Site Loader

Содержание

Выражение векторов в матричном виде. Линейные преобразования и проверка сохранения свойств.

PecbepatT Mo BbICIeii MaTeMaTHKe Ha TeMy: «BpipaxkeHve BeKTOpOB B MaTph5HOM Bufe. JIMHeiiHbIe MpeoOpaz0BaHHA A lpoBepkKa coxpaHeHHA CBOHCTB» BpinomHW CTy JeHT rpyMnbt TIpopepuia: Tamm«ent-2020 Основные понятия. Величины, которые полностью определяются своим численным значением, называются скалярными. Примерами скалярных величин являются: площадь, длина, объём, температура, работа, масса. Другие величины, например сила, скорость, ускорение, определяются не только своим числовым значением, но и направлением. Такие величины называют векторными. Векторная величина геометрически изображается с помощью вектора. Вектор – это направленный прямолинейный отрезок, т.е отрезок, имеющий определенную длину и определенное направление. Если А – начало вектора, а В – его конец, то вектор обозначается символом A⃗B или a⃗. Противоположным вектором −a⃗ вектора a⃗ называется вектор у которого конец совпадает с началом вектора a⃗, а начало с концом вектора a⃗.

Длиной и модулем вектора A⃗B называется длина отрезка и обозначается |⃗AB|. Вектор, длина которого равна нулю, называется нулевым вектором и обозначается 0⃗. Нулевой вектор направления не имеет. Вектор, длина которого равна единице, называется единичным вектором и обозначается через е́. Всякие векторы можно привести к общему началу, т.е. построить векторы, соответственно равные данным и имеющие общее начало. Из определения равенства векторов следует, что любой вектор имеет бесконечно много векторов, равных ему. Линейные операции. 2 Свойства векторов. 1. а⃗+ b⃗= b⃗+a⃗ 2. (а⃗+ b⃗)+ c⃗=а⃗+(b⃗+ c⃗) 3. α (β a⃗ )=(αβ ) а⃗ 4. α ( a⃗+b⃗ )=α а⃗+α b⃗ 5. (α +β ) а⃗=α a⃗+β а⃗ 6. а⃗+ 0⃗= а⃗ 7. а⃗+ (−а⃗ )=0⃗ 8. 1∗а⃗= а⃗ Векторы и матрицы. С упорядоченной последовательностью действительных чисел a1, a2, …, an можно связать понятие связанного вектора в n-мерном пространстве имерном пространстве и обозначить как: a⃗=a=[ a ]=¿ [ a1 ¿ ] [a2 ¿ ] [ . ¿ ] [ . ¿ ]¿ ¿ ¿¿ Таким образом, вектор на самом деле не более чем совокупность чисел, компонент, т.
е. координат, которые расположены в определенном порядке, следовательно вектор можно представить в виде матрицы, ведь матрица – это прямоугольная таблица, содержащая числа в определенном порядке. Для этого даже есть особый вид матриц: матрица-мерном пространстве ивектор, т.е. такая матрица, у которой только один столбец, или только одна строка. Линейные преобразования. Если задан закон, по которому каждому вектору x пространства Rn ставится в соответствие один единственный вектор y пространства Rm, то говорят, что задан оператор(преобразование) ~A (x ), действующий из Rn в Rm, и записывают y= ~ A (x) Оператор(преобразование) называется линейным, если верны следующие свойства: 1. ~A ( x+ y )=~A ( x )+~A ( y ). 2. ~A (kx )=k~A (x). 5 Суммой двух линейных операторов(преобразований) ~A и ~B называется оператор (~A+~B ), определяемый равенством: (~A+~B ) ( x )=~A ( x )+~B (x). Произведением линейного оператора ~A на k называется оператор k~A, определяемый равенством: (k~A) ( x )=k (~A ( x )).
Произведением линейных операторов ~A и ~B называется оператор ~A~B, определяемый равенством: (~A~B ) ( x )=(~A (~B ( x ) )). Нулевой оператор ~O переводит все векторы пространства Rn в нулевые векторы ~O ( x )=0. Тождественный оператор ~E переводит все векторы пространства Rn в самих себя. Матрицы A и A¿ линейного оператора ~A в базисах e1 ,e2 ,…,en и e1 ¿ ,e2 ¿ , …,en ¿ связаны соотношением: A¿=C−1 AC, где C−1 – матрица перехода. Примеры линейных преобразований: На самом деле линейное преобразование не более чем функция, которая один вектор, превращает в другой. И как правило, преобразования представляют из себя что-мерном пространстве ито на вроде: Ax=b, где b – это новый вектор, полученный путем преобразования вектора x, это достигается за счет умножения вектора x на матрицу перехода A. Примеры преобразований: 1. Растяжение вектора x, на какую-мерном пространстве ито величину c: A=(c 00 c) 2. Вращение вектора вокруг начала координат: A=(0 −11 0 ) 3. Отражение вектора: A=(0 11 0) 4. Проекция вектора: A=(1 00 0) Линейными преобразованиями называются такие, которые удовлетворяют следующим свойствам: 1.
Начало координат не изменяется 2. Если вектор x становится вектором x’, тогда вектор 2x становится 2x’, т.е. вектор cx переходит в вектор cx’ Если векторы x и y становятся x’ и y’, то и их сумма x + y становится x’ + y’. 6 Список литературы: 1. Высшая математика для экономистов. 3-мерном пространстве ие издание. Н.Ш.Кремер; 2. Конспект лекция по высшей математике. Д.Т. Письменный; 3. Элементы векторной алгебры. Лекция 5. Чая Зоя Сергеевна. 7

НЛП︱ Усовершенствованное выражение вектора слова (2) -FastText (кратко, учебные заметки)

FastText — это быстрый классификатор текста, разработанный Facebook, который предоставляет простые и эффективные методы классификации текста и обучения представлению, но этот проект на самом деле состоит из двух частей, одна часть которой представлена ​​в этой статье.
классификация текста fastText (статья:A. Joulin, E. Grave, P. Bojanowski, T. Mikolov, 

Bag of Tricks for Efficient Text 
Классификация (эффективная методика классификации текста)), 
Другая часть — это изучение встраивания слов (статья:P.  
Bojanowski*, E. Grave*, A. Joulin, T. Mikolov, Enriching Word Vectors 
with Subword 
Information(Используйте информацию подслов для обогащения словарных векторов)).
Согласно документу, только текстовая часть классификации является fastText, но некоторые люди называют эти две части вместе называемыми
fastText. Автор считает, что обучение встраиванию слов принадлежит проекту FastText.
ссылка на github:https://github.com/facebookresearch/fastText

.

Расширенный Word Vector Трилогия:

1、НЛП︱ Усовершенствованное выражение вектора слов (1) -GloVe (теория, связанные результаты оценки, реализация R & python, связанные приложения) 
2、НЛП︱ Усовершенствованное выражение вектора слова (2) -FastText (кратко, учебные заметки) 
3、НЛП︱ Расширенное выражение вектора слова (3) -WordRank (кратко) 
4. Другая бумага для представления слов НЛП:От символьного к распределенному представлению различных методов представления в НЛП


Содержание этого раздела от:
1.

Китайское сообщество с открытым исходным кодом [http://www.oschina.net] «Быстрый открытый текстовый классификатор Facebook FastTexT» 
2. Статья Лэй Фэна: «На несколько порядков быстрее, чем глубокое изучение, подробное объяснение последнего инструмента с открытым исходным кодом Facebook — fastText》

.

1. Принцип архитектуры быстрого текста

Метод fastText состоит из трех частей: архитектура модели, иерархические функции Softmax и N-грамма.

Модель fastText вводит последовательность слов (фрагмент текста или предложение) и выводит вероятность того, что последовательность слов относится к разным категориям.
Слова и фразы в последовательности образуют вектор объектов, вектор объектов отображается на средний уровень с помощью линейного преобразования, а средний уровень — на метку.

fastText использует нелинейную функцию активации при прогнозировании меток, но не использует нелинейную функцию активации на среднем уровне.
Архитектура модели fastText очень похожа на модель CBOW в Word2Vec. Разница в том, что fastText предсказывает метки, а модель CBOW — средние слова.

 

.

2. Повышение эффективности вычислений на уровне softmax

Для наборов данных с большим количеством категорий fastText использует иерархический классификатор (вместо плоской архитектуры). Различные категории интегрированы в древовидную структуру (представьте двоичное дерево вместо списка). В некоторых задачах классификации текста есть много категорий, и сложность вычисления линейного классификатора высока. Для улучшения времени выполнения модель fastText использует иерархические методы Softmax. Иерархические методы Softmax основаны на кодировании Хаффмана, которое кодирует теги, что может значительно уменьшить количество целей прогнозирования модели. (СсылкаБлог) 

Учитывая линейные и логарифмические модели нескольких категорий, это значительно уменьшает сложность обучения и время для тестирования классификатора текста. fastText также использует тот факт, что классы не сбалансированы (некоторые классы появляются чаще, чем другие), и использует алгоритм Хаффмана для построения древовидной структуры, которая представляет классы. Поэтому глубина древовидной структуры, в которой часто появляются категории, меньше глубины древовидной структуры, в которой категории не появляются часто, что также делает дальнейшие вычисления более эффективными.

 


.


1. N-граммовые особенности FastText

Обычно используемая особенность — модель сумки слов. Но модель мешка слов не может учитывать порядок между словами, поэтому fastText также добавляет функции N-граммы.
В предложении «Я люблю ее» характерны слова «сумка»: «Я», «Любовь», «Она». Эти характеристики такие же, как и в предложении «Она любит меня».

Если вы добавите 2-Ngram, то в первом предложении также есть «я люблю» и «люблю ее», эти два предложения «я люблю ее» и «она любит меня» «Вы можете заметить разницу. Конечно, чтобы повысить эффективность, нам нужно отфильтровать низкочастотные N-граммы.

В fastText низкоразмерный вектор связан с каждым словом. Скрытые представления являются общими для всех классификаторов в разных категориях, так что текстовая информация может использоваться вместе в разных категориях. Этот тип представления называется сумкой слов (порядок слов здесь игнорируется). Векторы также используются в fastText для представления слова n-грамма для учета локального порядка слов, что очень важно для многих задач классификации текста.

Например: fastText может узнать, что «мальчик», «девочка», «мужчина» и «женщина» относятся к определенным полам, и может сохранить эти значения в связанных документах. Затем, когда программа делает запрос пользователя (при условии, что «Моя девушка сейчас?»), Она может немедленно выполнить поиск по документам, созданным fastText, и понять, что пользователь хочет задать вопросы о женщинах.

.

2. Преимущества векторов слова FastText

(1) Подходит для больших данных + эффективная скорость обучения: возможность обучать модель «обработка более 1 миллиарда слов за 10 минут при использовании стандартного многоядерного процессора», особенно по сравнению с глубокой моделью, fastText может сократить время обучения на несколько дней Уменьшено до нескольких секунд. Используя стандартный многоядерный процессор, я получил результат обучения модели с более чем 1 миллиардом словарного запаса за 10 минут. Кроме того, fastText может разделить 500 000 предложений на более чем 300 000 категорий за пять минут.
(2) Поддержка многоязычных выражений: используя свою морфологическую структуру, fastText может быть разработан для поддержки нескольких языков, включая английский, немецкий, испанский, французский и чешский. Он также использует простой и эффективный способ включения информации подслов. Этот метод работает очень хорошо, когда используется на лексическом языке, таком как чешский, что также доказывает тщательно разработанные n-граммовые характеристики. Это важный источник богатого словарного представительства. Производительность FastText значительно выше, чем у популярного инструмента word2vec, а также лучше, чем у других наиболее продвинутых в настоящее время представлений морфологического словаря.

(3) fastText фокусируется на классификации текста и достигает наилучшей производительности по многим стандартным вопросам (таким как анализ тенденций текста или прогнозирование меток). Сравнение между FastText и Char-CNN и VDCNN на основе методов глубокого обучения:

(4) Рассматривается больше сходства, чем word2vec. Например, при изучении встраивания слов fastText может учитываться, что у англичан и англичан одинаковый суффикс, а у word2vec нет (конкретная ссылкаpaper)。 

.

3. Сравнение между вектором слова FastText и word2vec

Этот раздел взят из блога:fasttext 
FastText = гибкое использование cbow + h-softmax в word2vec

Гибкость отражается в двух аспектах:
1. Выходной уровень модели: выходной уровень word2vec, который соответствует каждому члену, и вероятность вычисления определенного члена является наибольшим, а выходной уровень быстрого текста соответствует категоризованной метке. Однако, независимо от того, что соответствует выходному слою, соответствующий вектор не будет сохранен и использован;
2. Входной уровень модели: выходной уровень word2vec является термином в контекстном окне, а содержимое всего предложения, соответствующего фастексту, включая термин, также включает в себя содержимое n-граммы;

Существенное различие между ними отражается в использовании h-softmax.
Цель Wordvec — получить слово vector. Наконец, векторное слово получается во входном слое, а h-softmax, соответствующий выходному слою, также будет генерировать серию векторов, но в конечном итоге все они отбрасываются. Будем использовать.
Быстрый код полностью использует функцию классификации h-softmax, обходит все конечные узлы дерева классификации и находит метку с наибольшей вероятностью (один или N).

Статьи по теме:Jupyter notebooks:Comparison of FastText and Word2Vec 


.


ссылка на github:https://github.com/facebookresearch/fastText 
fastText построен на системах Mac OS или Linux и использует функции C ++ 11. Нужна поддержка Python 2.6 или выше, поддержка numpy & scipy и другого программного обеспечения.
Параметры FastText по умолчанию:

$ ./fasttext supervised
Empty input or output path.

The following arguments are mandatory:
  -input              training file path
  -output             output file path

The following arguments are optional:
  -lr                 learning rate [0. 1]
  -lrUpdateRate       change the rate of updates for the learning rate [100]
  -dim                size of word vectors [100]
  -ws                 size of the context window [5]
  -epoch              number of epochs [5]
  -minCount           minimal number of word occurences [1]
  -minCountLabel      minimal number of label occurences [0]
  -neg                number of negatives sampled [5]
  -wordNgrams         max length of word ngram [1]
  -loss               loss function {ns, hs, softmax} [ns]
  -bucket             number of buckets [2000000]
  -minn               min length of char ngram [0]
  -maxn               max length of char ngram [0]
  -thread             number of threads [12]
  -t                  sampling threshold [0.0001]
  -label              labels prefix [__label__]
  -verbose            verbosity level [2]
  -pretrainedVectors  pretrained word vectors for supervised learning []
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 7
  • 8
  • 9
  • 10
  • 11
  • 12
  • 13
  • 14
  • 15
  • 16
  • 17
  • 18
  • 19
  • 20
  • 21
  • 22
  • 23
  • 24
  • 25
  • 26

Миколов сообщил о двух экспериментах в статье fastTetxt, один из которых сравнивался с моделью Tagspace. Эксперимент проводился на наборе данных YFCC100M, который содержит почти 100 миллионов изображений, а также рефераты, заголовки и теги. В эксперименте используются тезисы и заголовки для прогнозирования меток. Модель Tagspace основана на модели Wsabie. В дополнение к использованию CNN для извлечения функций, модель Wsabie также предлагает функцию потерь с взвешенным приблизительным ранговым попарно (WARP) для работы с огромным количеством целей прогнозирования.
 
Выше приведены экспериментальные результаты. Из экспериментальных результатов fastText может достичь лучших результатов, чем Tagspace, и имеет непревзойденную скорость тренировочного теста. Но, строго говоря, этот эксперимент несколько несправедлив по отношению к Tagspace. Набор данных YFCC100M относится к классификации по нескольким меткам, которая требует от модели прогнозирования нескольких классов из нескольких классов. Tagspace выполняет классификацию по нескольким тегам, но fastText может выполнять классификацию только по нескольким категориям, предсказывая класс из нескольких категорий. Индекс оценки prec @ 1 оценивает только один результат прогнозирования, который может просто оценить классификацию по нескольким категориям.

Данные YFCC100M:https://research.facebook.com/research/fasttext/


 

Публичная учетная запись «Quality Cloud Notes» регулярно обновляет содержимое блога:

 

 


.

Расширение 1: Тяжелый вес: Facebook выпустил предварительно обученные векторы слов на 90 языках

https://github.com/facebookresearch/fastText/blob/master/pretrained-vectors.md 
Ужасный Facebook, обученный быстрому тексту, используя параметры по умолчанию, 300 измерений

Заявление об авторском праве: Эта статья является оригинальной статьей блоггера. Пожалуйста, укажите источник «Quality Cloud Blog» для перепечатки, спасибо за сотрудничество! ! Публичный аккаунт WeChat: Quality Cloud Notes https://blog.csdn.net/sinat_26917383/article/details/54850933

Милая сова выражение векторов eps

Милая сова выражение векторов eps

ключевые слова

  • восхитительный
  • сердитый
  • животное
  • сарай
  • Сипуха
  • птица
  • бухо
  • мультфильм
  • персонаж
  • красочный
  • Coruja
  • милый
  • выражение
  • глаз
  • лицо
  • пух Перо
  • летающий
  • весело
  • забавный
  • мех
  • счастливый
  • изолированные
  • природа
  • сова
  • грустный
  • спать
  • дикий
  • дикая природа
  • крылья
  • eps
  • Милая
  • векторов

DMCA Contact Us

бесплатная загрузка ( eps, 1. 23MB )

Связанная векторная графика

  • Коллекция милый мультфильм совы svg eps
  • Любители мультфильм сова милый вектор eps
  • Любители мультфильмов сова милый вектор eps
  • забавные выражения eps
  • Иллюстрация различных выражений eps
  • Милый мультфильм сова векторов дизайн eps
  • Милый мультфильм сова векторов дизайн eps
  • Выражение милой девушки eps
  • Набор выражений глаз и ртов
  • Милый мультфильм сова векторов дизайн eps
  • Выражение монстра eps svg
  • Сова этнический узор вектор eps
  • Выражение счастливого лица со слезами eps
  • Сова Раскраска для Взрослых eps svg ai
  • Коллекция выражения лица eps
  • Фон совы Hispter eps
  • Выражения лица eps
  • Милая сова девушка мультфильм векторов eps
  • Милая сова девушка мультфильм векторов eps
  • Милая сова девушка мультфильм векторов eps
  • Выражения молодых людей с разными лицами eps
  • Симпатичное мультяшное выражение груши — векторный материал eps
  • Выражение классической иконы eps
  • Милое животное eps
  • Сова дизайн вектор eps
  • Человек с разными выражениями лица eps
  • Выражение мультфильм овощи — векторный материал eps
  • Детство рисования милая девушка качели совы иконы ai eps
  • Милый мультфильм панда вектор ai
  • Милая сова девушка мультфильм векторов eps
  • Вектор выражения фруктов мультфильм eps
  • Набор милых крыльев ангела ai eps svg
  • Милые животные зоопарка eps
  • Набор наклеек с разными выражениями лица eps
  • Мультфильм милые единороги векторов дизайн eps
  • Милый мультяшный медведь eps
  • Восемь выражений лица человека eps
  • Вектор коллекции выражение плоский рот eps svg
  • Женщина сталкивается с разными выражениями eps
  • Геометрическая сова дизайн фона eps
  • Милые животные мультфильм eps
  • Милые цветы, машина eps
  • Милый мультфильм рисованной рамка вектор ai
  • Руки drawn смешные выражения векторные иконки eps ai
Загрузи больше
  • Contact Us

типов и характеристик – StudiousGuy

Введение

Векторы экспрессии представляют собой векторы, которые действуют как носители ДНК-вставки, а также позволяют эффективно экспрессировать ДНК-вставку. Это могут быть плазмиды или вирусы. Векторы экспрессии также известны как конструкции экспрессии.

 

Векторы экспрессии генетически сконструированы для введения генов в клетки-мишени. В дополнение к интересующему гену эти конструкции экспрессии также содержат регуляторные элементы, такие как энхансеры и промоторы, так что происходит эффективная транскрипция интересующего гена.

Простейшие конструкции экспрессии также известны как векторы транскрипции; только потому, что они допускают транскрипцию клонированного чужеродного гена, а не его трансляцию. Векторы, которые облегчают как транскрипцию, так и трансляцию клонированного чужеродного гена, известны как векторы экспрессии белка. Эти конструкции для экспрессии белка также приводят к продукции рекомбинантного белка.

Теперь для транскрипции и трансляции необходимы промотор и терминирующая последовательность.Транскрипция начинается на промоторе и заканчивается на сайте терминации. Промоторы векторов экспрессии должны иметь переключатели включения/выключения. Эти переключатели помогают регулировать производство генного продукта. Избыточное количество продукта интересующего гена может быть токсичным для клетки. Обычный промотор, используемый в конструкциях для экспрессии, представляет собой мутантную версию промотора lac, lacUV. Промотор lacUV инициирует высокий уровень транскрипции в индуцированных условиях. Кроме того, в некоторых векторах экспрессии сайт связывания рибосомы находится выше стартового кодона.Сайт связывания рибосом способствует эффективной трансляции клонированного чужеродного гена.

Векторы экспрессии широко используются в молекулярной биологии; в таких методах, как сайт-направленный мутагенез.

Как работают векторы выражения?
  • Как только экспрессионная конструкция оказывается внутри клетки-хозяина, белок, кодируемый интересующим геном, продуцируется путем транскрипции. После этого он использует механизм трансляции и рибосомные комплексы организма-хозяина.
  • Часто плазмида создается с помощью генной инженерии, чтобы содержать регуляторные элементы, такие как энхансеры и промоторы. Эти регуляторные последовательности способствуют эффективной транскрипции интересующего гена.
  • Векторы экспрессии широко используются в качестве инструментов, которые помогают в производстве мРНК и, в свою очередь, стабильных белков. Они представляют большой интерес в биотехнологии и молекулярной биологии для производства белков, таких как инсулин. Инсулин является главным ингредиентом в лечении сложного заболевания диабета.
  • После экспрессии белковый продукт подлежит очистке. Очистка белка представляет собой проблему, поскольку интересующий белок, ген которого находится в векторе экспрессии, должен быть очищен независимо от белков организма-хозяина. Чтобы упростить процесс очистки, интересующий ген, содержащийся в векторе экспрессии, всегда должен иметь «метку». Такой меткой может быть любой маркерный пептид или гистидин (метка His).
  • Экспрессионные векторы широко используются в таких методах, как сайт-направленный мутагенез.Клонирующие векторы вводят интересующий ген в плазмиду, которая, в свою очередь, реплицируется в бактериях. Эти клонирующие векторы не обязательно должны приводить к экспрессии белка.

Таким образом, векторы экспрессии должны иметь следующие сигналы экспрессии:

  • Сильный промоутер,
  • Сильный терминирующий кодон,
  • Регулировка расстояния между промотором и клонированным геном,
  • Встроенная последовательность терминации транскрипции и
  • Переносимая последовательность инициации трансляции.
Промоутер
  • Промотор обеспечивает надежную транскрипцию интересующего гена. Кроме того, сильные промоторы также необходимы для эффективного синтеза мРНК с помощью РНК-полимеразы.
  • Регулирование промотора является еще одним важным аспектом, который всегда следует учитывать при конструировании вектора экспрессии.
  • Самые сильные промоторы обнаружены у бактериофагов Т5 и Т7.

В E. coli промотор регулируется двумя способами:

Индукция: добавление химических переключателей транскрипции гена.

Репрессия: добавление химического вещества отключает транскрипцию гена.

Наиболее часто используемые промоторы в системе экспрессии E. coli :

1. лаковый промотор:

  • Регулирует транскрипцию гена lac Z. Ген lac Z отвечает за продукцию β-галактозидазы.
  • Ген lac Z может быть индуцирован IPTG, изопропилтиогалактозидазой.
  • Последовательности промотора lac могут быть слиты с геном-мишенью. Тогда это приведет к лактозозависимой экспрессии гена-мишени.
  • Тем не менее, lac-промотор имеет свои недостатки. Он довольно слаб и не может быть использован для получения высоких уровней желаемого белка. Кроме того, гены lac осуществляют базальный уровень транскрипции даже в отсутствие индукции (молекулы-индуктора).

2. промоутер trp:

  • Он отвечает за регуляцию кластера генов, участвующих в биосинтезе триптофана.
  • Триптофан действует как молекула-репрессор и индуцируется 3-β-индолакриловой кислотой.

3. Промоутер tac:

  • Образуется путем гибридизации промотора lac и trp. Однако он сильнее любого из них.
  • Промотор tac индуцируется изопропилтиогалактозидазой IPTG.

4. λP L :

  • Является сильным промотором и отвечает за транскрипцию λДНК в E. coli
  • Продукт гена λcI действует как его репрессор.Он называется λ-репрессором.
  • Экспрессионная конструкция с промотором λP L используется в сочетании с мутантным хозяином E. coli . Он отвечает за производство чувствительной к температуре формы λ-репрессора.
  • При низких температурах белок-репрессор репрессирует транскрипцию, тогда как транскрипция клонированного гена происходит при высоких температурах; потому что репрессор инактивируется при высокой температуре.
  • Для экспрессии белков в клетках млекопитающих промотор должен быть расположен выше клонированной кДНК для ее эффективной транскрипции.
  • В большинстве случаев вирусные промоторы используются только потому, что они надежны для сильной конститутивной экспрессии.
  • Широко используемыми промоторами являются промотор CMV (полученный из цитомегаловируса) и промотор SV40 (полученный из обезьяньего вируса 40).

Промоторы в коммерчески доступных векторах экспрессии дрожжей могут быть конститутивно активными или индуцируемыми.

Конститутивный промоутер

Конститутивный промотор представляет собой тип промотора, который не регулируется и обеспечивает непрерывную транскрипцию связанного с ним гена.

Пример конститутивного промотора: GAP-промотор гена, кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу.

Индуцибельный промотор

Индуцибельный промотор — это промотор, который работает регулируемым образом, и экспрессия связанных с ним генов может включаться или выключаться на определенной стадии развития или в определенный момент времени.

Примеры индуцируемых промоторов: AOX1, GAL1, GAL10, nmt1, nmt42 и nmt81.

Промотор AOX1 гена, кодирующего алкогольоксидазу.Он индуцируется метанолом и лучше всего подходит для экспрессии белка в Pichia pastoris.

Другими примерами являются промоторы GAL1 и GAL10 . Они индуцируются галактозой и подходят для экспрессии белка в Saccharomyces cerevisiae.

Промоторы nmt1, nmt42, и nmt81 , которые индуцируются тиамином для экспрессии белка в Schizosaccharomyces pombe.

Репортер Джин
  • Репортерный ген отвечает за продукцию белка, который можно обнаружить и количественно определить с помощью простого анализа.
  • Они служат инструментом для измерения эффективности экспрессии генов, а также для определения внутриклеточной локализации белка.
  • Скорость экспрессии структурного гена зависит от регуляторных последовательностей, расположенных перед ним.
  • Скорость экспрессии гена можно измерить путем замены его части, кодирующей белок. Кроме того, его можно слить с другим геном, экспрессирующим другой белок. Присутствие этого другого белка можно легко определить.
  • Репортерные гены полезны для идентификации промоторов, энхансеров и других белков или регуляторных элементов, которые с ними связываются.

Наиболее часто используемые репортерные гены:

1. ген lac Z E. coli

  • Действует как репортер в присутствии X-gal.
  • Его уровни легко определить по интенсивности производимого цвета. Интенсивность синего цвета определяется количественно.

2.CAT (хлорамфеникол-ацетилтрансфераза), кодирующий ген E. coli

  • Ген CAT кодирует хлорамфеникол-ацетилтрансферазу.
  • Фермент трансфераза отвечает за перенос ацетильных групп от ацетил-КоА к реципиентному антибиотику, хлорамфениколу

3. Люцифераза, кодирующая ген светлячка, Photinus pyralis

  • Люцифераза отвечает за окисление люциферина.
  • Окисление люциферина приводит к излучению желто-зеленого света.Излучение света легко обнаруживается независимо от низких уровней.

4. Зеленый флуоресцентный белок (GFP), кодирующий ген медузы, Aequorea victoria

  • GFP был обнаружен Симомура.
  • Это аутофлуоресцентный белок с 238 аминокислотными остатками, вырабатываемый биолюминесцентной медузой Aequorea victoria.
  • В GFP β-ствол образован одиннадцатью β-тяжами. Через центр проходит α-спираль. Хромофор расположен в середине ствола.Аминокислотные остатки с 65 по 67 с последовательностью Ser-Tyr-Gly образуют хромофор, п-гидроксибензилиденимидазолинон, который флуоресцирует. Хромофор флуоресцирует с максимальной длиной волны 508 нм (зеленый свет) при облучении УФ или синим светом (400 нм).
  • GFP служит инструментом для определения локализации белка.
  • Он служит меткой, с помощью которой он сливается с белком, экспрессию которого необходимо контролировать. В основном исследуется субклеточная локализация белка.
  • Методы генной инженерии помогают в производстве векторов, содержащих кодирующую последовательность неопознанного белка X, клонированную в кодирующую последовательность GFP.
  • Этот продукт слияния GFP-X теперь можно трансфецировать в клетки-мишени, а экспрессию, а также субклеточное расположение белка X можно легко отслеживать и обнаруживать.

Сайт связывания рибосомы и сайт инициации трансляции
  • Сайт связывания рибосом (RBS) следует за промотором.Он отвечает за эффективную трансляцию клонированного гена.
  • Сайт инициации трансляции у прокариот известен как последовательность Шайна Далгарно. Эта последовательность включена только в RBS.
  • Консенсусная последовательность сайта инициации трансляции включает набор из 8 пар оснований, расположенных выше стартового кодона AUG.
  • Трансляция у эукариот инициируется определенной последовательностью, называемой последовательностью Козака.
  • На этом сайте собран рибосомный аппарат для трансляции мРНК.
Полилинкеры
  • Каждый вектор содержит определенные сайты распознавания для ферментов рестрикции. Именно по сайту рестрикции вектор вырезается для клонирования интересующего чужеродного гена.
  • Эти сайты часто располагаются близко друг к другу и поэтому называются полилинкерами или сайтами множественного клонирования (MCS).
  • Эти области имеют длину от 50 до 100 пар оснований и могут иметь кластер до 25 сайтов рестрикции.
Поли-А (полиаденилирование) Хвост
  • Поли-А-хвост, присутствующий на конце сформированной мРНК, защищает мРНК от деградации экзонуклеазами или эндонуклеазами.
  • Чрезвычайно важно для стабильности мРНК.
  • Он также отвечает за терминацию транскрипции и трансляции и стабилизирует продукцию мРНК.
  • Комплекс нуклеолитических ферментов и поли-А-полимераза являются предпосылками для добавления поли-А-хвоста на конце мРНК.
Система экспрессии

Для производства белка требуется система экспрессии. Существует два типа систем экспрессии: прокариотическая и эукариотическая системы экспрессии.Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки, которые можно учитывать при построении системы экспрессии. Однако такой системы экспрессии, которую можно было бы считать универсальной для продукции гетерологичных белков, не существует.

Прокариотическая система экспрессии
  • Специфичность промотора РНК-полимеразы в случае прокариот опосредуется сигма-фактором.
  • E. coli — широко используемая прокариотическая система экспрессии.
  • Он экспрессирует высокий уровень белка.
  • Штаммы E. coli подвергаются генетическим манипуляциям для производства рекомбинантного белка, чтобы сделать их безопасными для крупномасштабных экспериментов и ферментации.
  • Очистка белка стала проще, поскольку рекомбинантные слитые белки могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии, например, глутатион-S-трансфераза и слитые белки, связывающие мальтозу.

Несмотря на достигнутые успехи и усовершенствования, в прокариотической системе экспрессии , все еще существует множество трудностей и проблем, связанных с продукцией белка из клонированных чужеродных генов.Эти виды испытаний можно сгруппировать в 2 категории:

1. Проблемы из-за характера последовательности чужеродного гена

  • Наличие интронов в чужих генах,
  • Наличие сигналов завершения и
  • Гены как в прокариотических, так и в эукариотических системах экспрессии соблюдают определенное использование синонимичных кодонов. Это называется смещением кодонов. Поскольку кодоны вырождены, существует смещение для двух или более кодонов.В некоторых случаях разные гены предпочитают только определенные кодоны. Эти специфические кодоны часто используются независимо от количества рассматриваемого белка, например, CCG является широко распространенным кодоном для пролина. Гены с высоким уровнем экспрессии демонстрируют смещение кодонов в сторону определенных кодонов по сравнению с генами, которые экспрессируются на низких уровнях. Частота использования синонимичных кодонов отражает степень распространенности соответствующих им тРНК.
  • Все эти наблюдения подводят нас к выводу, что гены с кодонами, которые почти не используются E.coli  может быть неэффективно экспрессирована в E. coli.

2. Проблемы, вызванные прокариотическим хозяином, E. coli

  • Обработка белков представляет одну проблему. Прокариоты осуществляют посттрансляционные модификации своих белков несколько иначе, чем эукариоты. Это, в свою очередь, может повлиять на стабильность, активность и реакцию белка на антибиотики.
  • Сворачивание белков представляет собой еще одну проблему.Белковые продукты эукариотических чужеродных клонированных генов могут неправильно складываться в прокариотической системе экспрессии. Это может привести к образованию нерастворимых агрегатов, также известных как тельца включения, которые не восстанавливаются как функциональные белки. Чужеродные белки могут укладываться неправильно либо из-за обнажения гидрофобных остатков, которые обычно присутствуют внутри ядра белка, либо из-за отсутствия взаимодействий, происходящих в нормальных условиях, или из-за неподходящих посттрансляционных модификаций.
Эукариотическая система экспрессии
  • Проблемы, возникающие при клонировании генов в прокариотической системе экспрессии, можно преодолеть с помощью эукариотической системы экспрессии.
  • Эукариотические системы экспрессии включают дрожжи, клетки млекопитающих и бакуловирусные клетки (насекомые).

Преимущества использования эукариотической системы экспрессии:

  • Белковый продукт клонированного гена экспрессируется на высоком уровне.
  • Белки можно легко очистить с помощью определенных меток, включенных в сам вектор, таких как His, Myc и т. д.

К недостаткам эукариотической системы экспрессии относятся:

  • Эукариотические клетки растут медленнее, чем прокариотические клетки.
Белки слияния
  • Белки, экспрессируемые векторами экспрессии, могут быть экспрессированы как нативные полипептиды или слитые белки.
  • Белки слияния
  • облегчают очистку и анализ белка.
  • Слитые белки, также называемые химерными или гибридными белками, представляют собой конечный продукт кодирующей последовательности различных генов, которые клонируются вместе и после трансляции дают единую полипептидную последовательность.
  • Они защищают интересующий ген от протеаз, присутствующих в клетке-хозяине.
  • Клонированные генные белки устойчивы к деградации, когда они присутствуют в комбинации со слитым белком. Когда эти белки экспрессируются как отдельные объекты, они уязвимы для деградации и подвергаются протеолизу.
  • Система слитых векторов имеет целевой ген, встроенный в кодирующую последовательность клонированного гена-хозяина.
  • На уровне ДНК слитые белки конструируются путем лигирования кодирующих последовательностей разных генов.Для этого знание нуклеотидной последовательности кодирующих генов или сегментов является предпосылкой для гарантии того, что лигирование дает правильную рамку считывания.

Выбор правильного вектора экспрессии

Векторы экспрессии представляют собой плазмиды, используемые для экспрессии интересующего гена в клетке-хозяине. Выбор правильного вектора экспрессии является ключом к успеху исследований и проектов по разработке биотехнологических продуктов.

Векторы экспрессии

используются для точного контроля экспрессии рекомбинантного белка, используемого в приложениях для производства белка. Их также можно использовать в фундаментальных исследованиях для изучения функции экспрессируемого белка. Они позволяют ввести кодирующую последовательность интересующего белка в клетку-хозяина, где может экспрессироваться ген.

Существует две категории векторов экспрессии. Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК, с которыми легко работать, поскольку они могут размножаться в бактериальных клетках. Вирусные векторы — это вирусы, созданные для «заражения» клетки-хозяина интересующим геном.

В этой статье основное внимание будет уделено плазмидам как векторам экспрессии.В нем обсуждается, как выбрать правильный вектор экспрессии для различных приложений.

Заявки на экспрессионные векторы

Векторы экспрессии

можно использовать в двух широких категориях приложений: производство рекомбинантных белков, извлеченных из хозяев экспрессии, и генная инженерия хозяев экспрессии.

Производство рекомбинантных белков

Несинтетические фармацевтические препараты и лекарства часто получают из живых организмов. Эти продукты, обычно пептиды и ферменты, иногда могут быть получены и очищены непосредственно из организма, который был генетически модифицирован для производства белка.

Инсулин, вероятно, является самым известным примером биологического препарата. Первоначально инсулин извлекали из поджелудочной железы свиней и коров. Однако такой подход привел к ограничению запасов и вызвал некоторые опасения по поводу биологической безопасности, поскольку продукты животного происхождения могут быть заражены вирусами.

Производство рекомбинантного инсулина компанией Genentech в конце 70-х годов часто рассматривается как прорывная инновация, положившая начало биотехнологической революции. Пятьдесят лет спустя наличие зрелых векторов экспрессии позволяет ученым-любителям создавать дрожжи для производства инсулина для собственного использования.

Рекомбинантные белки также используются для разработки диагностики. Например, до недавнего времени единственным источником важного компонента теста на токсин, LAL, был сбор голубой крови мечехвоста. Вместо добычи диких животных, таких как мечехвосты, исследователи добавили ген крабовой LAL в вектор экспрессии. Вектор позволяет бактериям производить ЛАЛ, не ловя крабов и не собирая фермент из их крови.

Помимо биомедицинских приложений, новые биотехнологические стартапы используют векторы экспрессии для производства новых материалов и более экологичных продуктов питания.

Генетически модифицированные организмы

        В других случаях векторы экспрессии используются для экспрессии рекомбинантного белка с целью модификации хозяина экспрессии.

В ходе фундаментальных исследований ученые могут изучить, как ген влияет на клеточную линию, контролируя его экспрессию с помощью вектора экспрессии. Например, многие болезни связаны с генной мутацией. Чтобы изучить болезнь, исследователи могут использовать вектор экспрессии, чтобы поместить мутированную версию гена в клетки и изучить ее влияние.В других случаях векторы экспрессии можно использовать для создания трансгенных мышей, которые были созданы для понимания функции гена.

        Люди модифицировали генетику посредством селекции в сельском хозяйстве с самого начала цивилизации. В прошлом веке технология экспрессионных векторов значительно ускорила развитие этой области. Векторы экспрессии позволяют исследователям быстро переносить определенные последовательности генов, которые, например, повышают устойчивость к засухе, обеспечивают устойчивость к вредителям или позволяют использовать более эффективные методы ведения сельского хозяйства.

В области биомедицины векторы экспрессии используются в приложениях генной терапии, целью которых является предоставление пациентам функциональной версии гена. Их также можно использовать в клеточной терапии, при которой клетки пациента генетически модифицируются для борьбы с таким заболеванием, как рак. Для этого пациент получает последовательность терапевтического гена через вектор экспрессии, где затем клетки пациента экспрессируют и используют этот ген.

Хост экспрессии

Каждый вектор экспрессии работает в конкретном организме-хозяине или в семье близкородственных хозяев. Это связано с тем, что векторы экспрессии используют для экспрессии клеточный механизм хозяина. Важно отметить, что ферменты, контролирующие экспрессию генов, у разных типов организмов распознают разные последовательности ДНК. Таким образом, вектор будет экспрессировать ген только в том случае, если присутствуют эти конкретные последовательности.

Выбор хозяина во многом определяется применением вектора экспрессии. Например, для разработки трансгенной культуры потребуется вектор экспрессии, работающий в растениях. Точно так же для производства биологического лекарственного средства в клеточной линии млекопитающих требуется вектор, поддерживающий экспрессию у млекопитающих.Точно так же для производства инсулина в бактериях требуется вектор, поддерживающий бактериальную экспрессию.

Элементы вектора экспрессии

Плазмиды, используемые в качестве векторов экспрессии, обычно собирают и размножают в бактериях Escherichia coli. Они также продуцируются в бактериальных культурах перед инъекцией в клетки-хозяева, где они экспрессируют целевой ген.

Таким образом, векторы экспрессии включают две категории генетических элементов. Некоторые элементы используются для сборки и размножения у E.коли. Другие используются для контроля экспрессии клонированного гена в хозяине экспрессии.

Для репликации бактериальной клеткой плазмидам требуется начальная точка, называемая точкой начала репликации. Общими источниками репликации являются ColE1 и pMB1. Выбор точки начала репликации определяет обилие плазмид в бактериальных клетках. Обычно предпочтительнее начало репликации с высоким числом копий, поскольку оно будет производить больше плазмидной ДНК из бактериальной культуры.

Бактериальные клетки не всегда поглощают плазмиды, а иногда и теряют их. По этой причине плазмиды содержат маркер селекции. Это элемент ДНК, позволяющий отбирать только те клетки, которые интернализовали плазмидную ДНК.

Наиболее распространенными маркерами являются гены устойчивости к антибиотикам. Добавление соответствующего антибиотика к бактериальной культуре гарантирует, что культура будет содержать только клетки, несущие плазмиду.

Как и клонирующие векторы, экспрессионные векторы обычно содержат сайт множественного клонирования, который упрощает вставку интересующего гена с использованием стандартных методов молекулярной биологии.

Элементы, участвующие в контроле экспрессии генов у хозяина, включают промотор, терминатор и различные другие регуляторные элементы.

Промотор, вероятно, является наиболее важным генетическим элементом, участвующим в экспрессии генов. Последовательность гена сама по себе не будет экспрессироваться. Промоторы представляют собой специфические последовательности ДНК, идущие от последовательности генов, которые привлекают ферменты, необходимые для инициации экспрессии генов. Конкретные промоторы могут давать более высокие или более низкие уровни экспрессии генов.

Некоторые промоторы можно активировать путем добавления лекарственного средства, что позволяет жестко контролировать экспрессию генов. Промоторные последовательности не только специфичны для хозяина, но также могут быть специфичными для тканей. Это может быть особенно полезно для контроля экспрессии генов в ГМО. Например, добавление промотора карбоксилазы PEP позволит только экспрессионным клеткам осуществлять фотосинтез.

Терминаторы транскрипции и инсуляторы представляют собой другие генетические элементы, обычно встречающиеся в векторах экспрессии. Векторы экспрессии млекопитающих обычно включают энхансеры, которые отдаленно увеличивают транскрипцию из промоторной области.Интроны и полиА-хвосты также часто встречаются во многих современных векторах млекопитающих.

Получение нужного вектора экспрессии

Существует две основные стратегии получения векторов экспрессии, соответствующих требованиям проекта.

Несколько поставщиков предлагают большие коллекции векторов экспрессии для различных приложений. Пользователи этих продуктов могут клонировать интересующий их ген в этих плазмидах. Некоторые из самых популярных систем экспрессии предоставляются:

Другой подход основан на синтезе генов. Большинство компаний, занимающихся синтезом генов, позволяют пользователям вставлять синтетические гены в векторы, предназначенные для стандартных приложений.

  • Twist Bioscience предлагает примерно дюжину векторов экспрессии млекопитающих, совместимых с большинством требований проекта.
  • Blue Heron предоставляет большую коллекцию векторов экспрессии млекопитающих и бактерий, включая различные белковые метки.

3.4: Векторы экспрессии прокариот — Biology LibreTexts

  1. Последнее обновление
  2. Сохранить как PDF
  1. а-комплементация
  2. Полилинкерная область pUC
    1. Что произойдет с пептидом lacZ’, если мы вставим фрагмент ДНК в область plink?
  3. Векторная система pET (Novagen, Inc. )
    1. Откуда возьмется РНК-полимераза фага Т7?
  4. 0
  5. Векторная система PTRCHIS (Invitrogen, Inc.)
    1. Цель его TAG
    2. Цель сайта расщепления EK
      • 0
      • Expreate Hosts
        • 0

          Первый вектор Мы рассмотрим семью PUC векторов

          Рисунок 3.4.1: вектор pUC

          Хотя он обычно не используется для экспрессии рекомбинантных белков, он содержит все необходимые элементы вектора экспрессии:

          1. Ориджин репликации .Семейство векторов pUC включает высококопийных векторов. Они имеют точку начала репликации ColE1, но делецию регуляторной области репликации rop .
          2. Маркер лекарственной устойчивости . Векторы pUC содержат ген устойчивости к ампициллину (b-лактамаза).
          3. Индуцибельный промотор . Это семейство векторов содержит промотор lac ( P lac ) вместе с ассоциированной областью оператора lac ( O lac )
          4. .

          Эти векторы содержат несколько других элементов, которые добавляют полезности вектору:

          1. Ген lacI .Этот ген кодирует белок-репрессор lac . Будучи высококопийной плазмидой, уровни репрессора lac хозяина могут быть недостаточными для эффективной репрессии оператора lac на плазмидах. Плазмида продуцирует репрессор lac для увеличения уровней хозяина.
          2. Ген lacZ’ . Этот генный продукт транскрибируется с промотора lac и продуцирует амино-концевой фрагмент белка b-галактозидазы.
          3. Полилинкер (сайт множественного клонирования) .Этот короткий участок ДНК расположен сразу после промотора lac и после нескольких первых кодонов гена lacZ’ . Это короткий участок нуклеотидов, который содержит множество сайтов рестрикции эндонуклеаз.

          а-дополнение

          Промотор lac плазмиды pUC можно индуцировать с использованием аналога лактозы изопропилтиол-b-D-галактозида . («ИПТГ»).

          • Это приведет к экспрессии гена lacZ’.
          • Этот ген кодирует амино-концевой фрагмент белка b-галактозидазы
          • Сам по себе этот фрагмент нефункционален (не будет гидролизовать лактозу или другие b-галактозиды)

          Однако интересным белком является b-галактозидаза:

          • Если мы экспрессируем карбоксиконцевой фрагмент белка, он также нефункционален
          • Но если мы объединим оба пептидных фрагмента, они могут объединиться, чтобы получить функциональный белок b-галактозидазы
          • Это называется a-дополнение

          Мутация lacZ DM15 у бактерии означает, что ее геном подвергся делеции амино-концевой области гена lacZ.

          • Такая бактерия имеет нефункциональный белок b-галактозидазы
          • Если этот тип бактерий содержит внехромосомный элемент, который экспрессирует пептид lacZ’ , он может дополнять белок lacZ DM15 с образованием функционального белка b-галактозидазы ( a-комплементация )

          Галактозид, 5-бром-4-хлор-3-индоил-b-D-галактозид («X-gal»), может гидролизоваться b-галактозидазой и дает темно-синий цвет .

          • lacZ Бактерии DM15 в присутствии лактозы (или IPTG) и X-gal приобретают нормальный бело-желтый цвет.
          • Те же бактерии, которые содержат указанную выше плазмиду pUC, будут иметь темно-синий цвет, если в среде присутствуют IPTG и X-gal (из-за α-комплементации и функционального белка b-галактозидазы)

          Полилинкерная область pUC

          Полилинкерная область pUC представляет собой короткий участок ДНК, который фактически встроен в lacZ’ гена, непосредственно ниже стартового кодона:

          Рисунок 3.4.2: pUC Полилинкерная область

          Примечание

          На приведенной выше диаграмме номера кодонов для b-галактозидазы дикого типа выделены пурпурным цветом (в этом случае инициатор метионин отсутствует в очищенном белке, а первый кодон считается остатком АСС (треонина)). Кодоны из полилайнера (которые прерывают ген b-галактозидазы) выделены черным цветом.

          • Различные доступные участки plink имеют длину, кратную 3 нуклеотидам, поэтому ген lacZ’ остается в кадре .
          • Полученный пептид lacZ’ /plink все еще может функционировать при -комплементации.

          Что произойдет с пептидом lacZ’, если мы вставим фрагмент ДНК в область plink?

          • Вставка случайного фрагмента ДНК в область plink приведет к трем возможным различным рамкам считывания после вставки (в зависимости от количества нуклеотидов во вставленном фрагменте)
          • Существует 33% (один к трем) вероятность того, что нижестоящий ген lacZ’ будет транслирован в правильную рамку считывания
          • Существует также вероятность того, что даже если рамка считывания правильная, вставка большого пептида в начале белка lacZ’ предотвратит а-комплементацию.
          • Таким образом, большую часть времени фрагмент ДНК, вставленный в область plink, отменит функцию b-галактозидазы
          • Таким образом,
          • ДНК-вставки в области plink можно идентифицировать путем выращивания бактерий-хозяев на среде, содержащей IPTG и X-gal, и поиска бело-желтых колоний (с оговоркой, что некоторые синие колонии могут на самом деле содержать вставку)

          ДНК, кодирующая интересующий ген, может быть вставлена ​​в область plink внутри рамки с рамкой считывания lacZ’.

          • Белок, кодируемый этим геном, может быть экспрессирован путем индукции с помощью IPTG (т.е. с использованием P lac )
          • Экспрессированный белок будет иметь в качестве своей амино-концевой последовательности первые несколько аминокислот гена b-галактозидазы (при отсутствии каких-либо других манипуляций/мутагенеза). Он также известен как (короткий) слитый белок .
          • Хотя промотор lac считается относительно слабым, плазмида с высоким числом копий может привести к полезному уровню экспрессии интересующего белка

          Векторная система pET (Novagen, Inc.)

          Вектор pET выглядит следующим образом:

          Рисунок 3.4.3: ПЭТ Vector

          Имеет следующие важные элементы:

          • Маркер устойчивости к ампициллину
          • Источник репликации ColE1
          • точка начала репликации f1 (позволяет получать одноцепочечный вектор при коинфицировании хелперным фагом М13)
          • Ген lacI ( белок-репрессор lac )
          • Промотор транскрипции Т7 (специфический для РНК-полимеразы фага Т7)
          • lac операторная область 3′ к промотору T7
          • сайт множественного клонирования (полилинкерная область) ниже промотора Т7

          Вектор pET немного отличается от вектора pUC: pUC использует промотор lac , а pET использует промотор фага T7

          • Промотор фага T7 сильнее, чем промотор lac
          • РНК-полимераза фага Т7 специфически распознает область промотора Т7 и не будет эффективно транскрибироваться с других промоторов
          • Промотор T7 не будет эффективно транскрибироваться E. coli РНК-полимераза

          Откуда возьмется РНК-полимераза фага Т7?

          Система pET включает не только вектор экспрессии, но и генно-инженерных бактерий-хозяев . Бактерией-хозяином для вектора pET обычно является штамм E. coli BL(DE3)

          .
          • Этот штамм интегрировал в свою хромосому ген РНК-полимеразы Т7
          • РНК-полимераза Т7 в геноме хозяина сконструирована таким образом, что она находится под контролем lac промотора и оператора
          • Таким образом, индукция аналогом лактозы, IPTG, заставляет хозяина продуцировать РНК-полимеразу T7
          • Э.coli геном хозяина также несет lacI (репрессор) ген

          Рисунок 3.4.4: Хромосома E.Coli BL(DE3)

          Таким образом, индукция IPTG приводит к:

          • Дерепрессия гена Pol Т7 РНК на хромосоме хозяина с последующей продукцией этой полимеразы
          • Дерепрессия гена-мишени в соответствии с lac O регулированием
          • Транскрипция целевого гена с помощью Т7 РНК Pol

          Таким образом, система сочетает сильный промотор с жесткой регуляцией (т. е. крайне низкий уровень экспрессии в подавленном состоянии)

          Сам вектор pET доступен с несколькими различными последовательностями полилинкера. Они содержат одни и те же сайты рестрикции, но отличаются рамкой считывания , ведущей в область pLink:

          Рисунок 3.4.5: Полилинкерные последовательности

          • Сайт ggatcc (сайт эндонуклеазы рестрикции BamH I) является первым сайтом рестрикции в полилинкере.
          • Таким образом, полилинкерная область доступна в трех различных возможных рамках считывания
          • Таким образом, интересующий ген
          • может быть клонирован в в рамке считывания с транскрибируемой областью ниже промотора Т7. Опять же, как и вектор pUC, экспрессируемый белок будет гибридным белком (с 12-13 аминокислотами на амино-конце полипептида)

          Векторная система pTrcHis (Invitrogen, Inc.)

          Вектор pTrcHis выглядит следующим образом:

          Рисунок 3. 4.6: pTrcHis Vector

          Важными элементами являются:

          • Маркер устойчивости к ампициллину
          • Источник репликации ColE1
          • lacI q ген. Это мутация репрессора lac , которая активируется (продуцирует больше репрессора lac , чем обычно)
          • Промоутер Trc . Это гибрид промоторов lac и trp , который является более сильным промотором по сравнению с промотором lac
          • .
          • Область оператора lac после P trc .Это позволяет регулировать IPTG.
          • Начальный участок из 6 остатков гистидина в аминоконцевой области транслируемого белка, также известный как область « His tag ».
          • Расщепляемая энтерокиназой ( EK ) последовательность распознавания расщепления ( asp asp asp asp lys , с расщеплением после остатка lys )
          • Область полилинкера ниже сайта EK

          Назначение тега His

          • Остатки гистидина могут координироваться с образованием сайта связывания металла (Ni 2+ ) в белке.
          • Участок из шести остатков His образует такой сайт связывания.
          • Белки с His-меткой имеют сродство к металлохелатирующим смолам , и эта характеристика может быть использована для селективной очистки таких белков.

          Назначение сайта расщепления ЕК

          • Хотя His-метка может обеспечить быструю и селективную очистку клонированного белка, присутствие этих остатков His может препятствовать нормальному функционированию белка
          • Метка His может быть отщеплена от белка путем введения специфической последовательности распознавания эндопептидазы
          • Последовательность «asp asp asp asp lys» распознается и расщепляется энтерокиназой.Эта последовательность не распространена, и сомнительно, что интересующий белок содержит другую такую ​​последовательность

          Рисунок 3.4.7: Расщепление энтерокиназой

          • His-метки/сайты EK обычно вводятся на амино-конце белков, но могут быть введены и на карбокси-конце

          Хосты Expression

          Одной из важных характеристик хозяев экспрессии (бактерий) является то, что они позволяют накапливать экспрессируемый белок.

          • Некоторые экспрессированные белки могут быть свернуты неправильно. Хотя позже они могут подвергаться повторной укладке с образованием функционального белка, белки с неправильной укладкой могут быстро подвергаться протеолизу в бактерии-хозяине
          • Протеазы-хозяева могут избирательно расщеплять формы-предшественники экспрессированных белков с образованием зрелых активных форм, что может быть нежелательно.
          • Гены
          • OmpT и lon кодируют протеазы, которые могут расщеплять экспрессированные белки.
          • Две распространенные мутации в E.coli для устранения действия протеаз хозяина включает штаммы OmpT и lon .
          • E. coli штамм BL(DE3) является одновременно OmpT и lon

          Вектор экспрессии млекопитающих | Mammalian Expression

          Трансфекция плазмид в клетки млекопитающих напрямую включает генетический материал в геном для формирования стабильной трансфекции. Стабильная трансфекция используется для создания клеточных популяций, которые будут продолжать выражать генетические характеристики чужеродного материала, а затем передавать их потомству. Чтобы добиться стабильной трансфекции, должно быть избирательное давление, чтобы заставить клетки интегрировать плазмидную ДНК в геном. Гены-репортеры
          обычно используются для простого мониторинга эффективности трансфекции и уровней экспрессии в клетках. Synbio Technologies предлагает различные векторы экспрессии репортерных генов для удовлетворения потребностей в скрининге различных клеточных линий и эффективного скрининга экспрессии в соответствии с условиями скрининга, специфичными для клеток.

          Выбор флуоресцентных белков, промоторов и селектируемых маркеров

          Различные промоторы обладают разной активирующей активностью в разных клетках. Например, в гемопоэтических стволовых клетках SFFV обладает гораздо лучшей активирующей активностью, чем CMV. Существуют также различия в тканеспецифической экспрессии. ААТ высоко экспрессируется в тканях печени и слабо экспрессируется в других тканях. hSyn высоко экспрессируется в нервных клетках и слабо экспрессируется в других тканях. Synbio Technologies предлагает различные флуоресцентные белки, промоторы и векторы экспрессии млекопитающих с выбираемыми маркерами для удовлетворения потребностей клеточно-специфического скрининга.

          Схематическая диаграмма экспрессионного вектора клеток млекопитающих Выбираемые маркеры в клетках млекопитающих работают так же, как и в бактериях.
          Таблица наиболее часто используемых выборочных маркеров перечислены ниже: ингибирует удлинение цепи
          Название Гена Сопротивление сотейки Типы ячейки Режим действия
          BlasticiDin BSD Hek293, Cho, Hela, COS-1NIh4T3 Ингибирует стадию терминации трансляции
          G418/Geneticin neo HEK293, CHO, HeLa, NIh4T3, Jurkat Т-клетки
          Гигромицин B hygB CHO, HeLa, NIh4T3, Jurkat Т-клетки Блокирует синтез полипептидов при 80S; ингибирует удлинение цепи
          Пуромицин pac HEK293, HeLa, Jurkat Т-клетки Ингибирует синтез белка; преждевременная обрыв цепи
          Зеоцин Шбла HEK293, CHO, HeLa, NIh4T3, COS-1, Jurkat Т-клетки Комплексы с ДНК; вызывает расщепление цепи
          Промоторы векторов экспрессии млекопитающих также имеют различные применимые объекты.
          Наиболее часто используемые промоторы перечислены ниже:
          промоутер в основном используется для РНК транскрипта Описание
          CMV Общее выражение мРНК сильное выражение млекопитающего от человека цитомегаловирус
          EF1A Генеральное выражение мРНК сильное выражение млекопитающих из человеческого удлинения фактора 1 альфа
          SV4092 MRNA мРНК промоус выражения млекопитающих из симиана вакуоляционного вируса 40
          PGK1 Человека или мышь) Генеральное выражение мРНК промотор млекопитающих из фосфоглицентных киназы Gene
          UBC Генеральное выражение мРНК промотор мрнна промотор млекопитающих от человеческого убуживания C Gene
          Person Beta Acctin Генеральное выражение мРНК промотор млекопитающих из бета-актина гена
          CAG
          CAG MRNA сильные гибридные промотор млекопитающих
          TRE общее выражение мРНК тетрациклин реагируют элемент промотора
          UAS UAS MRNA MRNA MRNA MRNA сайты переплета GAL4
          CAMKIIA выражение гена для оптогенетики мРНК CA2 + / Caleodulin-зависимый белок киназы II промотор
          h2 малая РНК выражение shRNA с человека полимеразы III, РНК-промотор
          U6 малая РНК экспрессия shRNA с человеческой U6 небольшой ядерный промотор
          90 006 * Для получения дополнительной информации свяжитесь с нами по адресу [email protected] ком.

          векторных типов



          Мышиное антитело экспрессии


          0


          Векторы для ультра-высокого белка в клетках Hek 293 с использованием трансактивации TAR-Tat

          Ультраэкспрессионные векторы pHEK293 представляют собой плазмиды для временной сверхэкспрессии интересующего белка в клетках HEK 293 человека.Экспрессия белка с использованием этих векторов может быть до 10 раз выше, чем экспрессия, полученная с помощью векторов с обычными промоторами, полученными из цитомегаловируса (CMV). Перед покупкой этих продуктов все клиенты должны заключить соглашение с покупателем, чтобы отправить заказ.

          Высокая экспрессия белка достигается с помощью системы HIV-1 TAR-Tat.

          Ультраэкспрессионные векторы pHEK293 представляют собой плазмиды для временной сверхэкспрессии интересующего белка в клетках HEK 293 человека. Экспрессия белка с использованием этих векторов может быть до 10 раз выше, чем экспрессия, полученная с помощью векторов с обычными промоторами, полученными из цитомегаловируса (CMV). Перед покупкой этих продуктов все клиенты должны заключить соглашение с покупателем, чтобы отправить заказ.

          Высокая экспрессия белка достигается с помощью системы HIV-1 TAR-Tat. Элемент TAR (трансактивационный ответ) представляет собой последовательность РНК, полученную из вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), которая образует структуру «стебель-петля» на 5′-конце РНК ВИЧ-1.Tat представляет собой РНК-связывающий белок, который активирует транскрипцию, связываясь с TAR и способствуя удлинению транскрипции.

          Ультраэкспрессионные векторы pHEK293 используют этот механизм активации транскрипции; последовательность TAR присутствует в 5′-нетранслируемой области гена-мишени, а экспрессионная кассета Tat включена либо в тот же вектор (кат. № 3390), либо в отдельную плазмиду (кат. № 3392). Эта система обеспечивает эффективную экспрессию белка Tat, тем самым значительно увеличивая количество экспрессируемого белка-мишени.Поскольку последовательность TAR расположена в нетранслируемой области целевого гена, она не влияет на аминокислотную последовательность экспрессируемого целевого белка.

          Новые векторы экспрессии млекопитающих | Nature

        • Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. & Moss, B. Proc. физ. акад. науч. США 83 , 8122–8126 (1986).

          ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

        • Мизуками Т., Фюрст, Т.Р., Бергер, Э.А. & Мосс, Б. Proc. физ. акад. науч. США 85 , 9273–9277 (1988).

          ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

        • Уитт, М.А., Чонг, Л. и Роуз, Дж.К. Дж. Вирол. 63 , 3569–3578 (1989).

          КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

        • Паттнаик, А.К. и Верц, Г.В. Дж. Вирол. 64 , 2948–2957 (1990).

          КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

        • Фюрст, Т.Р., Эрл, П.Л. & Мосс, Б. Molec. клетка. биол. 7 , 2538–2544 (1987).

          КАС Статья Google ученый

        • Барретт, Н. и др. СПИД рез.Human Retroviruses 5 , 159–171 (1989).

          КАС Статья Google ученый

        • Фюрст, Т.Р. & Moss, B. J. molec. биол. 206 , 333–348 (1989).

          КАС Статья Google ученый

        • Элрой-Стейн, О. , Фюрст, Т.Р. & Мосс, Б. Proc. физ. акад. науч. США 86 , 6126–6130 (1989).

          ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

        • Рич Д.П. и др. Природа 347 , 358–363 (1990).

          ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

        • Фюрст, Т.Р., Фернандес, М.П. & Мосс, Б. Proc. физ. акад. науч. США 86 , 2549–2553 (1989).

          ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

        • Александр В.А., Мосс, Б. и Фюрст, Т.Р. (в процессе подготовки).

        • Элрой-Стейн, О. и Мосс, Б. Proc. физ. акад. науч. США 87 , 6743–6747 (1990).

          ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

        • Deuschle, U. и др. Проц. физ. акад. науч. США 86 , 5400–5404 (1989).

          ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

        • Чжоу Ю., Джордано, Т.Дж., Дурбин, Р.К. & McAllister, WT Molec. клетка. биол. 10 , 4529–4537 (1990).

          КАС Статья Google ученый

        • Lieber, A., Kiessling, U. & Strauss, M. Nucleic Acids Res. 17 , 8485–8493 (1989).

          КАС Статья Google ученый

        • Готовые к экспрессии векторы VersaClone: ​​R&D Systems

          Наши готовые к экспрессии векторы VersaClone готовы к трансфекции в клетки млекопитающих.Узнайте больше информации ниже и заполните форму запроса проекта, чтобы создать свой вектор экспрессии.

           

          Запрос вектора

           

          Промотор CMV

          ТК Промоутер

          Экспрессия GFP-меченого PD-L2 человека в клетках эмбриональной почки человека HEK293

          Удобно

          Экспрессионные векторы VersaClone поставляются в виде высокоочищенных плазмид, готовых для трансфекции в клетки млекопитающих. Каждый флакон содержит 25 мкг ДНК в концентрации 0,5 мкг/мкл.

          Они изготавливаются в кратчайшие сроки, что позволяет нам быстро выполнить ваш запрос. Немаркированные гены будут отправлены в течение 1-2 недель. Помеченные гены будут отправлены через 2-3 недели.

          Аминокислоты Цена без тега Цена с тегами
          0-599 299 $ 399 $
          600-1199 $599 699 $
          1200+ 999 долларов 1099 долларов

          Широкая селекция генов

          Все генные вставки полностью проверены.Готовые к экспрессии векторы могут быть созданы из любого из наших быстрорастущих векторных продуктов VersaClone для клонирования. Наш расширяющийся набор генов доступен у человека, а также у множества других важных модельных организмов. Поищите в нашей подборке генов кДНК, чтобы найти доступные генные вставки.

          Несколько вариантов уровня экспрессии

          Мы предлагаем различные промоторы силы, которые варьируют уровни экспрессии целевого белка. Как правило, промотор CMV будет сверхэкспрессировать интересующий вас белок, а промотор TK будет экспрессировать ваш белок на более низком уровне (см. примеры изображений выше).

          Дополнительные теги

          Мы предлагаем версии наших векторов экспрессии с меткой GFP для удобного анализа и визуализации уровней экспрессии белков. Мы также предлагаем версии с 6-кратной меткой His для легкой очистки и обнаружения белка. Метка может быть добавлена ​​к С- или N-концу гена.

          Маркеры выбора

          Наши векторы экспрессии содержат маркер селекции. Селекционные маркеры обеспечивают устойчивость к антибиотикам для создания стабильных трансфицированных клеток млекопитающих. Доступными маркерами селекции являются пуромицин и неомицин.

          Индивидуальные проекты

          Есть что-то еще на уме? Наши опытные ученые будут работать с вами, чтобы предоставить индивидуальный вектор, соответствующий всем вашим требованиям.

alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.