    В заключение можно сказать, что биочип хорошо зарекомендовал себя в обычной диагностической лаборатории.Следовательно, этот чип HPV может стать подходящим инструментом для обычных диагностических лабораторий. Кроме того, он показал преимущества в специфическом генотипировании, особенно в случае определенных генотипов, для которых в GenID-PCR достигается только группоспецифическое обнаружение (ВПЧ 3X и ВПЧ 5X), а также для множественных инфекций с более чем одним высоким риском. генотип. Необходимо провести дальнейшие исследования, особенно с образцами, залитыми парафином, чтобы расширить возможности этой платформы биочипов.

    Благодарности

    Мы благодарим Dieter Neumann-Haefelin за критический обзор рукописи, Otto Haller за поддержку и Franziska Rabold, Renate Mielke и Susanne Riesterer за отличную техническую поддержку.

    Данное исследование финансировалось Немецкой исследовательской ассоциацией (DFG) в рамках гранта DFG RU 489/15-1.

    Сноски

    Опубликовано до печати 11 марта 2009 г.

    ССЫЛКИ

    1. Ан, Х.Дж., К.Р. Ким, И.С. Ким, Д.В. Ким, М.Х. , JH Sohn, HK Yoon, ED Chang, HI Cho, JY Han, SR Hong и GH Ahn. 2005. Преобладание ДНК вируса папилломы человека в различных гистологических подтипах аденокарциномы шейки матки: популяционное исследование.Мод. Патол. 18528-534. [PubMed] [Google Scholar]2. An, HJ, NH Cho, SY Lee, IH Kim, C. Lee, SJ Kim, MS Mun, SH Kim и JK Jeong. 2003. Корреляция карциномы шейки матки и предраковых поражений с генотипами вируса папилломы человека (ВПЧ), обнаруженными с помощью метода микрочипа ДНК ВПЧ. Рак 971672-1680. [PubMed] [Google Scholar]3. Бьерре П., Л. Сильфвердал, Л. Дилнер, Б. Хагмар, Х. Эдвардссон, Дж. Дилнер и А. Андерссон-Эльстрём. 2008. Рандомизированное исследование лечения, основанного на вирусе папилломы человека и/или цитологическом исследовании, приводит к сортировке поражений шейки матки низкой степени.Являюсь. Дж. Обст. Гинекол. 19924.e1-24.e7. [PubMed] [Google Scholar]4. Боллман Р., А. Д. Варнаи, А. Банкфалви и М. Боллманн. 2007. Адаптированный к риску мультимодальный лабораторный скрининг шейки матки — Пап-тест будущего? Патология 28334-338. [PubMed] [Google Scholar]5. Bulkmans, NWJ, J. Berkhof, S. Bulk, MCG Bleeker, FJ van Kemenade, L. Rozendaal, PJF Snijders и CJLM Meijer. 2007. Показатели элиминации ВПЧ высокого риска при скрининге шейки матки. бр. Дж. Рак 961419-1424. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]6.Кастельсаге, X., М. Диас, С. де Санхосе, Н. Муньос, Р. Эрреро, С. Франчески, Р. В. Пилинг, Р. Эшли, Дж. С. Смит, П. Дж. Ф. Снайдерс, К. Дж. Л. М. Мейер и Ф. X. Бош. 2006. Всемирная папилломавирусная этиология аденокарциномы шейки матки и ее кофакторов: значение для скрининга и профилактики. Дж. Натл. Рак инст. 98303-315. [PubMed] [Google Scholar]7. Чой, Ю. Л., Э. Ю. Чо, Дж. Х. Ким, С. Дж. Нам, Ю. Л. О, С. Ю. Сонг, Дж. Х. Ян и Д. С. Ким. 2007. Обнаружение ДНК вируса папилломы человека с помощью ДНК-чипа в карциномах молочной железы корейских женщин.Опухоль биол. 28327-332. [PubMed] [Google Scholar]8. Cutts, FT, S. Franceschi, S. Goldie, X. Castellsague, S. de Sanjose, G. Garnett, WJ Edmunds, P. Claeys, KL Goldenthal, DM Harper и L. Markowitz. 2007. Вирус папилломы человека и вакцины против ВПЧ: обзор. Бык. Всемирная организация здравоохранения 85649-732. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Harper, D.M., E.L. Franco, C.M. Wheeler, A.B. Moscicki, B. Romanowski, C.M. Roteli-Martins, D. Jenkins, A. Schuind, S.A. Costa Clemens и G. Dubin от имени Группы по изучению вакцин против ВПЧ.2006. Устойчивая эффективность до 4,5 лет двухвалентной вакцины на основе вирусоподобных частиц L1 против вирусов папилломы человека типов 16 и 18: последующие результаты рандомизированного контрольного испытания. Ланцет 3671247-1255. [PubMed] [Google Scholar] 10. Хильдесхейм, А., Р. Эрреро, С. Вакхолдер, А. С. Родригес, Д. Соломон, М. С. Братти, Дж. Т. Шиллер, П. Гонсалес, Г. Дубин, К. Поррас, С. Э. Хименес и Д. Р. Лоуи за вакцину против ВПЧ в Коста-Рике Пробная группа. 2007. Влияние вакцины против вируса папилломы человека 16/18 L1 на молодых женщин с ранее существовавшей инфекцией: рандомизированное исследование.ЯМА 298743-753. [PubMed] [Google Scholar] 11. Хойер Х., К. Шенграбер, Р. Кюне-Хайд, К. Теллер, К. Грейнке, С. Лейстриц, Б. Людвиг, М. Дюрст и А. Шнайдер. 2005. Кумулятивный 5-летний диагноз CIN2, CIN3 или рака шейки матки после одновременного тестирования на ВПЧ высокого риска и цитологического исследования в условиях первичного скрининга. Междунар. Дж. Рак 116136-143. [PubMed] [Google Scholar] 12. Хван, Т. С., Дж. К. Чжон, М. Пак, Х. С. Хан, Х. К. Чой и Т. С. Пак. 2003. Обнаружение и типирование генотипов ВПЧ при различных поражениях шейки матки с помощью микроматрицы олигонуклеотидов ВПЧ.Гинекол. Онкол. 9051-56. [PubMed] [Google Scholar] 13. Канг Дж. И Х. Дж. Ли. 2008. Клиническая эффективность чип-теста ДНК ВПЧ в эпоху вакцинации против ВПЧ: 1211 случаев, исследование в одном учреждении. Корейская J. Lab. Мед. 2870-78. [PubMed] [Google Scholar] 14. Ким, Дж. Ю., Дж. К. Юн, М. Дж. Читарди, П. С. Батра и Х. Дж. Ро. 2007. Распространенность инфекции, вызванной вирусом папилломы человека, в образцах синоназальной инвертированной папилломы, классифицированная по гистологической степени. Являюсь. Дж. Ринол. 21664-669. [PubMed] [Google Scholar] 15.Ким, К. Х., М. С. Юн, Ю. Дж. На, К. С. Пак, М. Р. О и У. К. Мун. 2006. Разработка и оценка высокочувствительного ДНК-чипа для генотипирования вируса папилломы человека. Гинекол. Онкол. 10038-43. [PubMed] [Google Scholar] 16. Кьяер, С.К., А.Дж. ван ден Брюле, Г. Паулл, Э.И. Сваре, М.Е. Шерман, Б.Л. Томсен, М. Сантум, Дж. Э. Бок, П. А. Полл и К. Дж. Мейер. 2002. Типоспецифическая персистенция вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска как индикатор плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки высокой степени у молодых женщин: проспективное популяционное исследование.BMJ 325572. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]17. Кьер, С.К., Г. Брейгельманс, К. Мунк, Дж. Юнге, М. Уотсон и Т. Ифтнер. 2008. Популяционная распространенность, типо-возрастное распределение ВПЧ среди женщин до внедрения программы вакцинации против ВПЧ в Дании. Междунар. Дж. Рак 1231864-1870. [PubMed] [Google Scholar] 18. Клетер Б., Л. ван Доорн, Л. Шраувен, А. Молийн, С. Састровийото, Дж. тер Шеггет, Дж. Линдеман, Б. тер Хармсел, М. Бургер и В. Квинт. 1999. Разработка и клиническая оценка высокочувствительного ПЦР-обратногибридизационного линейного зонда для обнаружения и идентификации аногенитального вируса папилломы человека.Дж. Клин. микробиол. 372508-2517. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]19. Lee, G.Y., S.M. Kim, S.Y. Rim, H.S. Choi, C.S. Park, and J.H. Nam. 2005. Генотипирование вируса папилломы человека (ВПЧ) с помощью чипа ДНК ВПЧ при раке шейки матки и предраковых поражениях. Междунар. Дж. Гинекол. Рак 1581-87. [PubMed] [Google Scholar] 20. Ли, Х. С., К. М. Ким, С. М. Ким, Ю. Д. Чой, Дж. Х. Нам, К. С. Парк и Х. С. Чой. 2007. Генотипирование вируса папилломы человека с использованием чипа ДНК ВПЧ у корейских женщин. Междунар. Дж. Гинекол.Рак 17497-501. [PubMed] [Google Scholar] 21. Lehr, H.-P., M. Reimann, A. Brandenburg, G. Sulz и H. Klapproth. 2003. Обнаружение взаимодействий нуклеиновых кислот в режиме реального времени с помощью флуоресценции полного внутреннего отражения. Анальный. хим. 752414-2420. [PubMed] [Google Scholar] 22. Ли, Р. З., Дж. Ф. Ши, К. З. Чжоу, Р. Ф. Ву, Н. Ли, Л. Н. Ву, Ю. К. Чжоу, К. Ван, З. Х. Лю, Б. Лю и Ю. Л. Цяо. 2006. Оценка технологии генного чипа для папилломавируса человека высокого риска при скрининге рака шейки матки. Чжунхуа И Сюэ За Чжи 86307-311.[PubMed] [Google Scholar] 23. Liu, CH, WL Ma, R. Shi, YQ Ou, B. Zhang и WL Zheng. 2003. Возможность использования технологии ДНК-чипов для диагностики вируса папилломы человека. Дж. Биохим. Мол. биол. 36349-353. [PubMed] [Google Scholar] 24. Luo, C.W., C.H. Roan, and C.J. Liu. 2007. Вирусы папилломы человека при плоскоклеточной карциноме полости рта и предраковых поражениях, обнаруженные с помощью массива генных чипов на основе ПЦР. Междунар. J. Оральный Maxillofac. Surg. 36153-158. [PubMed] [Google Scholar] 25. Мензо, С., К. Маринелли, П.Баньярелли, С. Ролла и М. Клементи. 2007. Папилломавирусные инфекции человека: новые перспективы профилактики и лечения. Новый микробиол. 30189-212. [PubMed] [Google Scholar] 26. Муньос Н., Ф. К. Бош, Х. Кастельсаге, М. Диас, С. де Санхосе, Д. Хаммуда, К. В. Шах и К. Дж. Мейер. 2004. Против каких типов вируса папилломы человека мы должны проводить вакцинацию и скрининг? Международная перспектива. Междунар. Дж. Рак 111278-285. [PubMed] [Google Scholar] 27. Nuovo, G.J., D. Bartholomew, W.W. Jung, I.K.Хан, Т. Ум, Д. Ф. Грабарц, Д. Дж. Ли и Р. Т. Маккейб. 2008. Корреляция мазка Папаниколау, биопсии шейки матки и клинического наблюдения с помощью системы микроматриц для типирования ВПЧ. Диагн. Мол. Патол. 17107-111. [PubMed] [Google Scholar] 28. Пак, TC, CJ Kim, YM Koh, KH Lee, JH Yoon, JH Kim, SE Namkoong и JS Park. 2004. Генотипирование вируса папилломы человека с помощью ДНК-чипа при неоплазии шейки матки. ДНК-клеточная биол. 23119-125. [PubMed] [Google Scholar] 29. Перронс, К., Р. Джелли, Б. Клетер, В.Квинт и Н. Бринк. 2005. Выявление персистирующих папилломавирусных инфекций человека высокого риска с помощью гибридного захвата II и SPF10/LiPA. Дж. Клин. Вирол. 32278-285. [PubMed] [Google Scholar] 30. Qu, W., G. Jiang, Y. Cruz, CJ Chang, G.Y. Ho, R.S. Klein, and RD Burk. 1997. Обнаружение вируса папилломы человека с помощью ПЦР: сравнение систем праймеров MY09/MY11 и GP5+/GP6+. Дж. Клин. микробиол. 351304-1310. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]31. Раджан С., Т. Х. Шен, Дж. Сантанам, Н. Х. Отман, Н.Отман и Т. Т. Хок. 2007. Сравнение ДР. Набор чипов товарного знака HPV с анализом гибридного захвата II для обнаружения вируса папилломы человека в клинических образцах: предварительное исследование. Троп. Биомед. 2417-22. [PubMed] [Google Scholar] 32. Шиффманн М. и Д. Соломон. 2003. На сегодняшний день результаты исследования сортировки ASCUS-LSIL (ALTS). Арка Патол. лаборатория Мед. 127946-949. [PubMed] [Google Scholar] 33. Шиффманн, М., П. Э. Кастл, Дж. Джеронимо, А. К. Родригес и С. Вакхолдер. 2007. Вирус папилломы человека и рак шейки матки.Ланцет 370890-907. [PubMed] [Google Scholar] 34. Смит, Дж. С., Л. Линдси, Б. Хутс, Дж. Киз, С. Франчески, Р. Винер и Г. М. Клиффорд. 2007. Распределение типов вируса папилломы человека при инвазивном раке шейки матки и поражении шейки матки высокой степени: обновление метаанализа. Междунар. Дж. Рак 121621-632. [PubMed] [Google Scholar] 35. Вилла, Л. Л., Р. Л. Коста, К. А. Петта, Р. П. Андраде, Дж. Паавонен, О. Э. Иверсен, С. Э. Олссон, Дж. Хайе, М. Стейнвалл, Г. Риис-Йоханнессен, А. Андерссон-Эльстром, К. Эльфгрен, Г.Krogh, M. Lehtinen, C. Malm, G.M. Tamms, K. Giacoletti, L. Lupinacci, R. Railkar, FJ Taddeo, J. Bryan, M.T. Esser, H.L. Sings, A.J. Saah и E. Barr. 2006. Высокая устойчивая эффективность профилактической четырехвалентной вакцины против вируса папилломы человека типов 6/11/16/18 L1 на основе вирусоподобных частиц в течение 5 лет наблюдения.
  • alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.