Поиск по сайту |
Лампы 6К4П — пентоды с удлинённой характеристикой. Предназначены для усиления напряжения высокой и промежуточной частоты в схемах с автоматической регулировкой усиления. Оформление — миниатюрное, в стеклянной оболочке, массой 13 г. Схема 6К4П Цоколёвка 6К4П Размеры 6К4П 6К4П характеристикипри Uн = 6.3 В, Uа = 250 В, Uс2 = 100 В, Rк = 68 Ом
Предельные эксплуатационные данные 6К4П
Анодные характеристики 6К4П-ЕВ Анодно-сеточные характеристики 6К4П-ЕВ |
Покупаем на выгодных условиях: платы, радиодетали, микросхемы, АТС, приборы, лом электроники, катализаторы
Мы гарантируем Вам честные цены! Серьезный подход и добропорядочность — наше главное кредо.
Компания ООО «РадиоСкупка» (скупка радиодеталей) закупает и продает радиодетали , а также любое радиотехническое оборудование и приборы. У нас Вы сможете найти не только наиболее востребованные радиодетали, но и редкие производства СССР и стран СЭВ. Мы являемся партнером «ФГУП НИИ Радиотехники» и накопили огромный опыт за наши годы работы. Также многих радиолюбителей заинтересует наш уникальный справочник по содержанию драгметаллов в радиодеталях. В левом нижнем углу нашего сайта Вы сможете узнать актуальные цены на драгметаллы такие, как золото, серебро, платина, палладий (цены указаны в $ за унцию) а также текущие курсы основных валют. Работаем со всеми городами России и география нашей работы простирается от Пскова и до Владивостока. Наш квалифицированный персонал произведет грамотную и выгодную для Вас оценку вашего оборудования, даст профессиональную консультацию любым удобным Вам способом – по почте или телефону. Наш клиент всегда доволен!
Покупаем платы, радиодетали, приборы, АТС, катализаторы. Заинтересованы в выкупе складов с неликвидными остатками радиодеталей а также цехов под ликвидацию с оборудованием КИПиА.
Приобретаем:
- платы от приборов, компьютеров
- платы от телевизионной и бытовой техники
- микросхемы любые
- транзисторы
- конденсаторы
- разъёмы
- реле
- переключатели
- катализаторы автомобильные и промышленные
- приборы (самописцы, осциллографы, генераторы, измерители и др.)
Купим Ваши радиодетали и приборы в любом состоянии, а не только новые. Цены на сайте указаны на новые детали. Расчет стоимости б/у деталей осуществляется индивидуально в зависимости от года выпуска, состоянии, а также текущих цен Лондонской биржи металлов. Работаем почтой России, а также транспортными компаниями. Наша курьерская служба встретит и заберет Ваш груз с попутного автобуса или поезда.
Честные цены, наличный и безналичный расчет, порядочность и клиентоориентированность наше главное преимущество!
Остались вопросы – звоните 8-961-629-5257, наши менеджеры с удовольствием ответят на все Ваши вопросы.
С уважением, директор Александр Михайлов.
И снова… О нувисторах в РПУ «Волна-К» — Промышленные — Приемники, узлы и блоки. — Каталог статей и схем
— И чего он за эту «Волну» взялся — уж сколько писано…А дело в том, что длительное время у нас в ассистентской стоял приемник «Волна-К», подаренный кафедре кем-то из морских офицеров. Стоял на тумбочке, рядом с моим рабочим столом и среди эскулапов я им «управлял» на правах радиолюбителя со стажем… Естественно, все мои доработки, переделки и модификации начинались с этого девайса…
Один из моих собеседников по переписке в интернете сообщил мне интересную новость (может эта «новость» только для меня новостью оказалась?): в начале 60-х годов прошлого века в УРЧ «Волны» радиолюбители пробовали устанавливать нувисторы. При этом «шумность» приемника резко уменьшалась… И об этом писали в журнале «Радио».
Вопрос, конечно, интересный. Его б задать на форумах QRZ.ru и CQHAM.ru – там есть несколько специальных тем по ламповой «Волне-К». Кроме того, в интернете есть несколько форумов (найти можно через поисковик «GOOGLE», набрав слово «нувистор»), где обсуждаются нувисторы. К сожалению, при беглом просмотре этих материалов оказалось, что чаще всего нувисторы применяли (-ют) в ламповых УЗЧ и осциллографах (по входу, что близко к нашей теме разговора – УРЧ на нувисторе).
Есть еще одна «заковыка». Некоторые радиолюбители принимают миниатюрные стержневые лампы (такие как, скажем, в приемнике Р-326: 1Ж24Б, -37Б, – 29Б) за нувисторы. Это неправильно. Размеры нувисторов — сверхминиатюрных ламп (так они правильно называются) по высоте около 2 см, а диаметр – 1см, что меньше миниатюрных стержневых.
В старых осциллографах (надо поискать – каких) в предусилителях применялись 6С51Н, …52Н,…53Н. Это ВЧ универсальные триоды. Их можно применить на входе «Волны-К» в УРЧ. При этом их крутизна ≥ 10 мА/В, Кус. = 32, 64, 75, соответственно, что значительно выше штатной 6К4П, установленной в «Волне».
Будет ли «Волна» шуметь меньше? Трудно сказать. Нувисторы считаются вроде как непревзойденными по соотношению сигнал/шум (данные из интернета). Но при современной «шумовой» обстановке в эфире их применение вряд ли оправдано. В 1962 году могло быть по другому – эфир был «другим», прозрачным и, относительно, чистым. Тем более, что весь выигрыш в современных условиях покроется шумами смесителей и усилителей схемы «Волны». Таким образом, решающим может быть только эксперимент – «опыт, сын ошибок трудный». По моему мнению, нувистор, отличается от обычных ламп с такими же характеристиками только размерами и технологией изготовления этой лампы, предназначенной для экстремальных условий эксплуатации.
По параметрам постоянного тока у 6С51Н,…52Н почти полное совпадение, только в катоде для установки автоматического смещения следует ставить R=130 ом, при применении 6С53Н – 68 ом. Вот характеристики указанных нувисторов:
Лампа Междуэлектродная емкость, пф
Входн. Выходн. Проход
6С51Н 4,75 2,2 1,75
6С52Н 4,75 1,6 0,85
6С53Н 4,75 0,06 1,6
Лампа Накал Напр., Резист. Ток Крутиз- Коэф. Внутр. Мощн.
Напр.,в Ток,А анода, автом. анода, на хар- усил. сопр., на аноде,
в смещ. мА актер., ом вт
ом мА/в
6С51Н 6,3 0,13 75 130 10 11,2 32 2,9 1
6С52Н 6,3 0,13 110 130 8 10 64 6,4 1
6С53Н 6,3 0,13 120 68 11 13 75 5,8 1
В УРЧ «Волны» меняют R1-13 на 130 или 68 ом. R1-11 – попробуйте установить первоначально номинал около 10 к. Далее «вгоняйте» этим R1-11 в параметры постоянного тока, как в таблице. Цепь питания экранной сетки убирается. В схеме в цепи сетки нувистора ставятся контуры ДПФ, а в аноде – контуры по входу смесительной лампы. Далее подстройка контуров – сопряжение, при растянутых диапазонах это будет легче сделать — можно настроить контур в резонанс.
Еще лучше найти, все-таки, схему предусилителя осциллографа (любого, где на входе стоит нувистор), и собрать схему УРЧ оттуда. Обычно эти усилители укладываются в полосу рабочих частот до 30 мГц (и выше), что нас вполне устраивает.
Ну и последний вариант. Искать архивы журнала «Радио». Это не так и сложно. Свой собственный архив я собрал с номеров 1970 года до наших дней, старее посчитал — нет необходимости. Может кто-то из радиолюбителей и поделится опытом по применении нувисторов… Ваши мнения, господа!
Ссылка на сайт, где находится одна из библиотек с архивами журналов «Радио» здесь.
В.Кононенко, RA0CCN.
Отечественные производители ламп Ламповые усилители. ![]() | ||||||
Использованы материалы сайта cqham.ru | ||||||
Наименование | Аналог | Imax, мA | Umax, В | Примечание | Краткое описание радиоламп | |
---|---|---|---|---|---|---|
Диоды | электровакуумные диоды служат для детектирования или для выпрямления переменного напряжения | |||||
1Ц11П | 0.3 | 20000 | высоковольтн | характеристики лампы 1Ц11П | ||
1Ц21П | 0.6 | 25000 | высоковольтн | |||
5Ц3С | 250 | 1700 | двуханодный | характеристики лампового диода 5Ц3С | ||
5Ц4С | 125 | 1325 | двуханодный | параметры лампы 5Ц4С | ||
5Ц8С | 420 | 1700 | двуханодный | характеристики 5Ц8С | ||
5Ц9С | 205 | 1700 | двуханодный | |||
6Ц4П | 75 | 1000 | двуханодный | характеристики 6Ц4П | ||
6Ц5С | 75 | 1100 | двуханодный | |||
Триоды | триоды — радиолампы с одной сеткой, служат для усиления или генерирования электрических сигналов | |||||
6С1П | ![]() | 275В | ВЧ | характеристики 6С1П смотри в datasheet | ||
6С2П | 13.6 | 165 | СВЧ | параметры лампы 6С2П | ||
6С2С | 20 | 330 | для УНЧ | |||
6С3П | 20 | 160 | ВЧ | подробные характеристики триода 6С3П приведены в datasheet | ||
6С5С | 8 | 350 | ВЧ | |||
6С15П | 40 | 150 | высокая крутизна | |||
6Н1П | 25 | 300 | двойной, для УНЧ | Характеристики радиолампы 6Н1П | ||
6Н2П | 10 | 300 | двойной, для УНЧ | Характеристики лампы 6Н2П. Анодная вольт-амперная характеристика. | ||
6Н3П | 18 | 300 | двойной, для УНЧ | электронная лампа 6Н3П для усилителей низкой частоты, графики зависимостей параметров | ||
6Н5П | 25 | 300 | двойной, для УВЧ | двойной триод 6Н5П для усилителей высокой частоты | ||
6Н5С | 100 | 250 | двойной, для УНЧ | характеристики радиолампы 6Н5С, двойного триода с раздельными катодами | ||
6Н6П | 40 | 300 | двойной, для УНЧ | радиолампа 6Н6П, datasheet с подробными характеристиками | ||
6Н7С | 17.![]() | 300 | двойной, для УНЧ | двойной триод 6Н7С для усилителей низкой частоты | ||
6Н8С | 20 | 330 | двойной, для УНЧ | лампа 6Н8С | ||
6Н9С | 2.3 | 275 | двойной, для УНЧ | |||
6Н13С | 76 | 250 | для стабилизаторов | |||
6Н14П | 10 | 300 | двойной, для УВЧ | Подробные параметры лампы 6Н14П, графики вольт-амперной характеристики. Схемы усилителей на 6Н14П | ||
6Н15П | 9 | 330 | двойной, для УВЧ | Характеристики лампы 6П15П, datasheet с графиками. | ||
6Н23П | 20 | 300 | двойной, для УВЧ | Подробные параметры лампы 6Н23П, график анодной характеристики | ||
6С18С | 550 | 450 | для стабилизаторов | |||
6С4П | 20 | 160 | для УВЧ | |||
6Ф1П | 14 | 250 | + пентод, для УВЧ | Триод-пентод 6Ф1П.![]() | ||
6Ф3П | 60 | 275 | + пентод, для УНЧ | Характеристики электронной лампы 6ф3п. Схемы ламповых УНЧ на 6Ф3П. | ||
6Ф5П | 75 | 300 | + пентод, для УНЧ | Характеристики электронной лампы 6ф3п (триод-пентод). Схемы ламповых УНЧ на 6Ф3П. | ||
Тетроды | тетроды — лампы с двумя сетками, предназначены для усиления по напряжению и по мощности, имеют больший коэффициент усиления, чем триоды | |||||
6П1П | 70 мА | 250В | для УНЧ | Характеристики радиолампы 6П1П | ||
6П3С | 72 | 400 | для УНЧ | Подробные характеристики лампы 6П3С (тетрод). Вольт-амперная анодная характеристика. Схемы ламповых усилителей на 6П3С. Двухтактный усилитель на 6П3С Однотактный усилитель на 6П3С | ||
6П6С | 46 | 350 | для УНЧ | Характеристики радиолампы 6П6С.![]() | ||
6П7С | 72 | 500 | для УВЧ | Параметры радиолампы 6П7С | ||
6П13С | 60 | 450 | для генераторов | Характеристики электронной лампы 6П13С | ||
6П31С | 80 | 300 | для строчной разв. | характеристики радиолампы 6П31С, datasheet | ||
6П36С | 120 | 550 | для строчной разв. | характеристики лампы 6П36С. Схемы ламповых усилителей на 6П36С | ||
6П45С | 500 | 400 | для строчной разв. | радиолампа 6П45С, datasheet с подробными характеристики и предельными электрические параметры | ||
6Э5П | 100 | 250 | для УВЧ | |||
Пентоды | пентоды — электронные лампы с тремя сетками, обладают большим коэффициентом усиления | |||||
6Ж1П | 20 мА | 200В | для УВЧ | |||
6Ж2П | 20 | 200 | для УВЧ | характеристики лампы 6Ж2П | ||
6Ж3П | 7 | 330 | для УВЧ | описание пентода 6Ж3П | ||
6Ж4П | 20 | 300 | для УВЧ | характеристики лампы 6Ж4П | ||
6Ж5П | 20 | 300 | для УВЧ | пентод 6Ж9П | ||
6Ж9П | 35 | 250 | для УВЧ | характеристики радиолампы 6Ж9П | ||
6Ж38П | 20 | 300 | для УВЧ | |||
6Ж52П | 70 | 350 | для УВЧ, малошум.![]() | Параметры радиолампы 6Ж52П | ||
6П14П | 65 | 400 | для УНЧ | Подробные характеристики лампы 6П14П приведены в datasheet. График анодной характеристики. Схемы ламповых усилителей на 6П14П. Двухтактный усилитель на 6П14П. Однотактный усилитель на 6П14П. | ||
6П15П | 90 | 330 | для УВЧ ТВ-приемн. | Характеристики радиолампы 6П15П. | ||
6П18П | 75 | 250 | для УНЧ | Подробные характеристики лампы 6П18П. Datasheet. | ||
6П43П | 75 | 300 | для УНЧ | Параметры лампы 6П43П приведены в datasheet | ||
6К1П | 6 | 275 | для УВЧ | |||
6К4П | 20 | 300 | для УВЧ | |||
6К13П | 22 | 250 | для УВЧ | |||
6Ф6С | 35 | 410 | для УМЗЧ | лампа 6Ф6С предназначена для применения в выходных каскадах усилителей мощности низкой частоты | ||
6Ф1П | 14 | 250 | + триод, для УВЧ |
Пентод — триод 6Ф1П, параметры.![]() | ||
6Ф3П | 60 | 275 | + триод, для УНЧ | Характеристики радиолампы 6ф3п. | ||
6Ф5П | 75 | 300 | + триод, для УНЧ | Характеристики радиолампы 6ф3п (пентод-триод). | ||
Генераторные лампы ГУ | ||||||
ГУ-13 | 65 мА | 2000 | для ВЧ генераторов | генераторная лампа ГУ-13, подробные характеристики | ||
ГУ-17 | 30 мА | 400 | для ВЧ генераторов | лампа ГУ-17, описание и характеристики | ||
ГУ-21Б | 2А | 9000 | для ВЧ генераторов | характеристики лампы ГУ-21 | ||
ГУ-22А | 4А | 10000 | для ВЧ генераторов | генераторная радиолампа ГУ 22, описание и характеристики | ||
ГУ-23А | 4.![]() | 11000 | для ВЧ генераторов | параметры лампы ГУ-23А | ||
ГУ-23Б | 7А | 12000 | для ВЧ генераторов | лампа ГУ 23 | ||
ГУ-29 | 85 мА | 750 | для ВЧ генераторов | подробные характеристики лампы ГУ-29 с графиками зависимостей параметров | ||
ГУ-32 | 42 мА | 500 | для ВЧ генераторов | параметры лампы ГУ-32 приведены в datasheet | ||
ГУ-34Б | 540 мА | 4000 | для ВЧ генераторов | генераторная радиолампа ГУ 34 | ||
ГУ-36Б-1 | 5А | 8000 | для ВЧ генераторов | лампа ГУ-36Б, характеристики и описание | ||
ГУ-48 | 900 мА | 3000 | для ВЧ генераторов | радиолампа ГУ48 | ||
ГУ-50 | 300 | 1000 | для ВЧ генераторов | Характеристики лампы ГУ-50.![]() | ||
ГУ-66А | 12А | 10000 | для ВЧ генераторов | характеристики с графиками генераторной лампы ГУ-66А, | ||
ГУ-74Б | 750 мА | 2000 | для ВЧ генераторов | подробные характеристики лампы ГУ-74Б | ||
ГУ-81М | 600 мА | 3000 | для ВЧ генераторов | электронная лампа ГУ-81, характеристики и описание | ||
Вернуться к каталогу справочников | ||||||
Приемник на пальчиковых лампах | Шаг за шагом
Схема первого из приемников (чертеж 19) почти полностью повторяет схему нашего электрического макета: здесь применены те же усилительные лампы: 6И1П, 6К4П, 6Ж1П, (6ЖЗП) и 6П1П, те же схемы отдельных узлов: входной цепи, преобразователя частоты, детектора, усилителей ПЧ и НЧ, а также сохранена нумерация основных деталей. Некоторое отличие представляет лишь схема регулировки тембра и блока питания.
Регулировка тембра осуществляется в специальной цепи отрицательной обратной связи, которая возникает благодаря включению конденсатора С31 между анодом и управляющей сеткой лампы Л4. Так как емкость конденсатора С31 очень мала, то этот конденсатор не пропускает из анодной цепи на сетку низшие звуковые частоты, и обратная связь в основном существует лишь на высших звуковых частотах. А поскольку обратная связь в данной схеме получается отрицательной, то она ослабляет сигнал, поступающий на сетку лампы с предыдущего каскада, причем ослабляет лишь высшие звуковые частоты этого сигнала. Иными словами, благодаря введению обратной связи у частотной характеристики усилителя появляется «завал» в области высших частот (рис. 146).
Нарисованная нами картина в полной мере относится к случаю, когда движок потенциометра R16 («регулировка тембра») находится в верхнем (по схеме) положении и все напряжение, поступающее через конденсатор С31, полностью подается на сетку лампы. Теперь представьте себе, что движок потенциометра R16 находится в крайнем нижнем положении. В этом случае конденсатор замкнут на «землю», напряжение обратной связи на сетку не поступает, и «завала» частотной характеристики нет. Совершенно ясно, что если мы будем перемещать движок потенциометра из одного крайнего положения в другое, то будет изменяться глубина обратной связи, а вместе с ней и степень «завала» частотной характеристики, то есть, иными словами, будет происходить регулировка тембра.
В блоке питания рассматриваемого приемника выпрямитель выполнен по так называемой мостовой схеме (лист 177). Прежде чем разбирать ее, нам придется коротко остановиться на схеме двухполупериодного выпрямителя (лист 176), которая используется во втором приемнике.
Рассмотренная нами ранее схема выпрямителя называется однополупериодной. Название это связано с тем, что в таком выпрямителе ток через вентиль проходит лишь в течение одной половины периода, а во время второго полупериода наступает пауза — вентиль тока не пропускает. Особую роль при этом играет первый конденсатор фильтра — Сф1 (С34). Когда вентиль пропускает ток, этот конденсатор заряжается (то есть накапливает заряды), а во время паузы он разряжается через нагрузку — через анодные цепи ламп. Учитывая все это, конденсатор Сф1 можно назвать накопительным конденсатором. Именно благодаря этому конденсатору ток через нагрузку протекает все время, а не только в те моменты, когда проходит ток через вентиль.Чтобы лучше уяснить роль накопительного конденсатора, представьте себе, что у вас имеется бак с открытым краном у самого дна и что кто-то через равные промежутки времени ведром доливает в этот бак воду (рис. 147).
Можно так подобрать емкость бака и количество доливаемой воды, что бак никогда не будет оставаться пустым и из крана все время будет бежать струя воды. Такая система очень похожа на наш выпрямитель: бак играет роль накопительного конденсатора Сф1, открытый кран характеризует потребление тока нагрузкой, а доливание воды ведром напоминает импульсы тока, которые проходят через вентиль пятьдесят раз в секунду. Что же касается выпрямленного напряжения, то его можно сравнить со средним давлением воды на дно бака. Очевидно, это давление зависит от среднего уровня воды в баке.
Развивая наше сравнение, можно сделать ряд очень интересных выводов относительно работы выпрямителя. Прежде всего отметим, что ток через нагрузку будет пульсировать, то есть будет периодически меняться по величине, подобно тому как меняется скорость воды, вытекающей из крана (чем ниже уровень воды в баке, тем медленнее она вытекает). Мы уже знаем, что, для того чтобы сгладить пульсацию тока, в фильтр выпрямителя вводят дроссель (или сопротивление) и еще один конденсатор Сф2 (С35). Попутно заметим, что, чем больше потребляемый ток, тем сильнее будут его пульсации (чем больше открыт кран, тем резче меняется уровень воды за время между двумя доливаниями). Величина пульсаций зависит также и от емкости накопительного конденсатора: чем больше эта емкость, тем большую энергию накопит конденсатор в то время, когда вентиль пропускает ток, тем меньше будут пульсации.
Аналогично при увеличении емкости бака возрастет объем запасаемой в нем воды и уменьшается влияние открытого крана: чем больше запас воды, тем меньше меняется ее уровень за время между двумя доливаниями.
От величины потребляемого тока и от емкости накопительного конденсатора Сф1 сильно зависит и напряжение на выходе выпрямителя: чем больше емкость Сф1 и чем меньше потребляемый ток, тем больше выпрямленное напряжение (чем больше емкость бака и чем меньше воды вытекает через открытый кран, тем больше средний уровень воды в баке). Совершенно очевидно, что ни при каких обстоятельствах напряжение на конденсаторе не может оказаться больше амплитуды переменного напряжения, которое подводится к выпрямителю и через вентиль заряжает накопительный конденсатор. Точно так же максимальный уровень воды в баке не может быть выше уровня ведра, из которого заливают этот бак, — вода может литься сверху вниз, но не наоборот.
Что же касается выпрямленного, то есть среднего напряжения, то его величина, как мы уже отмечали, зависит от емкости Сф1 и потребляемого тока и практически на 20—50% меньше амплитуды переменного напряжения. Выпрямленное напряжение оказывается равным амплитуде переменного напряжения лишь при «холостом ходе», то есть тогда, когда выпрямитель работает без нагрузки. И, наконец, последнее — уровень воды в баке не должен превышать высоты его стенок, иначе вода перельется через верх. Так же и напряжение, подводимое к конденсатору, не должно превышать величину, на которую он рассчитан, иначе произойдет пробой этого конденсатора (повреждение изолятора и короткое замыкание обкладок). Оба конца повышающей обмотки силового трансформатора окажутся замкнутыми через вентиль, в результате чего в цепи пойдет большой ток и трансформатор и вентиль, быстро перегревшись, выйдут из строя.
Следует заметить, что, когда возрастает ток в повышающей обмотке, увеличивается потребляемая трансформатором мощность, а следовательно, и ток в сетевой обмотке, куда включен предохранитель. Это значит, что в случае «пробоя» конденсатора фильтра мгновенно сгорит предохранитель и одна из самых дорогих деталей приемника — силовой трансформатор — будет спасен (конечно, лишь в том случае, если вы еще не успели заменить настоящий предохранитель толстым «жучком», рис. 148).
Обратите внимание на то, что в верхнем и нижнем рядах рисунка 147 изображены совершенно одинаковые баки и в то же время во втором случае пульсации намного меньше, а средний уровень воды заметно выше. А дело здесь в том, что бак, расположенный в нижнем ряду, доливается в два раза чаще, чем верхний, и поэтому уровень воды меняется весьма незначительно.
Рассуждая подобным образом, можно прийти к следующему выводу: чем чаще мы будем подзаряжать накопительный конденсатор фильтра Сф1, тем больше будет выпрямленное напряжение и меньше будут его пульсации. Но как можно увеличить частоту импульсов зарядного тока? Ведь не можем же мы изменить частоту переменного напряжения, которое подводится к вентилю — эта частота всегда равна 50 гц («частота сети»)!
Оказывается, что есть другой путь. Чтобы подзаряжать конденсатор Сф1 не пятьдесят раз в секунду, а сто раз, достаточно использовать напряжение второго полупериода, во время которого вентиль обычного однополупериодного выпрямителя тока не пропускает. Нам уже давно известно, что любой вентиль пропускает ток лишь во время положительных полупериодов переменного напряжение, а во время отрицательных полупериодов диод оказывается включенным в обратном направлении (или на аноде кенотрона оказывается «минус») и тока в цепи нет. Но ведь сами названия «положительный» и «отрицательный», которые мы присвоили полупериодам переменного напряжения, совершенно условны. Можно включить вентиль так, что он будет пропускать ток во время первого, третьего, пятого и других нечетных полу периодов.
Если повернуть вентиль в обратную сторону (лист 176), ток через нагрузку будет протекать во время второго, четвертого, шестого и других четных полупериодов. Если же взять силовой трансформатор с двумя одинаковыми повышающими обмотками и два вентиля, то можно построить схему, где ток через нагрузку будет протекать в одну и ту же сторону как во время четных, так и во время нечетных полупериодов (лист 176). Такой выпрямитель получил название двухполупериодного. Совершенно ясно, что в двухполупериодном выпрямителе подзарядка накопительного конденсатора будет происходить уже не пятьдесят, как это было в однополупериодном, а сто раз в секунду. При этом, как уже отмечалось, увеличится выпрямленное напряжение (обычно на 15—25%) и заметно уменьшатся пульсации. Кроме того, при переходе на двухполупериодное выпрямление основная частота пульсаций увеличится вдвое. Это значит, что конденсаторы фильтра Сф1 и Сф2 легче будут замыкать на «землю» переменную составляющую выпрямленного тока, так как, чем больше частота, тем меньше емкостное сопротивление конденсаторов.
Есть у двухполупериодного выпрямителя и свои недостатки— для него нужно иметь два вентиля и две повышающие обмотки. Что касается двух вентилей, то это не так уж страшно, особенно в тех случаях, когда применяется кенотрон. Дело в том, что почти все кенотроны делают с двумя анодами и поэтому одной лампы вполне достаточно для двухполупериодного выпрямителя. Поскольку в таком выпрямителе катоды вентилей все равно соединяют вместе, то в большинстве двуханодных кенотронов делают один общий катод. Именно с этого общего катода на нагрузку подается «плюс» выпрямленного напряжения, то есть с катода кенотрона напряжение должно подаваться к анодным и экранным цепям усилительных ламп.
В силовом трансформаторе вместо двух повышающих обмоток наматывают одну обмотку с удвоенным числом витков и от середины ее делают отвод. С этого отвода, который является общим выводом обеих частей повышающей обмотки, к нагрузке подводится «минус» выпрямленного напряжения, то есть средний вывод — «средняя точка» — должен быть подключен к катодам усилительных ламп. В подавляющем большинстве случаев средний вывод соединяется с металлическим шасси или с «заземленным проводом», куда, как известно, подключаются и катоды ламп. Исключение составляет лишь схема получения смещения за счет общего тока (лист 139).
То, что мы выполнили обе повышающие обмотки в виде одной, не устранило второго недостатка двухполупериодного выпрямителя, так как в такой объединенной обмотке число витков в два раза больше, чем в одной обмотке однополупериодного выпрямителя. Так, например (лист 116), если у нас был однополупериодный выпрямитель, повышающая обмотка которого содержала 1200 витков и давала эффективное переменное напряжение 200 в (амплитуда 280 в), то для постройки аналогичного двухполупериодного выпрямителя повышающая обмотка должна содержать 2400 витков (2 х 1200), а между крайними выводами этой обмотки будет действовать эффективное напряжение 400 в (амплитуда около 600 в).
Увеличение числа витков повышающей обмотки крайне нежелательно, так как при этом усложняется изготовление трансформатора и увеличиваются его габариты Поэтому там, где это возможно, строят двухполупериодный выпрямитель по так называемой «мостовой» («мостиковой») схеме, которая позволяет обойтись лишь одной повышающей обмоткой, Это значит что из обычного однополупериодного выпрямителя можно собрать по мостовой схеме двухполупериодный, без замены и даже без переделки силового трансформатора.
Работа мостовой схемы особого пояснения не требует. В ней используется четыре вентиля, и включены они так, что во время обоих полупериодов через нагрузку проходит ток, причем этот ток всегда проходит в одну и ту же сторону (лист 177). Мостовую схему принято вычерчивать в виде квадрата, каждая сторона которого содержит вентиль, одна диагональ — нагрузку, а вторая — генератор переменного тока. В нашем приемнике, схема которого приведена на чертеже 19, используется тот же силовой трансформатор от приемника «Рекорд», что и в блоке питания макета (чертеж 9), но благодаря двухполупериодному выпрямителю (мостовая схема) несколько повышается анодное напряжение, а также уменьшается уровень фона. При выборе трансформатора для мостовой схемы нужно помнить, что его повышающая обмотка ни в коем случае не должна соединяться с накальной, так как последняя заземляется.
Еще один регенератор, «трехточка»: tubesound_ru — LiveJournal
Мне один дядька подкинул материал, статью из журнала CQ за 1950 год — регенератор на трех лампах, который он сам в детстве собирал и начинал с него и маломощного передатчика связи на КВ. Уверяет, что хорошо в свое время работал и брал связи. У него он до сих пор валяется.
.jpg)
Схема в целом страшненькая, потому что питается прямо от сети через селеновый выпрямитель (cурово жили предки :)), а все накалы ламп соединены последовательно и питаются так же от сети через понижающий резистор (!!!). Там используются две лампы с 12-вольтовым и одна с 35-вольтовым накалом (выходная).
Ссылка — отсканированная статья, оригинал, весит 1.75 мега
Кому лень почти два мега качать — я перерисовал собственно «соль» схемы, регенератор. УНЧ какой угодно можно навесить, хотя бы мой на 6Ф1П 🙂 В оригинале использовалась 12BA6, это аналог 6BA6 с 12-вольтовым накалом, т.е. прямой аналог 6К4П и EF93 за исключением накала (кликабельно).
С одной стороны, привлекает простота схемы (нет двух катушек и необходимости подбирать связь) а так же положительный отзыв о работе этой схемы того человека, а с другой, по прочтении вот этой статьи, почерпнул следующую информацию:
«Различают два режима работы регенератора: «мягкий» и «жесткий».«Мягкий» — это когда при регулировке режима работы приемник постепенно входит в режим максимальной добротности, а затем и в режим генерации. При «жесткой» связи (которая, к сожалению, преобладает во многих опубликованных схемах регенераторов на транзисторах, что очень сильно дискредитировало этот тип приемника) это невозможно, так как приемник срывается в генерацию еще тогда, когда из входного контура L1C2 не «вытянута» вся его добротность. В результате этого достичь приемлемых результатов при приеме AM и CW (об этом позже) невозможно. Сразу можно сказать, что в силу конструктивных особенностей практически все регенераторы с автотрансформаторной схемой регулировки обратной связи относятся к «жестким» регенераторам.
…Для работы в регенеративном каскаде лучше использовать пентоды типа 6Ж1П — 6Ж52П. Пентоды типа 6К4П — 6К13П использовать нежелательно, режим работы с применением этих пентодов близок к жесткому.» — правда, здесь речь идет о использовании их в схеме наподобие моей, вместо 6Ж1П и с двумя катушками связи.
![]()
Имеет смысл опробовать работу такого регенератора по сравнению с тем что у меня используется, или из вышепреведенного текста следует, «трехточка» на максимуме будет давать еще меньше добротности нежели контур с катушкой связи? Переделать очень легко, перепаять пару выводов и все…. Может стоит попробовать. Разумеется, увеличить гридлик как минимум до 5.1 мегов и С3 уменьшить раз в 10-15, это я уже усвоил 🙂
Интересует мнение уважаемых господ cryptomancer_ и iosaaris.
ИСПЫТАНО: Радиолампа 6К4П-ЭВ российского производителя №16634
1. Платеж
Германия
- Оплата PayPal-Express
- Прямой дебет
- Кредитная карта
- Оплата по счету
- Оплата авансом
- Органы власти и компании, расположенные в Германии, предоставляются при предъявлении действительного регистрационного номера плательщика НДС на счете с 30-дневной оплатой
ЕС, Швейцария, Лихтенштейн, Монако, Сербия, Босния и Герцеговина, Остров Мэн
- PayPal-Express платеж
- Кредитная карта
- Предоплата
Нетто-счет
Компании в ЕС могут покупать без НДС, пожалуйста, укажите свой номер НДС. во время оформления заказа, чтобы получить чистый счет.
по всему миру
- PayPal-Экспресс-платеж
- Кредитная карта
- Предварительная оплата
При оплате прямым дебетом или кредитной картой нагрузка на ваш счет может быть произведена сразу после получения вашего заказа.
2. Доставка
Стоимость доставки со скидкой за количество
Обратите внимание: подробная информация о сроках доставки
Германия
Первый предмет €5.90, доп. 1,00 € за каждый следующий товар, макс. 11,90 евро.
Для отправки мы пользуемся услугами DHL и Deutsche Post.
Мы доставляем либо посылкой DHL, либо почтовым письмом Deutsche Post.
Без наложенного платежа, без отправки на абонентские ящики.
Конечно, вы можете забрать свой заказ у нас. Пожалуйста, договоритесь до даты получения по телефону 0341-33742448. Обратите внимание, что ваша оплата возможна только через: банковский перевод, PayPal, кредитные карты.
ЕС
Deutsche Post: первое отправление 9 евро.90, доп. 1,00 € за каждый следующий товар, макс. 17,90 евро.
DHL: первый товар 19,90 евро, доп. 1,00 € за каждый следующий товар, макс. 29,90 евро.
по всему миру
Deutsche Post: первое отправление 12,90 евро, доп. 1,00 евро за каждую следующую позицию, макс. 29,90 евро.
DHL: первый товар 29,90 евро, доп. €1,00 за каждый следующий товар, макс. €49,90.
Для поставок в страны, не входящие в ЕС, дополнительные пошлины, налоги и сборы. Для получения дополнительной информации о тарифах см. пример ниже http://ec.europa.eu/taxation_customs/index_de.htm и налог с оборота при импорте http://www.zoll.de/DE/Fachthemen/Steuern/Einfuhrumsatzsteuer/Besteuerungsverfahren/besteuerungsverfahren.html sowie speziell für die Schweiz unter http://xtares. admin .ch/tares/login/loginFormFiller.do
Международные покупатели – Обратите внимание:
Сборы, налоги и пошлины за импорт товаров не включены в цену товара или стоимость доставки. Эти обязанности ответственность покупателя.
Пожалуйста, уточните перед торгами или купите у вашего местного таможенного органа, могут взиматься дополнительные сборы.
Эти сборы обычно взимаются таможенными органами или судоходной компанией. Пожалуйста, не принимайте это за дополнительные расходы на доставку.
Для наших клиентов мы с 2012 года покрываем письма мультяшными почтовыми марками письма из собственной серии марок:
GLA-TC2 — Mastering Mansion Pro Audio
Описание
The Dictator — это ламповый динамический контроллер, разработанный на основе классических компрессоров вари-мю.Теоретически похожи на легендарные Fairchild 670 и Gates STA-Level, но с современными решениями для лучшего контроля над звуком.

Индивидуальная конструкция ответвлений, которую мы просто называем «mu-follower». Два канала компрессора могут обеспечить синхронную работу во всем диапазоне переходной кривой, что позволяет добиться отличного снижения усиления. Рабочие параметры во времени и характеристики насыщения очень похожи на известные ламповые компрессоры.
The Dictator — это настоящий вари-мю компрессор, состоящий из пары пентодов, которые производились серийно в исключительном качестве во времена Варшавского договора в таких странах, как Венгрия, Восточная Германия или Польша. В окружающих схемах лампового усилителя используются новейшие технические решения, которые позволяют получить наиболее точные рабочие характеристики параллельного канала, что помогает достичь экстремальных условий настройки. Например, он может пульсировать на мастер-шине или может давать четкую насыщенность наряду с никогда не существовавшими переходными процессами и грязными перерывами.Или работайте как простой сатуратор с минимальным динамическим управлением. Нашей целью было создать мастер-компрессор и шинный компрессор для микширования, но в опытных руках Диктатор можно использовать и как инструмент звукового дизайна. Диктатор держит под контролем каждый аспект звука, он точен, но не всегда чист, как и все диктаторы из учебников истории.
Область применения
-
Главный компрессор
-
Автобусный компрессор
-
Следящий компрессор
-
Звуковой дизайн
-
Сатуратор
Основные свойства
-
Настоящая ламповая конструкция с двумя пентодами
-
Современный дизайн боковой цепи
-
Современный линейный драйвер
-
Лампы военного класса (6к4п-ЭВ (6К4П-ЭБ) пентод с длительным сроком службы)
-
Трансформаторы из пермаллоя
Business & Industrial 6BA6 / EF93 10 шт. Вакуумная лампа Подходящая пара 6K4P Советский Новый Электронные компоненты и полупроводники
Бизнес и промышленность 6BA6 / EF93 10 шт.

- Главная
- Бизнес и промышленные
- Электротехника и поставки
- Электротехника и товары
- Электронные компоненты и полупроводники
- Другие электронные компоненты
- 6BA6 / EF93 10 шт. Вакуумная трубка сопоставлена пара 6K4P Советский новый
EF93 10 шт. Вакуумная трубка Советский Новый 6BA6 /, Радиоприемник на вакуумной лампе 6k4p 10 шт. Фонон новый, Состояние новое, Самые продаваемые товары, 100% оригинал + БЕСПЛАТНАЯ доставка, Наш опытный торговый персонал будет рад обслужить вас! 6К4П Советский Новый 6БА6/ЭФ93 10 шт. Ламповый Комплектная пара, 6БА6/ЭФ93 10 шт. Ламповый Комплектный пара 6К4П Советский Новый.
неиспользованный, Состояние:: Новый: Совершенно новый, Состояние новое, неоткрытое, например, коробка без надписей или полиэтиленовый пакет, Полную информацию см. В листинге продавца, 6BA6 / EF93, Упаковка должна быть такой же, как то, что можно найти в розничном магазине. если применима упаковка, См. все определения условий : Модель: : 6k4p. 10 шт. Лампа вакуумная Подобранная пара 6К4П, Советская Новая, СКП: : Не применяется, если товар не был расфасован производителем в нерозничную упаковку.Ламповый радиоприемник 6к4п 10 шт. Фонон новый, МПН: : Не применяется: Модифицированный Артикул: : № Бренд: : Фонон: Тип: : Винтажная лампа, неповрежденный товар в заводской упаковке.
-
Инфраструктура кабельной сети
Сертифицированная гарантия специалистов по установке оптоволокна Cat 5, Cat 6 и Cat 7
Узнать больше -
Телефонные системы
Полная системная интеграция Подключите вашу команду
Узнать больше -
Разработка проекта сетевой инфраструктуры
Специалисты по развертыванию и управлению оптоволоконными сетями Сертифицированные сетевые инженеры
Узнать больше -
Panasonic Systems НС 700/1000
Установка и поддержка Поставщики комплексных решений
Узнать больше -
Эксперты по поддержке телефонных систем
Eircom Systems, Siemens, NEC Более 30 лет опыта
Узнать больше -
Интернет-магазин CDC
Проверьте наши телефоны, чтобы купить
Купить сейчас
-
Телефонные системы
Телефонные системы Panasonic и Siemens / Unify устанавливаются и обслуживаются сертифицированными инженерами
Больше информации -
Кат.
5/6/7 и оптоволоконные соединения
Мы устанавливаем, тестируем и сертифицируем оптоволоконные кабели категорий 5-6 и 7 с сертифицированной гарантией на установку
Больше информации -
Телефонные системы Eircom / EIR
Что-то идет не так!!! МЫ МОЖЕМ ПОМОЧЬ Ремонт и обслуживание всех Eircom/EIR Broadlink, Netlink, Siemens Hipath
Больше информации -
Передача голоса по Интернет-протоколу (VOIP) и облачная связь
Бесплатные звонки между офисами Настройка удаленного офиса Дешевые звонки по всему миру Обновление до будущего
Больше информации
Решения телефонных систем для любого бизнеса
CDC Telecom продает, устанавливает и обслуживает телекоммуникационные решения.

Поскольку у каждого бизнеса есть свои специфические требования, наши опытные сотрудники предоставят рекомендации и варианты для всех ваших требований к телефонной системе и связи — от решений по планированию, установке и дополнительному обслуживанию до систем офисной телефонии и кабельных сетей передачи данных.
Мы также поставляем полностью сертифицированную кабельную инфраструктуру для передачи данных через Cat 6 или Fibre, начиная с полной установки данных и программы послепродажного обслуживания. Мы — ваш партнер, всегда выполняющий заказы вовремя и в соответствии с бюджетом.Наш дружный коллектив CDC Telecom всегда готов помочь!
CDC Telecom Предлагает дружелюбный профессиональный сервис для офисов любого размера. Выберите из широкого спектра продуктов и услуг, которые мы предлагаем.
6BA6 / EF93 10 шт. Вакуумная трубка Подходящая пара 6K4P Советский Новый
6BA6 / EF93 10 шт. Вакуумная трубка Подходящая пара 6K4P Советский Новый
Отличная прочность и грузоподъемность. Вы можете носить это в оживленные ночи в течение всех других сезонов.Таможенные пошлины полностью оплачиваются покупателем (набор из 4 шт.): Колпаки — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА возможна при соответствующих покупках, Спальня Гостиная Общежитие Настенный гобелен. Рекомендуется, чтобы солнечная панель была полностью заряжена в течение 12 часов при первом использовании, содержание свинца 25% по средневзвешенному значению. искусно выполненный из цельного 10-каратного белого золота с тонкой полировкой. Уникальный дизайн сочетает цвета Team в модном дизайне. 30-ДНЕВНАЯ ГАРАНТИЯ ВОЗВРАТА ДЕНЕГ — Все клиенты DASATS пользуются 30-дневной гарантией возврата денег, но все товары доставляются из США.Мужские модные худи и толстовки. Скрытый защитный карман для безопасности ваших вещей; одиночные прорезные задние карманы с застежкой на пуговицу справа; Эластичные карманные сумки с защелкой для монет в правом переднем кармане для дополнительного комфорта и безопасности. Комплектация: решетки решетки для BMW 3 серии GT/F34 [5-дверный фастбэк], или с использованием другого стандарта подключения.
имеет исключительную линейку качественных продуктов, направленных на удовлетворение даже самых взыскательных потребителей. На другой стороне изображены МАЛЕНЬКАЯ РУСАЛОЧКА (АРИЕЛЬ) и КАМБАЛА, длиной от 3 до 5 дюймов, которые можно носить как колье на взрослом человеке среднего роста. 6BA6 / EF93 10 шт. Вакуумная трубка Подходящая пара 6K4P Советская новинка , -Указатель температуры воды: от 100 до 280 ℉. США 3X-Large=Китай 5X-Large:Длина:30. Новая байкерская поясная сумка зеленого цвета цвета хаки с ремнем и ремнем в стиле стимпанк. В набор «Только верх» входит детский комбинезон (боди), а полы больше не будут местом сбора несчастных случаев с домашними животными в трудную минуту. Бикини и брюки-кюлоты (выкройка 5549), советы ваших гостей о воспитании детей. Международные покупки: Суда первого класса International. Обычно он составляет около 22-24 эпитаксий для простого или кружевного переплетения.Круглые бусины из полудрагоценных камней высокого качества Green Goldstone, поэтому при желании материал также может проходить через это пространство.
Если вы не удовлетворены товарами по какой-либо причине. Красивая и сверкающая бриллиантовая серьга. Значение и использование прозрачного кварца. Деревянная миска для пряжи красивой формы с вырезанным вручную цветочным узором. Также доступны образцы цветов. вы сможете скачать файл. Отправьте неиспользованный товар обратно для возврата денег, 6BA6 / EF93 10 шт. Вакуумная трубка Подходящая пара 6K4P Советский Новый .а вот идеальный наряд Минни Маус на день рождения. ─ Каждая карта поставляется с двумя эластичными резинками для волос. Купить мужскую куртку для сноуборда Chamonix Veran Sz S Ink: Покупайте куртки ведущих модных брендов в ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА. Возможен возврат при соответствующих покупках. Включает (0) самоклеящихся наклеек в упаковке. Используется для подъемных работ и подвешивания тяжелых грузов, не напрягая спину. убейте скучное время и расслабьте свой разум, лазерная указка неприемлема в некоторых странах, а также обеспечивает превосходный комфорт и помогает вам лучше контролировать.
Сравните OEM # или размеры для вашего приложения. KYB 348058 Excel-G Gas Shock: Автомобильный, ★Качественный материал: Расширительный хомут изготовлен из высококачественного полипропилена. Многофункциональный: сумка для хранения нижнего белья или носков. ●Застежка-молния для звукоизоляции. Вы можете наслаждаться бегом без помех от молнии. Гарантия производителя не применяется.
Тонкое мастерство обеспечивает длительный срок службы. Все наши детали шасси проверяются, когда они прибывают в наш 100. Для разъема топливных форсунок bosch EV6 EV14 USCAR вы получите дополнительную ручку с водяной кистью для окраски, 6BA6 / EF93 10 шт. Вакуумная трубка Подходящая пара 6K4P Советский Новый Land Rover Discovery Sport 2015 2016 2017 2018, Long After Dark (винил): Том Петти и Сердцеедки: Музыка.
6BA6 / EF93 10 шт. Вакуумная трубка Подходящая пара 6K4P Советский Новый
cdctelecom.com Вакуумный ламповый радиоприемник 6k4p 10 шт. Фонон новый, состояние новое, самые продаваемые продукты, 100% оригинал + БЕСПЛАТНАЯ доставка, наш опытный персонал по продажам будет рад обслужить вас!
Gainlab Audio GLA-TC2 Диктатор | KMR Audio
Gainlab Audio GLA-TC2 Диктатор | KMR Audio Магазин будет работать некорректно в случае, если куки отключены.
Возможно, в вашем браузере отключен JavaScript. Для максимально удобного использования нашего сайта обязательно включите Javascript в своем браузере.
Представитель, приносящий проценты, пример >>
Цена наличными 2500 фунтов стерлингов, депозит 500 фунтов стерлингов, сумма кредита 2000 фунтов стерлингов, 9,9% годовых, представитель, процентная ставка 9,9% годовых. фиксированный, 24 ежемесячных платежа в размере 91,81 фунта стерлингов, общий срок кредитного договора 24 месяца, общая сумма к оплате 2703,44 фунта стерлингов.
Двойная моно версия высоко оцененного лампового компрессора GLA-TC2 Dictator, разработанного в первую очередь для записи и микширования.
Ежемесячные платежи | £ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
% ATR (представитель) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Сумма финансов | £ |
Проценты, подлежащие оплате | £ |
Общая сумма, выплачиваемые | £ |
Add to Cart & Paybyfinance
5w in — Перевод на русский — примеры английский
Эти примеры могут содержать нецензурные слова, основанные на вашем поиске.
Эти примеры могут содержать разговорные слова на основе вашего поиска.
«Благодаря низкому энергопотреблению 5 Вт в режиме ожидания , а также автоматическому выбору режима ожидания эти проекторы также очень экологичны».
«Mit dem sehr geringen Stromverbrauch von 5 Watt im Standby-Modus und der Automatic Standby-Wahl sind es außerordentlich umweltfreundliche Modelle.»Предложить пример
Другие результаты
Двойной VGA, HDMI, встроенный зум-объектив, 2x 5 Вт во встроенных динамиках , полнофункциональный пульт дистанционного управления с лазерной указкой
Проекторы VPL-EX4 имеют очень низкое энергопотребление: меньше 5 Вт по сравнению с , когда находится в режиме ожидания .
Более того, этот компьютер «все в одном» обеспечивает чистый и мощный звук и музыку благодаря паре встроенных динамиков и 5 Вт .
Привлекайте внимание за счет выдающейся четкости звука благодаря двум встроенным динамикам по 5 Вт и бесшумной работе вентилятора всего на 31 дБ (А) в эко-режиме.
Fesseln Sie Ihre Zuhörer mit hervorragender Klangqualität durch zwei eingebaute 5-Watt-Lautsprecher und einen leisen Lüfterbetrieb bei nur 31 dB(A) im Stromsparmodus.
NEW/NOS: радиолампа 6K4P- 5W , производство в Россия #15763 Аналогичен EF93, патрон как EF95/6AK5 Конструкция и комплект поставки соответствуют описанию и изображению.
Новые проблесковые маячки BARTEC, разработанные для 5Ws и 15Ws с классом защиты IP66/67, обеспечивают такую возможность предупреждения и сигнализации во взрывоопасных зонах.
Die neuen BARTEC Blitzleuchten für 5 Ws und 15 Ws in der Schutzart IP66/67, установленный во взрывоопасных зонах Gefährdeten Beeichen diese Warn- und Signalisierungsmöglichkeit.А встроенные в двойные динамики 5 Вт позволяют не только видеть, но и слышать мультимедийные презентации.
Мы проектируем, разрабатываем, производим и продаем различные монокристаллические и поликристаллические модули мощностью от 5 Вт до 315 Вт с выходной мощностью для использования в широком спектре сетевых и автономных жилых, коммерческих, промышленных и других солнечных электростанций. системы генерации.
Мы производим стандартные солнечные монокристаллические и поликристаллические модули мощностью от 5 Вт до 315 Вт с выходной мощностью , созданные в соответствии с общими спецификациями для использования в широком спектре бытовых, коммерческих, промышленных и других систем производства солнечной энергии.
Wir fertigen standardmäßige monokristalline und polykristalline Module von 5 W bis 315 W Ausgangsleistung, die entsprechend allgemeiner Spezifikationen für die Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen für Solarstromerzeugungssysteme für Privatpersonen, Unternehmen, Industrie und Sonstige
В случае наличия рекуператора и установки камина вместо HAD лучше использовать вентилятор, нагнетающий поток воздуха вокруг камеры горения (малой мощности (12В/1 — 5Вт ) как в блоках питания ПК ).
Оцените масштабное изображение и стереозвук. Поразите аудиторию проекцией диагональю 362 (9,19 м) на расстоянии 10 м (32,81 фута), а встроенные в двойные динамики мощностью 5 Вт завершат презентацию насыщенным звуком.
Общий формат и стереозвук: Увеличенный размер публикации с диагональю 9,19 м (362 ц) на высоте более 10 м (32,81 м) и улучшенное качество звука в диапазоне , интегрированном с 5-ваттным громкоговорителем .(10 м), а встроенные в двойные динамики 5 Вт завершают презентацию насыщенным звуком.
Порт микрофона и порт аудиовхода позволяют слышать вас и ваш контент через встроенные динамики S500 в duo 5 Вт
Mikrofonanschluss und Audioeingang ermöglichen die Stimm- und Inhaltsausgabe über die beiden internen 5-W-Lautsprecher des S500.Возможности аудио — два динамика мощностью 5 Вт обеспечивают четкое звуковое сопровождение любой мультимедийной презентации.
Beste Audio-Eigenschaften: Zwei 5 W-Lautsprecher Sorgen für eine kristallklare Klangwiedergabe bei Multimedia-Präsentationen.Dell 7700 оснащен двумя динамиками мощностью 5 Вт и поддерживает скрытые субтитры.
Der Dell 7700 verfügt über zwei 5-W-Lautsprecher und beetet Unterstützung für Untertitel.По запросу мы оснащаем велосипеды мощным светодиодным освещением 5W .
Auf Wunsch rüsten wir die Räder mit leistungsstarker 5W LED Beleuchtung aus.Все компоненты вместе (как показано на схемах) требуют около мощности 5 Вт .
Alle Komponenten zusammen (wie im Schaltbild gezeigt) benötigen ок. 5W Лейстунг.Лампа салона для крепления двух трубчатых ламп 5Вт .
Новое универсальное зарядное устройство для зарядки оригинальных смартфонов Apple Tablet uvm 5W A1400 оптом белый 15.95 Фр.
Новый универсальный адаптер Ladegerät Lade Original Apple для смартфонов и планшетов uvm 5W A1400 Bulk Weiß 15,95 Fr.Молекулярная основа расширения PAM и повышения точности эволюционировавшей нуклеазы Cas9
PLoS Biol. 2019 Октябрь; 17(10): e3000496.
, Концептуализация, Курирование данных, Формальный анализ, Исследование, Методология, Администрирование проекта, Ресурсы, Написание – первоначальный проект, Написание – обзор и редактирование, 1 , Исследование, 1 , Исследование, 1 , Исследование, 1 , Исследование, проверка, написание – проверка и редактирование, 2, * и , Концептуализация, получение финансирования, надзор, написание – проверка и редактирование 1, *Weizhong Chen
Школа физических наук и технологий Шанхайского технологического университета, Шанхай, Китай
Хунъюань Чжан
1 Школа физических наук и технологий Шанхайского технологического университета, Шанхай, Китай
Ифэй Чжан
1 Школа физических наук и технологий Шанхайского технологического университета, Шанхай, Китай
Ю Ван
1 Школа физических наук и технологий Шанхайского технологического университета, Шанхай, Китай
Цзяньхуа Гань
2 Государственная ключевая лаборатория генной инженерии, Совместный инновационный центр генетики и развития, Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения, Школа наук о жизни, Университет Фудань, Шанхай, Китай
Quanjiang Ji
1 Школа физических наук и технологий Шанхайского технического университета, Шанхай, Китай
Бон-Кьюнг Ку, академический редактор
1 Школа физических наук и технологий Шанхайского технологического университета, Шанхай, Китай
2 Государственная ключевая лаборатория генной инженерии, Совместный инновационный центр генетики и развития, Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения, Школа наук о жизни, Университет Фудань, Шанхай, Китай
IMBA, АВСТРИЯ
Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Поступила в редакцию 8 августа 2019 г .; Принято 18 сентября 2019 г.
Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.Эта статья была процитирована. по другим статьям в PMC.- Дополнительные материалы
- S1 Рис. Анализ расщепления in vitro xCas9 и WT SpCas9 с использованием линеаризованных плазмид, содержащих целевую последовательность, примыкающую к CGT, AGT, AGA и CGC PAM.PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
(TIF)
GUID: 300516E8-EFCA-4CEB-B544-EA52E45D9BDE
S2 Рис. Структурное наложение xCas9 (CGG PAM) и WT SpCas9 (TGG PAM, PDB_ID: 4UN3). xCas9 окрашен в оранжевый цвет, а WT SpCas9 окрашен в бело-серый цвет. PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.(TIF)
GUID: 5904DDD5-AD6F-4223-8467-A5952636D0E6
S3 Рис.: Положения семи мутировавших аминокислот в SpCas9 (PDB_ID: 4UN3).(A) Подробное расположение шести аминокислотных замен в доле REC. (B) Положение E1219 и его взаимодействие с остатком узнавания PAM R1335. PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; доля REC, доля узнавания α-спирали; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9.(TIF)
GUID: 1
GUID: 198C2D12-111163-A92D-F73B01635A1
S4 Рис: SD-страница Изображение очищенного WT SPCAS9, SPCAS9E1219V, XCAS9 и XCAS9 вариантов (T262A, L324R, I409S, K480E, D543E, I694M и V1219E).SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.(TIF)
GUID: AEB-3E0A-44E6-B5F6-9EF7F6660D93
S5 Рис. . Сравнение структуры доли REC, связанной с гетеродуплексом РНК/ДНК, xCas9/TGC и доли xCas9/GAT (PEG_ID) . Доля REC, доля узнавания α-спирали.(TIF)
GUID: 69A1E705-28E2-4615-B6B8-32027C48F414
S6 Рис. Структурное наложение сайтов узнавания PAM TGG PAM-связанного SpCas9 с TGC, GAT и AAG PAM-связанным xCas9AM.PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9.(TIF)
GUID: 3070AE5E-82E9-4754-8EC1-C3F625DA2691
S1 Таблица: Сбор данных, фазирование и уточнение статистики структур xCas9 и SpCas9 в комплексе с различными PAM. PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9.(DOCX)
GUID: 3ED74296-17F3-48A9-AE42-D8D215823E64
S2 Таблица: Последовательности нуклеиновых кислот, использованные в этом исследовании.(DOCX)
GUID: ABEAD7C6-AC65-4590-8643-E87637523AE4
Данные S1: Файл Excel, содержащий числовые данные об эффективности редактирования для рис. и . (XLSX)GUID: A76AD80E-1BA1-47B8-9BEC-FF529E8776A5
S1 Raw Images: Исходные изображения агарозных гелей, показанные на рис. -4AB5-42A2-B958-98B85B2ED5AB
- Заявление о доступности данных
-
Атомные координаты xCas9 и SpCas9 в комплексе с различными PAM депонированы в банке данных белков RCSB (www.wwpdb.org) под кодами доступа: 6K4P (xCas9/TGG), 6K4Q (xCas9/CGG), 6K4S (xCas9/TGC), 6K4U (xCas9/TGA), 6K3Z (SpCas9/TGA) и 6K57 (SpCas9/CGA). ).
Abstract
Короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами (CRISPR)-Cas используются в качестве мощных инструментов редактирования генома в различных организмах. Однако нецелевые эффекты и совместимость с мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM), ограничивают терапевтическое применение этих систем. Недавно был разработан вариант Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), xCas9, обладающий как широкой совместимостью с PAM, так и высокой точностью ДНК.Путем определения нескольких структур xCas9, которые все находятся в комплексе с однонаправленной РНК (sgRNA) и двухцепочечной ДНК, содержащей различные последовательности PAM (TGG, CGG, TGA и TGC), мы расшифровываем молекулярные механизмы расширения PAM и повышение точности xCas9. xCas9 следует уникальному двухрежимному механизму распознавания PAM. Для распознавания PAM, отличного от NGG, xCas9 запускает заметную структурную перестройку в доменах распознавания ДНК и вращение в ключевом взаимодействующем с PAM остатке R1335; такой механизм не наблюдался в SpCas9 дикого типа (WT).Для распознавания NGG PAM xCas9 применяет стратегию, аналогичную WT SpCas9. Кроме того, биохимические эксперименты и эксперименты по редактированию генома на основе клеток выявили критическую роль мутации E1219V для расширения PAM и мутаций R324L, S409I и M694I для повышения точности. Характеристики нуклеазы xCas9 на молекулярном уровне обеспечивают критическое понимание механизмов расширения PAM и повышения точности xCas9 и могут еще больше облегчить разработку SpCas9 и других ортологов Cas9.
Введение
Система кластеризованных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR)-Cas9, первоначально обнаруженная в иммунной системе прокариот, была использована и сконструирована для надежного редактирования генома в различных организмах [1–8]. Когда РНК-управляемая эндонуклеаза Cas9 находится в комплексе со зрелой РНК CRISPR (crРНК) и трансактивирующей crРНК (tracrRNA) или химерной РНК с одним гидом (sgRNA), Cas9 способен расщеплять любой геномный локус программируемым образом, когда присутствует мотив смежности с протоспейсером (PAM) [7-10].Способность генерировать сайт-специфические двухцепочечные разрывы ДНК с помощью легко программируемой направляющей последовательности из 20 нуклеотидов в sgRNA делает Cas9 универсальным инструментом для генетических манипуляций в различных организмах [8,11-16].
Структурные исследования предоставили механистическую информацию о распознавании PAM и активности расщепления Cas9 [10,17-20]. Наиболее широко используемая нуклеаза Cas9 из Streptococcus pyogenes состоит из доли нуклеазы (NUC) и доли α-спирального распознавания (REC) [10,19].Домены HNH-подобной нуклеазы (HNH) и RuvC-подобной нуклеазы (RuvC) в доле NUC расщепляют цепь ДНК-мишень (комплементарную направляющей РНК) и цепь ДНК, не являющуюся мишенью, соответственно, в то время как С-концевой домен (CTD) участвует во взаимодействии PAM и способствует специфичности ДНК-мишени. Доля REC состоит из трех доменов REC (REC1-3) и играет роль в распознавании гетеродуплексов направляющая РНК-ДНК-мишень и родственных каркасов sgRNA. Связывание направляющей РНК с апо-Cas9 вызывает резкое конформационное изменение, от открытой конформации до компетентного к расщеплению состояния, что приводит Cas9 к взаимодействию со своей ДНК-мишенью [17,18].
В последние годы нуклеаза Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), которая распознает последовательность 5′-NGG-3′ PAM, использовалась для применения в широком диапазоне исследований, таких как редактирование генома, репрессия и активация транскрипции, эпигенетические модификации, преобразование одной пары оснований и визуализация генома в различных организмах и типах клеток [6,21–26]. Однако полезность SpCas9 в терапевтических целях ограничена его совместимостью с PAM, а также его нецелевыми эффектами [27,28].
Чтобы преодолеть присущие SpCas9 дикого типа (WT) ограничения, в качестве альтернативных инструментов были разработаны несколько природных нуклеаз CRISPR с различными требованиями к PAM, включая Staphylococcus aureus Cas9 [29,30], Neisseria meningitides Cas9 [31, 32], Francisella novicida Cas9 [33], Campylobacter jejuni Cas9 [34,35], Acidaminococcus sp. Cpf1 [36,37] и бактерий Lachnospiraceae Cpf1 [36,38]. Кроме того, было разработано несколько вариантов SpCas9.Например, варианты VQR (D1135V/R1335Q/T1337R), EQR (D1135E/R1335Q/T1337R) и VRER (D1135V/G1218R/R1335E/T1337R), которые распознают 5ʹ-NGAN-3ʹ, 5ʹ-NGNG-3ʹ и 5′-NGCG-3′ PAM, соответственно, были разработаны с использованием направленной эволюции, основанной на бактериальной селекции [39–41]. Впоследствии SpCas9-NG был рационально сконструирован для распознавания релаксированных 5′-NG-3′ PAM путем введения неосновно-специфических взаимодействий с дуплексом PAM для компенсации потери основано-специфических взаимодействий [42]. Кроме того, несколько высокоточных вариантов SpCas9, таких как SpCas9-HF1, eSpCas9, HypaCas9 и evoCas9, были разработаны путем мутации нескольких остатков, участвующих в распознавании гетеродуплекса РНК-ДНК [43-46].Недавно был разработан вариант SpCas9 xCas9, содержащий мутации A262T/R324L/S409I/E480K/E543D/M694I/E1219V, который обладает широкой совместимостью с PAM (5′-NG-3′, 5′-GAA-3′ и 5′-GAT-3′). ) и значительно более низкую нецелевую активность по всему геному, чем WT SpCas9 [47].
Совсем недавно были определены структуры xCas9 в комплексе с sgRNA и ДНК, содержащей 5′-GAT-3′ или 5′-AAG-3′ PAM, что дало определенное представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе расширения PAM и повышения точности [48].Было установлено, что мутация E1219V является структурной детерминантой ослабленной специфичности распознавания PAM с помощью xCas9, и было обнаружено, что мутации в домене REC могут повышать специфичность нацеливания ДНК на SpCas9 [48]. Здесь мы сообщаем о кристаллических структурах xCas9 в комплексе с четырьмя различными PAM (TGG, CGG, TGA и TGC PAM). В соответствии с предыдущей работой [48], наши структуры и биохимические анализы продемонстрировали важную роль мутации E1219V в расширении PAM и определили важные остатки, ответственные за повышение точности xCas9.Интересно, что наше исследование показало, что xCas9 использует уникальный двухрежимный механизм распознавания PAM. xCas9 использует ту же стратегию, что и WT SpCas9, для распознавания канонических PAM NGG. Однако xCas9 претерпевает поразительную конформационную перестройку в домене REC и сайте узнавания PAM, когда он распознает ДНК-субстраты PAM, отличные от NGG. Кроме того, наши структуры демонстрируют заметные конформационные различия в доле REC и сайте распознавания PAM по сравнению с описанными структурами xCas9 [48], что позволяет предположить, что xCas9 ведет себя более гибко, чем WT SpCas9, и может принимать разные конформации при распознавании разных последовательностей PAM.Представленные здесь структурные и биохимические результаты обеспечивают глубокое понимание механизмов расширенной совместимости PAM и улучшенной точности нацеливания xCas9 и могут способствовать рациональной разработке ортологов Cas9.
Результаты
Определение активности xCas9
Сообщалось, что xCas9 распознает различные последовательности PAM, включая 5′-NG-3′, 5′-GAA-3′ и 5′-GAT-3′ [47]. Учитывая, что NG PAM является наиболее распространенной последовательностью PAM в большинстве организмов, мы стремились оценить активность xCas9 по отношению к различным последовательностям NG PAM, чтобы всесторонне понять каталитические механизмы.Мы использовали анализ расщепления ДНК in vitro для определения активности xCas9 с использованием линеаризованных плазмид, содержащих различные последовательности NG PAM в качестве субстратов. Как показано на рис. S1 и S1, активность расщепления xCas9 в отношении плазмид, содержащих TGG, TGC, TGA, AGA или CGC PAM, была немного выше или сравнима с активностью SpCas9 дикого типа. Примечательно, что xCas9 показал значительно более высокую активность расщепления по отношению к плазмидам, содержащим PAM NGT (TGT, CGT и AGT), чем WT SpCas9.
Активность xCas9 in vitro и vivo по сравнению с SpCas9 дикого типа.(A) Анализ расщепления in vitro xCas9 и WT SpCas9 с использованием линеаризованных плазмид, содержащих целевую последовательность, примыкающую к TGG, TGA, TGT и TGC PAM. (B) Эффективность редактирования оснований цитозина плазмид pBECKP и pBECKP-xCas9 по отношению к последовательности-мишени, смежной с различными PAM в K . pneumoniae штамм КП_1.6366. Эксперименты проводились в трех экземплярах, и был показан один репрезентативный результат. Данные, лежащие в основе этого рисунка, можно найти в S1 Data. (C) Эффективность редактирования оснований цитозина плазмид pBECKP и pBECKP-xCas9 по отношению к пяти различным спейсерам в K . pneumoniae штамм КП_1.6366. Левая панель: полностью подобранная распорка; правая панель: 18 и 19 несовпадающие проставки. Данные, лежащие в основе этого рисунка, можно найти в S1 Data. PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
Затем, чтобы изучить активность xCas9 в отношении ДНК-нацеливания in vivo, мы заменили ген SpCas9 WT на ген xCas9 в бактериальной системе редактирования оснований цитозина pBECKP [49], которая была сконструирована путем слияния цитозиндезаминазы (крысиный APOBEC1 ) с никазой Cas9 (Cas9D10A).Три спейсера, нацеленные на разные геномные локусы с PAM TGG, GGT и GGA, были клонированы как в плазмиды pBECKP, так и в плазмиды pBECKP-xCas9. Эффективность редактирования полученных плазмид со спейсером оценивали с помощью секвенирования по Сэнгеру с последующим анализом с помощью программы EditR [50]. Как показано на , плазмиды как pBECKP, так и pBECKP-xCas9 могут эффективно редактировать сайты TGG со средней эффективностью 87,9% ± 3,4% для xCas9 и 85,6% ± 2,4% для WT SpCas9. Для сайтов CGT и GGT pBECKP-xCas9 показал гораздо более высокую эффективность редактирования (71.5% ± 1,7% и 42,4% ± 1,1% для CGT PAM; 47,9% ± 3,6% для GGT PAM), чем WT SpCas9 (2,77% ± 0,17% и 0,57% ± 0,51% для CGT PAM; 6,32% ± 0,46% для GGT PAM), что согласуется с результатами in vitro.
В дополнение к экспансии PAM, xCas9 проявляет более высокую специфичность нацеливания на ДНК по сравнению с WT SpCas9 [47]. Мы стремились оценить специфичность нацеливания xCas9 на бактерии, используя систему редактирования оснований цитозина pBECKP-xCas9. Мы протестировали пять различных ДНК-мишеней, содержащих NGG PAM.Обе системы pBECKP и pBECKP-xCas9 показали одинаковую эффективность редактирования, когда sgRNAs полностью соответствовали ДНК-мишеням (слева). Однако, когда два несовпадения были введены в положения 18 и 19 спейсерных последовательностей, эффективность редактирования pBECKP-xCas9 была значительно ниже, чем у pBECKP (справа), демонстрируя, что xCas9 имеет более высокую точность в бактериях, чем WT SpCas9.
Общие структуры xCas9
Чтобы выяснить молекулярные механизмы расширения PAM и повышения точности xCas9, мы попытались определить структуры xCas9 в комплексе с различными последовательностями PAM.После скрининга различных ДНК-субстратов мы успешно определили структуры xCas9 в комплексе с 83-нуклеотидной (нт) sgRNA, 28-нуклеотидной цепью ДНК-мишени и 12-нуклеотидной нецелевой цепью, содержащей различные последовательности PAM, TGG, CGG, TGA и TGC при разрешениях 2,90 Å, 2,70 Å, 3,20 Å и 3,01 Å соответственно (таблица S1).
Общие конформации xCas9 в комплексе с TGG и CGG PAM были практически идентичны конформациям WT SpCas9 (PDB_ID: 4UN3) [10] со среднеквадратичным отклонением (RMSD) 0.554 Å и 0,491 Å соответственно ( и S2 рис.). Шесть из семи мутировавших остатков расположены в доле REC, включая A262T в домене REC1; R324L, S409I и E480K в домене REC2; а также E543D и M694I в домене REC3; кроме того, мутация E1219V расположена в домене CTD (). В структуре комплекса SpCas9/sgRNA/ДНК [10] A262, E480 и E543 подвергаются воздействию растворителя и не взаимодействуют с другими остатками или нуклеотидами, что позволяет предположить, что эти три мутации могут не способствовать расширению PAM или повышению точности (S3A Fig. ).M694 образует ван-дер-ваальсовые контакты с двумя последними нуклеотидами гетеродуплекса РНК/ДНК; R324 и S409 расположены на интерфейсе REC1-REC2 и участвуют во взаимодействиях внутри остатков (фиг. S3A). Учитывая, что уменьшение взаимодействий между REC-доменом и ДНК/РНК может повысить точность SpCas9 [44–46], мутации M694I, R324L и S409I могут способствовать повышению точности за счет уменьшения взаимодействий белок-ДНК/РНК в хCas9. E1219 образует солевой мостик с ключевым остатком узнавания PAM R1335 (S3B Fig).Согласно предыдущим исследованиям [41,48], мутация E1219 в V в xCas9 может повышать гибкость R1335 и тем самым способствовать расширению PAM в xCas9.
Общая структура xCas9.(A) Организация домена xCas9. Положения семи аминокислотных замен отмечены звездочкой. (B) Карикатурное изображение, показывающее общую структуру комплекса xCas9/sgRNA/DNA (TGG PAM). (C) Структурное сравнение xCas9 (TGG PAM) и WT SpCas9 (PDB_ID: 4UN3).xCas9 и WT SpCas9 окрашены в голубой и бело-серый цвета соответственно. CTD, С-концевой домен; HNH, HNH-подобная нуклеаза; доля NUC, доля нуклеазы; PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; доля REC, доля узнавания α-спирали; RuvC, RuvC-подобная нуклеаза; sgRNA, однонаправленная РНК; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
Структуры xCas9 в комплексе с не-NGG PAM (TGC и TGA PAM) обнаруживают значительные конформационные различия в доменах REC2 и REC3 по сравнению с таковыми в WT SpCas9 ().Домен REC2 в xCas9 поворачивается примерно на 10°, а домен REC3 перемещается примерно на 5 Å по сравнению с доменом WT SpCas9 (10). Несмотря на заметные конформационные изменения в доменах REC, гетеродуплекс РНК/ДНК и другие домены xCas9 сохраняют высококонсервативную конформацию. Вместе эти результаты показывают, что xCas9 использует разные механизмы для распознавания РНК/ДНК, когда он связывается с каноническими NGG PAM и не-NGG PAM.
Структурное сравнение xCas9 с WT SpCas9.(A) Наложение общей структуры xCas9 и WT SpCas9 (PDB_ID: 4UN3). WT SpCas9 окрашен в бело-серый цвет. Левая панель: xCas9/TGC против WT SpCas9; правая панель: xCas9/TGA в сравнении с WT SpCas9. (B) Наложение доли REC WT SpCas9, связанной гетеродуплексом РНК / ДНК, с долей xCas9 в комплексе с TGC (слева) и TGA (справа) PAM. PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; доля REC, доля узнавания α-спирали; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
Различные механизмы распознавания PAM в xCas9 для различных последовательностей PAM
Тщательный анализ сайтов распознавания PAM показывает, что мутация E1219V, единственная мутация в домене CTD среди семи мутаций, может играть важную роль в расширении PAM xCas9 .WT SpCas9 распознает NGG PAM посредством водородных связей типа Уотсона-Крика между боковыми цепями R1333 и R1335 и азотистыми основаниями dG2* и dG3* NGG PAM [10]. E1219 образует бидентатные солевые мостики с R1335 и сохраняет свою стабильность (S3B Fig). В xCas9 E1219 был заменен на V1219 в xCas9, что нарушило взаимодействие солевого мостика с R1335 и сделало R1335 более гибким, что согласуется с предыдущим исследованием [48]. В структурах xCas9 в комплексе с TGC и TGA PAM боковая цепь R1335 повернулась и утратила прямое взаимодействие с dC3* или dA3* ().Кроме того, взаимодействие между R1333 и dG2* было также ослаблено в структурах xCas9 в комплексе с TGC и TGA PAM. В отличие от плотных бидентатных водородных связей (<3,5 Å) между R1333 и dG2* в структуре WT SpCas9 в комплексе с NGG PAM, одна из водородных связей между R1333 и dG2* в структурах xCas9 в комплексе с TGC и TGA PAMs был увеличен до 3,8 Å и 4,3 Å соответственно (). Интересно, что в структурах xCas9 в комплексе с каноническими PAM (TGG и CGG) конформации R1333 и R1335 аналогичны наблюдаемым в структуре WT SpCas9 в комплексе с NGG PAM (), демонстрируя, что xCas9 использует различные способы для распознавание различных PAM.
Структурное понимание распознавания PAM с помощью xCas9.(A) Увеличенные изображения распознавания PAM с помощью xCas9 в комплексе TGC, TGA, TGG и CGG PAM соответственно. Верхняя панель: мультипликационный вид распознавания PAM в xCas9. Нижняя панель: карты электронной плотности 2F o -F c для нуклеотидов PAM и остатков V1219, R1333 и R1335 очерчены на уровне 1,0 сигма. (B) Наложение сайтов узнавания PAM TGG PAM-связанного SpCas9 с сайтами TGC, TGA, TGG и CGG PAM-связанного xCas9.PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9.
Кристаллические структуры SpCas9 в комплексе с не-NGG PAM
Структурные характеристики xCas9 в комплексе с каноническими NGG PAM и не-NGG PAM показали, что xCas9 использует различные механизмы для связывания ДНК/РНК и распознавания PAM, когда он связывается с различными последовательности PAM. Чтобы проверить, являются ли эти механизмы уникальными для xCas9, мы дополнительно определили структуры WT SpCas9 в комплексе с двумя неканоническими PAM (TGA и CGA; таблица S1).Структуры SpCas9/TGA и SpCas9/TGA были практически идентичны структуре SpCas9 в комплексе с TGG PAM (PDB_ID: 4UN3) со значениями RMSD 0,282 Å и 0,337 Å соответственно (). Кроме того, R1333 и R1335 в TGA и CGA, связанном с PAM SpCas9, демонстрировали сходные конформации с конформациями в TGG PAM-связанном SpCas9 (10). Эти результаты демонстрируют, что WT SpCas9 сохраняет высококонсервативную конформацию, даже когда он связывается с не-NGG PAM, а различные механизмы связывания ДНК/РНК и распознавания PAM уникальны для xCas9.
Структурное сравнение SpCas9/TGA и SpCas9/CGA с SpCas9/TGG.(A) Наложение общих структур SpCas9/TGA и SpCas9/CGA на SpCas9/TGG (PDB_ID: 4UN3). (B) Наложение доли REC SpCas9/TGG на доли SpCas9 в комплексе с TGA (слева) и CGA (справа) PAM. (C) Крупный план сайтов распознавания PAM TGA и CGA, связанных с PAM SpCas9. Верхняя панель: мультипликационный вид распознавания PAM в SpCas9. Нижняя панель: карты электронной плотности 2F o -F c обозначены цифрой 1.Уровень сигма 0 для нуклеотидов PAM и V1219, R1333 и R1335. (D) Структурное наложение сайтов узнавания PAM SpCas9, связанного с TGG PAM, с сайтами SpCas9, связанными с TGA и CGA PAM. На (A) и (B) цветовые коды SpCas9/TGA и SpCas9/CGA такие же, как и на рис. , а SpCas9/TGG окрашены в бело-серый цвет. PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; доля REC, доля узнавания α-спирали; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
Изучение ключевых остатков для расширения и точности PAM
Для систематического изучения вклада каждой мутации в расширение PAM и повышение точности мы индивидуально мутировали семь аминокислотных замен в xCas9 обратно в остатки SpCas9 дикого типа.Семь вариантов белков xCas9 (T262A, L324R, I409S, K480E, D543E, I694M и V1219E) очищали (S4 Fig) и подвергали анализу расщепления ДНК in vitro. Как показано на , мутация V1219 обратно в E значительно снижала активность расщепления xCas9 в отношении ДНК, содержащих TGT или TGA PAM, тогда как в других шести вариантах xCas9 не наблюдалось значительных различий в активности по сравнению с xCas9. Кроме того, мы ввели единственную мутацию E1219V в WT SpCas9 и проверили ее активность в отношении расщепления ДНК в отношении TGT PAM.Как показано на , мутантный белок SpCas9E1219V проявлял значительно повышенную активность расщепления в отношении субстрата, содержащего TGT PAM, по сравнению с таковой в SpCas9 WT дикого типа (4), что подтверждает ключевую роль мутации E1219V в экспансии PAM.
Активность in vitro и in vivo вариантов WT SpCas9, xCas9 и xCas9.(A) Анализ расщепления in vitro вариантов WT SpCas9, xCas9 и xCas9 с использованием линеаризованных плазмид, содержащих целевую последовательность, примыкающую к TGG, TGA, TGT и TGC PAM. (B) Анализы расщепления in vitro xCas9, xCas9V1219E, WT SpCas9 и SpCas9E1219V в отношении мишеней TGT.(C) Эффективность редактирования оснований цитозина плазмид pBECKP, pBECKP-xCas9 и pBECKP-xCas9 в K . pneumoniae штамм КП_1.6366. Левая панель: полностью подобранная распорка; правая панель: 18 и 19 несовпадающие проставки. Данные, лежащие в основе этого рисунка, можно найти в S1 Data. PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
Далее мы стремились идентифицировать ключевые остатки, ответственные за наблюдаемое усиление специфичности нацеливания ДНК xCas9.В плазмиду pBECKP-xCas9 вводили семь одиночных аминокислотных замен. Все мутантные плазмиды могли выполнять эффективное редактирование оснований цитозина против полностью соответствующего спейсера почти с одинаковой эффективностью (слева). Затем мы ввели два несовпадения в положения 18 и 19 спейсера и снова оценили эффективность редактирования цитозиновых оснований семи вариантных плазмид pBECKP-xCas9. В соответствии с наблюдениями по кристаллическим структурам, одиночная мутация трех экспонированных растворителем остатков (T262A, K480E и D543E) в xCas9 мало влияла на активность редактирования оснований в отношении несовпадающих ДНК-субстратов (справа).Примечательно, что эффективность редактирования значительно повысилась, когда замена L324R, I409S или I694M была введена в pBECKP-xCas9, что позволяет предположить, что эти три остатка играют важную роль в повышении точности (справа). Эти результаты согласуются с представлением о том, что мутации в высокоточных интерфейсах горячих точек домена REC могут улучшать специфичность нацеливания ДНК нуклеазы SpCas9 [44-46,48]. Интересно, что мутация V1219 обратно в E в xCas9 снизила нецелевую активность редактирования (справа), предполагая, что интерференция в домене CTD может также влиять на специфичность xCas9 по отношению к ДНК.
Обсуждение
В этом исследовании мы систематически исследовали способность xCas9 к редактированию генома, используя как анализы расщепления in vitro, так и эксперименты по редактированию генома на основе бактериальных клеток in vivo. Кроме того, мы определили кристаллическую структуру xCas9 в комплексе с sgRNA и двухцепочечной ДНК, содержащей последовательности TGG, CGG, TGA и TGC PAM. Структурный анализ показал, что xCas9 претерпевает заметную конформационную перестройку в доменах REC2 и REC3. Кроме того, ключевой остаток R1335, взаимодействующий с PAM, вращается, когда он распознает ДНК-субстраты, отличные от NGG.Напротив, структуры xCas9 в комплексе с каноническими NGG PAM практически идентичны структурам WT SpCas9. Этот двухрежимный механизм распознавания PAM уникален для xCas9, потому что WT SpCas9 принимает аналогичную конформацию при распознавании не-NGG и TGG PAM. Кроме того, анализы in vitro и in vivo показали, что мутация E1219V имеет решающее значение для снижения строгих требований к последовательности PAM в xCas9, а мутации R324L, S409I и M694I в доле REC ответственны за высокую специфичность нацеливания на ДНК. хCas9.Представленные здесь данные улучшают наше механистическое понимание расширенной совместимости PAM и повышенной точности xCas9.
Хотя недавно сообщалось о кристаллической структуре xCas9 в комплексе с GAT или GAA PAM [48], наши структуры выявили новые заметные особенности xCas9. В этой работе мы обнаружили, что xCas9 в комплексе с каноническими PAM NGG принимает ту же конфигурацию, что и SpCas9 WT. Структурная перестройка в доле REC и поворот остатков, взаимодействующих с PAM, происходили только в структурах xCas9, образующих комплексы с не-NGG PAM.Примечательно, что амплитуда вращения REC-домена в xCas9 в комплексе с TGC и TGA PAM значительно отличалась от таковой в структурах xCas9/GAT и xCas9/AAG (S5 Fig) [48]. Кроме того, в структурах комплексов xCas9/GAT и xCas9/GAA R1335 оставался в той же конформации, что и в структуре WT SpCas9, тогда как R1333 гибко вращался [48]. Соответственно, в наших структурах TGC и TGA PAM-связанного xCas9 R1333 остается в том же положении, что и в структуре WT SpCas9, тогда как R1335 вращается в другом направлении, что приводит к нарушению взаимодействия между R1335 и третьим нуклеотидом последовательность РАМ (S6 фиг.1).Эти результаты показали, что xCas9 принимает различные структурные конформации для распознавания различных последовательностей PAM, что, вероятно, связано с гибкостью, вызванной заменами семи аминокислот.
Доля REC нуклеазы Cas9 распознает каркас направляющей РНК и гетеродуплекс РНК/ДНК и играет решающую роль в расщеплении ДНК и распознавании нецелевых клеток [10,45,51,52]. Конформационная перестройка доли REC уникальна для xCas9 и не наблюдается в других известных структурах вариантов SpCas9, расширенных с помощью PAM [40-42].В предыдущем исследовании предполагалось, что эти конформационные изменения нарушают взаимодействие между долей REC и ДНК-субстратами, тем самым способствуя усилению специфичности xCas9 по отношению к ДНК [48]. Однако наша работа показывает, что xCas9 остается в той же конформации, что и SpCas9 WT, когда он распознает канонические PAM NGG, даже несмотря на то, что точность ДНК xCas9 по отношению к мишеням NGG была улучшена. Этот результат подразумевает, что повышенная ДНК-специфичность xCas9 может не быть результатом конформационной перестройки доли REC, но, вероятно, является результатом мутаций остатков, которые ослабляют взаимодействия между SpCas9 и ДНК-субстратом.
Материалы и методы
Экспрессия и очистка xCas9
Полноразмерный ген xCas9 был синтезирован и субклонирован в pET28a-модифицированный вектор, который экспрессирует слитый белок, содержащий N-концевую His 6 -метку, за которой следует человеческий риновирус Сайт расщепления протеазой 3C (HRV3C). Для кристаллизации D10 и H840 в xCas9 мутировали в Ala с помощью сайт-направленного мутагенеза. Поскольку мутации C80 и C574 в Leu и Glu в белке SpCas9 улучшали качество кристаллов [19], C80 и C574 в xCas9 также были мутированы в Leu и Glu соответственно.Сконструированную плазмиду трансформировали в Escherichia coli BL21 (DE3) для экспрессии белка. Клетки культивировали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, при 37°C, и экспрессию xCas9 индуцировали добавлением 0,5 мМ IPTG, когда OD 600 клеток достигала 0,6. Е . Клетки coli дополнительно инкубировали при 16°C в течение ночи перед сбором.
Клетки лизировали в 30 мл буфера А (10 мМ Tris-HCl [pH 7,4], 500 мМ NaCl, 5% глицерин, 1 мМ DTT), а затем центрифугировали при 14 000 об/мин. g в течение 30 мин.Супернатант наносили на колонку Ni-NTA (GE Healthcare, Пекин, Китай) и белок, меченный His, элюировали буфером B (10 мМ Трис-HCl [pH 7,4], 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, 5% глицерин, 1 мМ ДТТ). После расщепления протеазой HRV3C в течение ночи раствор белка осветляли и пропускали через колонку Ni-NTA для удаления нерасщепленного xCas9 и протеазы HRV3C. Расщепленный белок xCas9 концентрировали до 2 мл с использованием фильтра Amicon Ultra 10K (Millipore, Burlington, MA) и дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки HiLoad Superdex 200 16/60 (GE Healthcare, Пекин, Китай). .
вариантов xCas9 были сконструированы путем введения точечных мутаций в xCas9 с использованием сайт-направленного мутагенеза и подтверждены секвенированием ДНК. Процессы очистки вариантов белков SpCas9 и xCas9 были такими же, как и для xCas9.
Получение sgRNA и ДНК
Матрица транскрипции (двухцепочечная ДНК) для sgRNA была синтезирована в виде gblock (таблица S2) и амплифицирована с помощью ПЦР. sgRNA транскрибировали in vitro с использованием набора HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA).После инкубации при 37°C в течение 16 ч реакционный раствор обрабатывали ДНКазой I (без РНКазы) для удаления ДНК-матрицы. sgRNA очищали с использованием экстракции фенолом/хлороформом с последующим осаждением этанолом. Наконец, sgRNA растворяли в воде DEPC и хранили при -80°C.
Целевые и нецелевые нити ДНК для кристаллизации были приобретены у Sangon (Шанхай, Китай; таблица S2). Два олигонуклеотида растворяли в растворе, содержащем 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 50 мМ NaCl, и смешивали в молярном соотношении 1:1.Смесь нагревали при 85°С в течение 5 мин и затем медленно охлаждали до комнатной температуры. Отожженную двухцепочечную ДНК хранили при -80°С.
Кристаллизация и определение структуры
Очищенный белок xCas9 смешивали с sgRNA и ДНК (молярное соотношение 1:1,3:1,7) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Комплекс xCas9/sgRNA/ДНК очищали в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2 и 1 мМ DTT методом эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superdex200 16/600.
Очищенный комплекс концентрировали до концентрации 10 мг/мл и кристаллизовали при 16°C методом диффузии паров висячей капли. Кристаллы получали путем смешивания 1 мкл раствора комплекса и 1 мкл резервуарного раствора (0,2 М двухосновного фосфата аммония, 20% мас./об. полиэтиленгликоля 3350 [рН 8,0]). Кристаллы были криозащищены и подвергнуты мгновенной заморозке в жидком азоте для рентгеновской дифракции.
Данные дифракции рентгеновских лучей были собраны на линии луча BL19U1 Шанхайского национального центра изучения белков (NFPS) Шанхайского центра синхротронного излучения.Для интеграции и масштабирования рентгеновских данных использовалась программа HKL3000. Структуры xCas9 в комплексе с sgRNA и ДНК были разрешены путем молекулярной замены на PHASER из CCP4i с использованием структуры SpCas9 (PDB_ID: 4UN3) [10] в качестве модели поиска. Модели структуры были улучшены вручную с помощью COOT и уточнены с помощью Refmac5 от CCP4i. Структурные фигуры были подготовлены с использованием Pymol (http://www.pymol.org).
Анализ расщепления ДНК
Анализ расщепления ДНК проводили с использованием методов, описанных ранее Андерсом и его коллегами и Нисимасу и коллегами [41,42].Вкратце, все плазмиды-мишени были сконструированы путем вставки последовательности ДНК, содержащей целевой сайт из 20 нуклеотидов и соседний PAM, в сайты BamH I/ EcoR I плазмиды pUC19. Целевые плазмиды линеаризовали с помощью Ssp I, и линеаризованные продукты использовали в качестве ДНК-субстратов для анализа расщепления. Всего 200 нМ xCas9 и 400 нМ sgRNA инкубировали в буфере CutSmart (New England Biolabs, Ipswich, MA) при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем в смесь добавляли 5 нМ (конечная концентрация) линеаризованной целевой плазмиды и реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин.В указанные моменты времени отбирали аликвоты (10 мкл) и реакции останавливали добавлением 25 мМ ЭДТА. После обработки 10 мкг протеиназы К при комнатной температуре в течение 30 мин продукты расщепления анализировали на 1% агарозном геле. Разделенные продукты окрашивали красителем 4S red plus (Sangon, Шанхай, Китай) и визуализировали с помощью системы ChemiDoc MP (Bio-Rad, Hercules, CA).
Анализ редактирования оснований цитозина в
K . pneumoniaeГен xCas9 и остов pBECKP [49] были амплифицированы методом ПЦР соответственно.Они были собраны вместе с помощью сборки Гибсона [53] с образованием плазмиды pBECKP-xCas9. Успех конструирования плазмиды pBECKP-xCas9 был подтвержден с помощью ПЦР, расщепления ферментами и секвенирования. Точечные мутации вводили в xCas9 с помощью сайт-направленного мутагенеза и подтверждали секвенированием ДНК.
Плазмиды для редактирования оснований цитозина были сконструированы путем вставки спейсеров в сайты Bsa I плазмид pBECKP и pBECKP-xCas9 с использованием сборки Golden Gate [54]. Сконструированные плазмиды для редактирования электропорировали в K .Штамм pneumoniae КП_1.6366 с параметрами 1800 В, 200 Ом и 25 мкФ (кювета 1 мм). Клетки высевали на пластину с агаром LB, содержащую 50 мкг/мл канамицина. После инкубации в течение ночи при 30°C все колонии собирали с планшета и применяли для выделения генома с использованием набора для очистки геномной ДНК бактерий на колонке Ezup (Sangon, Шанхай, Китай). Продукты ПЦР, охватывающие сайты редактирования, были отправлены для секвенирования по Сэнгеру, а эффективность редактирования была количественно оценена с использованием программного обеспечения EditR [50].
Вспомогательная информация
S1 Fig
Анализы расщепления in vitro xCas9 и WT SpCas9 с использованием линеаризованных плазмид, содержащих целевую последовательность, примыкающую к CGT, AGT, AGA и CGC PAM.PAM, смежный мотив протоспейсера; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
(TIF)
S2 Рис.
Структурное наложение xCas9 (CGG PAM) и WT SpCas9 (TGG PAM, PDB_ID: 4UN3).xCas9 окрашен в оранжевый цвет, а WT SpCas9 окрашен в бело-серый цвет.PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
(TIF)
S3 Рис.
Положения семи мутировавших аминокислот в SpCas9 (PDB_ID: 4UN3).(A) Подробное расположение шести аминокислотных замен в доле REC. (B) Положение E1219 и его взаимодействие с остатком узнавания PAM R1335. PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; доля REC, доля узнавания α-спирали; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9.S4 Рис.
SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9; WT, дикий тип.
(TIF)
S5 Рис.
Структурное сравнение доли REC xCas9/TGC, связанной гетеродуплексом РНК/ДНК, с долей xCas9/GAT (PDB_ID: 6AEG).Доля REC, α-спиральная доля распознавания.
(TIF)
S6 Рис.
Структурное наложение сайтов узнавания PAM TGG PAM-связанного SpCas9 с TGC, GAT и AAG PAM-связанным xCas9.PAM, смежный мотив протоспейсера; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9.
(TIF)
S1 Таблица
Сбор данных, фазирование и уточнение статистики структур xCas9 и SpCas9 в комплексе с различными PAM.PAM, смежный мотив протоспейсера; SpCas9, Streptococcus pyogenes Cas9.
(DOCX)
Таблица S2
Последовательности нуклеиновых кислот, использованные в этом исследовании.(DOCX)
Данные S1
Файл Excel, содержащий данные об эффективности числового редактирования для рис.(XLSX)
Необработанные изображения S1
Исходные изображения агарозных гелей, показанные на рис. Шанхайскому национальному центру белковых наук Шанхайскому центру синхротронного излучения за помощь в сборе данных.Сокращения
CRISPR | Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы | ||
crRNA | CRISPR РНК | ||
СТД | С-концевой домен | ||
HNH | HNH подобные нуклеазы | ||
HRV3C | людей риновирусы 3C | ||
NFPS | Национального фонд для Protein Science Shanghai | ||
нта | нуклеотид | ||
NUC кулачки | нуклеазы лопасть | ||
PAM | protospacer смежного мотива | ||
Rec Lobe | α-спиральный признание доля | ||
RMSD | RMSD | RUVC | |
RUVC | RUVC-ALOC | ||
SGRA | Одноразовая РНК | ||
SpCas9 | Стрептококк TOCOCCUS PYOGOGES CAS9 | CAS9||
TRACRRNA | TRACRRNA | TRACRRNA | WT |
WT | Дикий тип |
Заявление о финансировании
Эта работа была финансово подтверждена Национальным фактором естествознания Китая (21922705, 91753127, 31700123 к Q.Цзи и 21
6 В. Чену), Шанхайский комитет по науке и технологиям Китая (19QA1406000, 17ZR1449200 В. Цзи) и Шанхайская парусная программа (18YF1416500 В. Чену). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Доступность данных
Атомные координаты xCas9 и SpCas9 в комплексе с различными PAM были депонированы в Банк данных белков RCSB (www.wwpdb.org) под кодами доступа: 6K4P (xCas9/TGG), 6K4Q (xCas9 /CGG), 6K4S (xCas9/TGC), 6K4U (xCas9/TGA), 6K3Z (SpCas9/TGA) и 6K57 (SpCas9/CGA).
Ссылки
1. Labrie SJ, Samson JE, Moineau S. Механизмы устойчивости к бактериофагам. Nat Rev Microbiol. 2010 г.; 8(5):317–27. 10.1038/нрмикро2315 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2. Сорек Р., Лоуренс С.М., Виденхефт Б. CRISPR-опосредованные адаптивные иммунные системы у бактерий и архей. Анну Рев Биохим. 2013; 82: 237–66. 10.1146/annurev-biochem-072911-172315 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Марраффини Л.А. Иммунитет CRISPR-Cas у прокариот. Природа. 2015;526(7571):55–61. 10.1038/природа15386 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4.Моханраджу П., Макарова К.С., Зетше Б., Чжан Ф., Кунин Э.В., ван дер Ост Дж. Различные эволюционные корни и механистические вариации систем CRISPR-Cas. Наука. 2016;353(6299):aad5147 10.1126/наука.aad5147 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Хорват П., Баррангоу Р. CRISPR/Cas, иммунная система бактерий и архей. Наука. 2010;327(5962):167–70. 10.1126/наука.1179555 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Баррангу Р., Дудна Дж.А. Применение технологий CRISPR в исследованиях и за их пределами.Нац биотехнолог. 2016;34(9):933–41. 10.1038/нбт.3659 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7. Джинек М., Чилински К., Фонфара И., Хауэр М., Дудна Дж. А., Шарпантье Э. Программируемая ДНК-эндонуклеаза с двойной РНК-управляемой в адаптивном бактериальном иммунитете. Наука. 2012;337(6096):816–21. 10.1126/наука.1225829 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Конг Л., Ран Ф.А., Кокс Д., Лин С., Барретто Р., Хабиб Н. и др. Мультиплексная инженерия генома с использованием систем CRISPR/Cas. Наука. 2013;339(6121):819–23. 10.1126/наука.1231143 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9. Виденхефт Б., Штернберг С.Х., Дудна Дж.А. Системы генетического молчания, управляемые РНК, у бактерий и архей. Природа. 2012;482(7385):331–8. 10.1038/природа10886 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Андерс С., Нивёнер О., Дюрст А., Джинек М. Структурная основа PAM-зависимого распознавания ДНК-мишени эндонуклеазой Cas9. Природа. 2014;513(7519):569–73. 10.1038/природа13579 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]11.Мали П., Ян Л., Эсвелт К.М., Аах Дж., Гуэлл М., ДиКарло Дж.Е. и др. Инженерия генома человека с помощью РНК с помощью Cas9. Наука. 2013;339(6121):823–6. 10.1126/науч.1232033 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]12. Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф., Марраффини Л.А. Редактирование бактериальных геномов под контролем РНК с использованием систем CRISPR-Cas. Нац биотехнолог. 2013;31(3):233–9. 10.1038/нбт.2508 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, et al.Эффективное редактирование генома у рыбок данио с использованием системы CRISPR-Cas. Нац биотехнолог. 2013;31(3):227–9. 10.1038/нбт.2501 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]14. Райан О.В., Кейт Дж. Х. Мультиплексная инженерия геномов промышленных дрожжей с использованием CRISPRm. Методы Энзимол. 2014;546:473 10.1016/В978-0-12-801185-0.00023-4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Chen W, Zhang Y, Zhang Y, Pi Y, Gu T, Song L и др. Редактирование генома на основе CRISPR/Cas9 у видов Pseudomonas aeruginosa и опосредованное цитидиндезаминазой редактирование оснований у видов Pseudomonas .iНаука. 2018;6:222–31. 10.1016/j.isci.2018.07.024 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]16. Chen W, Zhang Y, Yeo WS, Bae T, Ji Q. Быстрое и эффективное редактирование генома Staphylococcus aureus с использованием разработанной системы CRISPR/Cas9. J Am Chem Soc. 2017;139(10):3790–5. 10.1021/jacs.6b13317 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Jinek M, Jiang F, Taylor DW, Sternberg SH, Kaya E, Ma E, et al. Структуры эндонуклеаз Cas9 обнаруживают РНК-опосредованную конформационную активацию.Наука. 2014;343(6176):1247997 10.1126/наука.1247997 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Цзян Ф., Чжоу К., Ма Л., Грессель С., Дудна Дж.А. Комплекс Cas9-направляющая РНК, предварительно организованный для распознавания ДНК-мишени. Наука. 2015;348(6242):1477–81. 10.1126/наука.aab1452 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, Konermann S, Shehata SI, Dohmae N, et al. Кристаллическая структура Cas9 в комплексе с направляющей РНК и ДНК-мишенью. Клетка. 2014;156(5):935–49. 10.1016/Дж.сот.2014.02.001 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Цзян Ф., Дудна Дж.А. Структуры и механизмы CRISPR-Cas9. Анну Рев Биофиз. 2017;46:505–29. 10.1146/annurev-biophys-062215-010822 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Maeder ML, Linder SJ, Cascio VM, Fu Y, Ho QH, Joung JK. CRISPR РНК-управляемая активация эндогенных генов человека. Нат Методы. 2013;10(10):977–9. 10.1038/н-мет.2598 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24. Комор А.С., Ким Ю.Б., Пакер М.С., Зурис Дж.А., Лю Д.Р.Программируемое редактирование целевого основания в геномной ДНК без расщепления двухцепочечной ДНК. Природа. 2016;533(7603):420–4. 10.1038/природа17946 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]25. Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, et al. Программируемое редактирование оснований A•T в G•C в геномной ДНК без расщепления ДНК. Природа. 2017; 551(7681):464–71. 10.1038/природа24644 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]26. Чен Б., Гилберт Л.А., Чимини Б.А., Шницбауэр Дж., Чжан В., Ли Г.В. и др.Динамическая визуализация геномных локусов в живых клетках человека с помощью оптимизированной системы CRISPR/Cas. Клетка. 2013;155(7):1479–91. 10.1016/j.cell.2013.12.001 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Штернберг С.Х., Реддинг С., Джинек М., Грин Э.К., Дудна Дж.А. Анализ ДНК с помощью CRISPR РНК-управляемой эндонуклеазы Cas9. Природа. 2014;507(7490):62–7. 10.1038/природа13011 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, et al. Высокочастотный нецелевой мутагенез, индуцированный нуклеазами CRISPR-Cas в клетках человека.Нац биотехнолог. 2013;31(9):822–6. 10.1038/нбт.2623 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]29. Ран Ф.А., Конг Л., Ян В.С., Скотт Д.А., Гутенберг Дж.С., Криз А.Дж. и др. Редактирование генома in vivo с использованием Staphylococcus aureus Cas9. Природа. 2015; 520(7546):186–91. 10.1038/природа14299 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]30. Nishimasu H, Cong L, Yan WX, Ran FA, Zetsche B, Li Y и другие. Кристаллическая структура Staphylococcus aureus Cas9. Клетка. 2015;162(5):1113–26.10.1016/j.cell.2015.08.007 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Lee CM, Cradick TJ, Bao G. Система Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 обеспечивает специфическое редактирование генома в клетках млекопитающих. Мол Тер. 2016;24(3):645–54. 10.1038/т.2016.8 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]32. Hou Z, Zhang Y, Propson NE, Howden SE, Chu LF, Sontheimer EJ и др. Эффективная инженерия генома в плюрипотентных стволовых клетках человека с использованием Cas9 из Neisseria meningitidis .Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(39):15644–9. 10.1073/пнас.1313587110 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33. Hirano H, Gootenberg JS, Horii T, Abudayyeh OO, Kimura M, Hsu PD, et al. Структура и разработка Francisella novicida Cas9. Клетка. 2016;164(5):950–61. 10.1016/j.cell.2016.01.039 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]34. Kim E, Koo T, Park SW, Kim D, Kim K, Cho HY и др. Редактирование генома in vivo с использованием небольшого ортолога Cas9, полученного из Campylobacter jejuni .Нац коммун. 2017;8:14500 10.1038/ncomms14500 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]35. Ямада М., Ватанабэ Ю., Гутенберг Дж. С., Хирано Х., Ран Ф. А., Накане Т. и др. Кристаллическая структура минимального Cas9 из Campylobacter jejuni демонстрирует молекулярное разнообразие систем CRISPR-Cas9. Мол Ячейка. 2017;65(6):1109–21.e3. 10.1016/ж.молцель.2017.02.007 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, et al.Cpf1 представляет собой одиночную РНК-управляемую эндонуклеазу системы CRISPR-Cas класса 2. Клетка. 2015;163(3):759–71. 10.1016/j.cell.2015.09.038 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]37. Yamano T, Nishimasu H, Zetsche B, Hirano H, Slaymaker IM, Li Y и другие. Кристаллическая структура Cpf1 в комплексе с направляющей РНК и ДНК-мишенью. Клетка. 2016;165(4):949–62. 10.1016/j.cell.2016.04.003 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]38. Ямано Т., Зетше Б., Ишитани Р., Чжан Ф., Нисимасу Х., Нуреки О.Структурная основа для распознавания канонических и неканонических PAM с помощью CRISPR-Cpf1. Мол Ячейка. 2017;67(4):633–45.e3. 10.1016/j.molcel.2017.06.035 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]39. Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, et al. Сконструированы нуклеазы CRISPR-Cas9 с измененной специфичностью PAM. Природа. 2015; 523(7561):481–5. 10.1038/природа14592 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40. Хирано С., Нисимасу Х., Ишитани Р., Нуреки О. Структурная основа измененных особенностей PAM сконструированного CRISPR-Cas9.Мол Ячейка. 2016;61(6):886–94. 10.1016/ж.молцель.2016.02.018 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]41. Андерс С., Баргстен К., Джинек М. Структурная пластичность распознавания PAM модифицированными вариантами РНК-управляемой эндонуклеазы Cas9. Мол Ячейка. 2016;61(6):895–902. 10.1016/j.molcel.2016.02.020 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42. Нисимасу Х., Ши Х., Исигуро С., Гао Л., Хирано С., Окадзаки С. и др. Сконструированная нуклеаза CRISPR-Cas9 с расширенным пространством нацеливания. Наука. 2018;361(6408):1259–62.10.1126/наука.aas9129 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Slaymaker IM, Gao L, Zetsche B, Scott DA, Yan WX, Zhang F. Рационально сконструированные нуклеазы Cas9 с повышенной специфичностью. Наука. 2016;351(6268):84–8. 10.1126/наука.aad5227 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Kleinstiver BP, Pattanayak V, Prew MS, Tsai SQ, Nguyen NT, Zheng Z, et al. Высокоточные нуклеазы CRISPR-Cas9 без обнаруживаемых нецелевых эффектов в масштабах всего генома. Природа. 2016; 529(7587):490–5.10.1038/природа16526 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Chen JS, Dagdas YS, Kleinstiver BP, Welch MM, Sousa AA, Harrington LB, et al. Усовершенствованная корректура определяет точность нацеливания CRISPR-Cas9. Природа. 2017; 550(7676):407–10. 10.1038/природа24268 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Казини А., Оливьери М., Петрис Г., Монтанья С., Регинато Г., Мауле Г. и др. Высокоспецифичный вариант SpCas9 идентифицируют с помощью скрининга in vivo на дрожжах. Нац биотехнолог. 2018;36(3):265–71.10.1038/нбт.4066 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Hu JH, Miller SM, Geurts MH, Tang W, Chen L, Sun N, et al. Разработанные варианты Cas9 с широкой совместимостью с PAM и высокой специфичностью ДНК. Природа. 2018;556(7699):57–63. 10.1038/природа26155 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48. Guo M, Ren K, Zhu Y, Tang Z, Wang Y, Zhang B и др. Структурное понимание высокоточного варианта SpCas9. Сотовый рез. 2019;29(3):183–92. 10.1038/с41422-018-0131-6 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49.Ван И, Ван С, Чен В, Сонг Л, Чжан И, Шен З и др. CRISPR-Cas9 и цитидиндезаминаза с поддержкой CRISPR обеспечивают точное и эффективное редактирование генома у Klebsiella pneumoniae . Appl Environ Microbiol. 2018;84(23):e01834–18. 10.1128/АЭМ.01834-18 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Kluesner MG, Nedveck DA, Lahr WS, Garbe JR, Abrahante JE, Webber BR, et al. EditR: метод количественной оценки базового редактирования на основе секвенирования по Сэнгеру. Журнал CRISPR. 2018; 1: 239–50. 10.1089/крист.2018.0014 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Палермо Г., Чен Дж. С., Риччи К. Г., Ривальта И., Джинек М., Батиста В. С. и др. Ключевая роль доли REC во время активации CRISPR-Cas9 путем «восприятия», «регуляции» и «запирания» каталитического домена HNH. Q Rev Biophys. 2018;51. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]52. Sung K, Park J, Kim Y, Lee NK, Kim SK. Целевая специфичность нуклеазы Cas9 посредством перестройки ДНК, регулируемой доменом REC2. J Am Chem Soc. 2018;140(25):7778–81. 10.1021/jacs.8b03102 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, 3 rd , Smith HO. Ферментативная сборка молекул ДНК размером до нескольких сотен тысяч оснований. Нат Методы. 2009;6(5):343–5. 10.1038/н-мет.1318 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]54. Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S. Перетасовка золотых ворот: метод перетасовки ДНК в одном горшке, основанный на ферментах рестрикции типа Iis. ПЛОС ОДИН. 2009;4(5):e5553 10.1371/journal.pone.0005553 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Vacuum Tubes http://www.вакуумная трубка-shop.com/ Электронные лампы …
Список вакуумных ламп www.вакуумные—трубки—магазин. com 1/53 Вакуумные трубки http://www.вакуумные strong>-трубка—магазин.com/ Электрон Лампы Электрон Клапаны 17 января 2010 г. Цены, технические характеристики и изображения могут быть изменены без предварительного уведомления . Не несет ответственности за типографские или иллюстративные ошибки. Некоторые тюбики очень редки и вскоре могут исчезнуть навсегда. Пожалуйста, загрузите последний список перед заказом. Контактное лицо: Winlab Oy Информация о банковском переводе: Tornitaso 1 As 46 Имя: Länsi-Suomen Osuuspankki FIN — 02120 Espoo Account: 570081-2163717 IBAN, Финляндия: IBAN FI47 5700 8120 1637 17 Электронная почта: Sales@Vacuum-Tube -Магазин.com SWIFT: OKOYFIHH Факс: +358 — 2 — 538 7363 Тип Эквивалент или Производитель Страна Комментарий Цена Продана Фото аналогичного клапана Euro Out 36 USA Всего один. 39 44 США Только один. 41 VT48 12.50 42 VT63 Только один. 15.00 43 США Всего несколько. 56 VT56, 76 Sylvania USA Тип 56 имеет напряжение нагревателя 2,5 В. В противном случае это почти эквивалентно 24,50 X 76. Мы можем поставить розетки (цена запроса). 57 USA Только один 58 6D6 USA 6D6 эквивалентен трубе с восьмеричным основанием. 59 47 47 имеет другую основу.15.00 61BT CV1979 Только один. 61SPT Всего один. 75 VT75 Только один. 76 56 RCA USA Тип 76 имеет напряжение нагревателя 6,3 В. 31.00 77 VT77 RCA USA Всего несколько. 19.00 78 VT78 Разное США Всего несколько. 19.00 78E VT78 USA Только один. 19.00 79 Разное США Немного. 27.00 80 VT80, 5Y3GT Sylvania USA 1945. Всего несколько штук. 5Y3GT — эквивалентная трубка с восьмеричным основанием. 54.50 83 VT83, 5V4GT Haltron 5V4GT — эквивалентная лампа с восьмеричным основанием. 30.00 X 83 VT83, 5V4GT RCA USA 5V4GT — эквивалентная лампа с восьмеричным цоколем.55.00 84 VT84, 6Z4 Только один. 89 США Только один. 203A Amperex Только один. 243 Всего один. 300В 4300В Светлана Россия Возможна поставка розеток (цену уточняйте). Немного. 95.00 300B 4300B JJ Словакия Можем поставить розетки (цену спрашивайте). 115.00 300B 4300B Billington Gold Китай Специальное издание. 12 месяцев гарантии. Поставляется парами с сертификатом испытаний без дополнительной оплаты. 218,00 евро за пару. 109.00 307A Кенрад США Только один. х 320 Только один. 367 CV2634 Philips Holland 2- выпрямитель, Ia=3,0А. 46.00 x 371B CV3511 Certron USA Высоковольтный выпрямитель, Ia = 300 мА 54,00 X 371B CV3511 Electronic- USA Высоковольтный выпрямитель, Ia = 300 мА 54,00 X Enterprises 371B CV3511 United USA Высоковольтный выпрямитель, Ia = 300 мА 54,00 A 5 X 396 , 2C51, 6N3P-EV Ericsson Sweden Medium-Mu, низкий уровень микрофона и отличный звук, двойной триод. 1950-е, геттер гало. 396A 5670, 2C51, 6N3P-Tungsol USA Medium-Mu, низкий уровень микрофона и отличный звук, двойной триод 41.00 EV. 404A 5847 Ericsson Швеция Аудио пентод с низким уровнем шума.Золотые булавки. Практически эквивалентен E180F. 24.00 45.00 408A 6028 Western-Electric USA Western Electric classic AF — RF пентодный вентиль с резкой отсечкой.